Nghiên cứu tạo chủng escherichia coli tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp b carotene

TRÍCH YẾU LUẬN VĂNTên tác giả: Nguyễn Thị Hà Tên luận văn: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp có khả năng sinh tổnghợp β-carotene Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiêncứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Dương Văn Cường và TS Nguyễn Xuân Cảnh đã tận tình hướng dẫn,dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập vàthực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn công nghệ vi sinh, Khoa công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam

đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ bộ môn Sinh học phân tử vàcông nghệ Gene, Viện Khoa học sự sống - Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ

và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điềukiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luậnvăn./

Hà Nội, ngày tháng năm 2016

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hà

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn

ii Mục lục

iii Danh mục từ viết tắt v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract xi Phần 1 Mở đầu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

2 1.3 Ý nghĩa của đề tài

2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học

2 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.1 Khái quát về sắc tố β-carotene 4

2.1.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa

4 2.1.2 Vai trò của β-carotene con người 4

2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene

9 2.1.4 Các nguồn cung cấp β-carotene

14 2.1.5 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiên 18

2.2 Vi khuẩn E coli và các hệ vector biểu hiện trong sản xuất protein tái tổ hợp 19

2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn E coli trong sản xuất protein tái tổ hợp 19

2.4 Tình hình trong và ngoài nước 24 2.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 24 2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 25

Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 27

3.1 Vật liệu nghiên cứu 27

3.1.1 Vi khuẩn 27

3.1.2 Vật liệu 27

3.1.3 Hóa chất 30

3.1.4 Dụng cụ 31

3.1.5 Thiết bị 31

3.1.6 Phạm vi nghiên cứu 32

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 32

3.3 Nội dung nghiên cứu 33

3.4 Phương pháp nghiên cứu 34

3.4.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 34

3.4.2 Phương pháp PCR 35

3.4.3 Phương pháp điện di DNA trong gel agarose 36

3.4.4 Phương pháp lập bản đồ giới hạn 37

3.4.5 Phương pháp thu nhận DNA từ gel agarose 37

3.4.6 Phương pháp gắn đoạn gen mong muốn lên vector biểu hiện 38

3.4.7 Phương pháp chuẩn bị tế bào E coli khả biến 38

3.4.8 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến bằng sốc nhiệt 39

3.4.9 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 39

Phần 4 Kết quả và thảo luận 41

4.1 Tách dòng gene crtB từ vi khuẩn Pantoea ananatis 41

4.1.1 Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn Pantoea ananatis 41

4.1.2 Kết quả nhân gene crtB bằng phương pháp PCR 41

4.1.3 Kết quả gắn nối đoạn gene crtB vào vector tách dòng 42

4.2 Thiết kế vector biểu hiện chứa 5 gene mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp β-carotene 46

4.3 Kết quả cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánh giá sơ bộ mức độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào 48

Phần 5 Kết luận và kiến nghị 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Kiến nghị 50

Tài liệu tham khảo 51

DNA : Deoxyribonucleic Acid

E coli : Escherichia coli

EDTA : Etilendiamin tetra axetic acid

IPTG : Isopropyl Thiogalactoside

RNS : Reactive Nitrogen Species

IPP : Isopentenyl pyrophosphate

DMAPP : Dimethylallyl pyrophosphate

MAV : Mevalonate

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng carotenoid có trong thực vật 14

Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi crtB 27

Bảng 3.2 Các thành phần của vector pRSET-A 28

Bảng 3.3 Danh mục các thiết bị sử dụng trong đề tài 32

Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR 35

Bảng 3.5 Thành phần phản ứng gắn nối 38

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của β-carotene 4

Hình 2.2 Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A 6

Hình 2.3 Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010 và dự kiến đến năm 2018 9

Hình 2.4 Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MAV 10

Hình 2.5 Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MEP 11

Hình 2.6 Quá trình sinh tổng hợp carotenoids từ IPP và DMAPP 12

Hình 2.7 Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene 13

Hình 2.8 Tổng hợp β-carotene từ lycopene 13

Hình 2.9 Sơ đồ tổng hợp β-carotene của BASF 16

Hình 2.10 Sơ đồ tổng hợp β-carotene của Roche 17

Hình 2.11 Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter 20

Hình 2.12 Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pRSET 21

Hình 2.13 Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pET 22

Hình 2.14 Tương tác giữa protein tái tổ hợp chứa 6xHis và giá thể Niken 22

Hình 2.15 Quá trình chuyển hóa β-carotene dưới sự tham gia các gene Crt 23

Hình 3.1 Cấu trúc vector biểu hiện pRSET 28

Hình 3.2 Cấu trúc vector tách dòng 29

Hình 3.3 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 36

Hình 4.1 Hình ảnh tách chiết DNA tổng số của P ananatis 41

Hình 4.2 Kết quả khuếch đại gene crtB của vi khuẩn P ananatis 42

Hình 4.3 Kết quả biến nạp vào tế bào E coli DH5α 43

Hình 4.4 Kết quả điện di plasmid của các dòng khuẩn lạc đã chọn 43

Hình 4.5 Kết quả chọn lọc các dòng bằng cắt với enzyme EcoRI và KpnI 44

Hình 4.6 Kết quả giải trình tự (A) và dịch mã insilico gene crtB (B) 45

Hình 4.7 Kết quả điện di kiểm tra các dòng plasmid pR-iEIBY 46

Hình 4.8 Sản phẩm cắt vector pRSET-iEIBY với EcoRI và NcoI 47

Hình 4.9 Kết quả biểu hiện của 5 gene idi, crtE, crtI, crtB và crtY nằm trên vector pRSET-A trong E coli BL21(DE3) 49

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Tên tác giả: Nguyễn Thị Hà

Tên luận văn: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp có khả năng sinh tổnghợp β-carotene

Ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60.42.02.01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam

β-carotene thuộc nhóm carotenoid, có sắc tố vàng hoặc da cam, được tổng hợp tựnhiên trong một số loài thực vật như cà rốt, khoai lang, đậu hà lan (Desobry et al.,1998) β-carotene còn được gọi là provitamin A, là tiền chất để tổng hợp vitamin A –một loại vitamin rất cần thiết cho mắt (Lampert et al., 2003; Stutz et al., 2015) Cũnggiống như các carotenoid khác, β-carotene là chất chống oxy hoá sinh học, bảo vệ tế bào

và mô khỏi tác hại của gốc tự do, vì vậy có tác dụng ngăn ngừa bệnh ung thư (Britton1995) Một tác dụng khác của β-carotene là giảm thiểu các bệnh về tim mạch – mộtnguyên nhân gây tử vong hàng đầu ở người Mặc dù có vai trò quan trọng trong bảo vệsức khoẻ, song bản thân cơ thể con người lại không tự tổng hợp được β-carotene màphải đưa vào nhờ thực phẩm Và cũng nhờ những tác dụng hữu ích của β-carotene nênnhu cầu sử dụng chất này trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm ngàycàng cao (Mata-Gómez et al., 2014) Thị trường của β-carotene trong năm 2010 là 261triệu USD và dự tính đến 2018 sẽ đạt 334 triệu USD (BCC 2011)

Tổng hợp β-carotene thường theo hai phương pháp chính là tách chiết từ cácnguồn tự nhiên hoặc tổng hợp hoá học (Ribeiro et al., 2011; Vachali et al., 2012).Những phương pháp này đều có những nhược điểm nhất định Tổng hợp hoá học tạo rachất thải ô nhiễm, sản phẩm có hoạt tính sinh học thấp hơn β-carotene tự nhiên dokhông có các đồng phân α-carotene và γ-carotene (Voutilainen et al., 2006; Baky andEl-Baroty, 2013) Trong khi đó β-carotene tách chiết từ các nguồn tự nhiên sẽ cho hàmlượng không nhiều và phụ thuộc vào nguồn cung vật liệu có chứa β-carotene

Nhằm góp phần khắc phục những yếu điểm của các phương pháp nói trên, hướngnghiên cứu sử dụng kỹ thuật di truyền tạo ra các chủng E coli tái tổ hợp có khả năngsản xuất β-carotene đang là một hướng đi được quan tâm E coli tự nhiên không tổnghợp được provitamin β-carotene vì không có các enzyme chuyển hóa từ DMAPP đếnchất này Gene idi mặc dù có trong hệ gene của E coli nhưng cũng cần được đưa vàovector biểu hiện để tăng cường mức độ biểu hiện, từ đó giúp cân bằng nguồn cơ chấtIPP và DMAPP Đã có một số nghiên cứu sinh tổng hợp carotenoid nói chung và β-

vào thực tiễn sản xuất vẫn cần được tối ưu hơn nữa (Kirby and Keasling

2009)

Mục tiêu của nghiên cứu này là thiết kế vector biểu hiện pRSET-iEIBY mangcác gene idi, crtI, crtB, crtE và crtY mã hoá cho các enzyme xúc tác quá trình tổng hợpβ-carotene trong vi khuẩn E coli Vector pRSET-iEI đã được tạo ra trước đó bằng việcgắn 3 gene idi, crtI và crtE vào vector biểu hiện pRSET-A Gene crtB được tách dòng

và xác định trình tự trước khi gắn vào vector pRSET-iEI để tạo thành pRSET-iEIB.Gene crtY được cắt ra từ vector pLUG-Y và gắn vào pRSET-iEIB để tạo vector biểuhiện pRSET-iEIBY

Phương pháp thí nghiệm

Vi khuẩn P ananatis được nuôi tăng sinh khối và tách DNA tổng số, làm nguyênliệu để khuếch đại đoạn gene crtB bằng cặp mồi đặc hiệu Đoạn gene crtB sau khi đượckhuếch đại thành công, thì được gắn nối vào vector tách dòng pLUG và chọn lọc cácdòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene crtB mong muốn

Sau khi sàng lọc được dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene crtB mong muốn,plasmid này lại được dùng làm nguyên liệu để thiết kế vector biểu hiện mang các gene

mã hóa sinh tổng hợp β-carotene Plasmid pLUG-B (là plasmid mang đoạn gen crtB) vàpR- iEIY (là vector biểu hiện pRSET đã được gắn thành công các gene idi, crtE, crtI vàcrtY đã được gắn thành công trước đó) Hai vector này được cắt đồng thời bằng haienzyme EcoRI và KpnI với mục đích thu đoạn gene crtB và cắt mở vòng vector biểuhiện Sau đó, sản phẩm đoạn gene crtB được cắt và vector được nối lại với nhau bằngenzyme gắn nối lygase Sản phẩm gắn nối tiếp theo lại sàng lọc và chọn lọc các dòng tái

tổ hợp mới

Sau khi chọn lọc được vector biểu hiện mang 5 gene mã hóa sinh tổng hợpβ-carotene, được biến nạp vào trong vi khuẩn E coli BL21 để cảm ứng biểu hiện sinhtổng hợp β-carotene

Sau quá trình thực hiện đề tài chúng tôi thu được 1 số kết quả như sau:

Kết quả thứ 1: Kết quả tách dòng gene crtB từ vi khuẩn P.ananatis

+ Vi khuẩn P ananatis được nuôi tăng sinh trên môi trường LB lỏng và được táchDNA tổng số Kết quả cho thấy đã tách chiết thành công DNA tổng số vi khuẩnP.ananatis, DNA tổng số có chất lượng tương đối tốt, ít bị đứt gãy

+ Tiếp theo tiến hành khuếch đại đoạn gene crtB Kết quả cho thấy sản phẩm PCRthu được có 1 băng kích thước xấp xỉ 1 kb tương đương với kích thước đoạn gene crtB

lý thuyết là 930 bp

Kết quả thứ 2: Thiết kế vector biểu hiện mang 5 gene mã hóa cho các enzymetham gia quá trình sinh tổng β-carotene

β-carotene chúng tôi sử dụng vector tách dòng pLUG-B (đã được tách dòng) và vectorbiểu hiện pR-iEIY là vector biểu hiện pRSET-A đã được gắn thành công 4 gene: idi,crtE, crtI, crtY trước đó.

Kết quả thứ 3: Kết quả cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánhgiá sơ bộ mức độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào

Sau khi gắn được 5 gene vào vector, biến nạp vector vào chủng vi khuẩn E coliBL21(DE3) và cảm ứng bằng IPTG, chúng tôi thu được dòng khuẩn lạc có màu vàngcam đặc trưng của β-carotene

KẾT LUẬN

Đã tách dòng thành công gene crtB có kích thước 930 bp từ vi khuẩn P.ananatis

có trình tự nucleotide trùng khớp với với trình tự gene crtB của vi khuẩn P ananatisLMG 20103 đã công bố trước đó trên ngân hàng gene NCBI với mã số CP001875.2

Đã thiết kế thành công vector pRSET-iEIBY mang policistrongồm 5 genes idi,crtE, crtI, crtB và crtY mã hoá cho các enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợpβ-carotene Cảm ứng biểu hiện tổ hợp gene trong E coli BL21(DE3) dưới sự điều khiểncủa promoter T7 thu được cặn khuẩn tế bào có màu da cam đặc trưng của β-carotene.Kết quả này là tiền đề cho các bước nghiên cứu tiếp theo bao gồm xác định hàm lượngβ-carotene tái tổ hợp bằng HPLC, thiết kế các hệ thống vector khác để so sánh tìm ra hệbiểu hiện có năng lực tối ưu

β-Major: Biotechnology Code: 60.42.02.01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture

(VNUA)

β-caroten belongs to carotenoid group that are pigmented yellow or orange,synthesized naturally in some plants such as carrots, sweet potatoes, peas (Desobry etal., 1998) β-carotene is also known as provitamin A, the precursor for the synthesis ofvitamin A - a vitamin essential for the eye (Lampert et al., 2003; Stutz et al., 2015).Like other carotenoids, β-carotene as biological antioxidants, protecting cells andtissues from the damaging effects of free radicals, so it works to prevent cancer (Britton,1995) One other effect of β-carotene is to reduce cardiovascular disease - a cause ofdeath in human beings Although there is a crucial role in health protection, but thehuman body itself is not able to synthesize β-carotene Therefore t β-carotene has beensupplied through food And also thanks to the effects of β-carotene, this material is nowincreasingly being used in the fields of food, cosmetics and pharmaceuticals (Mata-Gómez et al., 2014) β-carotene market in 2010 was USD 261 million and is projected

to reach 334 million in 2018 (BCC, 2011)

β-carotene synthesis usually following two main methods that is extracted fromnatural sources or synthetic chemicals (Ribeiro et al., 2011; Vachali et al., 2012) Thesemethods have certain disadvantages Synthetic chemicalsgenerate polluted waste,andtheir products have lower bioactive natural β-carotene in the absence of α-caroteneisomers and γ-carotene (Voutilainen et al., 2006; and El Baky Baroty, 2013).Meanwhile β-carotene extracted from natural sources is not enough and will dependsupplying materials containing β-carotene

In order to overcome the weaknesses of the above methods, the tendency ofresearch using genetically engineered research on E coli strains produce recombinant β-manufacturing capabilities is a β-carotene trend Natural E coli itself does notsynthesize β-carotene provitamin since no metabolic enzymes from DMAPP to thissubstance Although Idi gene is in in the genome of E coli but it also needs to be putinto the expression of vector to increase expression levels, thereby helping to balanceand DMAPP IPP carbon sources There have been some studies on the biosynthesis ofcarotenoids β-carotene in general and in particular to use of E coli as a host for the

potential development of industrial scale; however, to put into practice, the productionstill needs to be further optimization (Kirby and Keasling, 2009).

The objective of this study was to design the vector expression carrying the genes

of pRSET-iEIBY idi, crtI, crtB, crtE, and crtY coded for enzymes that catalyze thesynthesis of β-carotene in the bacteria of E coli.Vector pRSET-IEI was created earlier

by attaching 3 gene idi, crtI and crtE on pRSET-A expression vector CrtB genes werecloned and sequenced before mounting on pRSET-IEI vector to form pRSET-iEIB.Gene crtY was cut from the vector Y and plugged into pRSET-iEIB for creatingpRSET-iEIBY expression vector

Experimental methods

P ananatis was grown to increase biomass and separate DNA, as raw materialsfor the amplified segments of crtB gene using specific primers CrtB sequence asamplified successfully, and attached to the pLUG cloning vector and selectively plugthe recombinant plasmid carrying line segments of desired crtB gene

After screening recombinant plasmid carrying line gene segments of desired crtB,this plasmid was used as raw materials to design vector expression carrying theencoding gene of the β-carotene biosynthesis Plasmid pLUG-B (the plasmid carries thecrtBgene segment) and PR-iEIY (the expression vector that has been mountedsuccessfully pRSET genes as idi, crtE, crtI and crtY was mounted successfully before).Two vectors are cut simultaneously by two enzymes E.coRI and for the purpose ofcollecting KPN gene segments and cut open round crtB expression vector Then, thecrtB gene was cut and vector crtB could be joined together using enzymes bind lygase.The next joining product screens and selects another new recombinant strains

After selective expression vector carrying the gene encoding 5 β-carotenebiosynthesis, it was transformed into E coli BL21 to induce the expression ofβ-carotene biosynthesis

After the process of implement the project we obtained one of the followingresults:

Result No 1: Results of the crtB cloned genes from P.ananatis

+ P ananatis were cultured on LB liquid medium enrichment and DNA wasextracted total DNA The results shown the success of total P.ananatis DNA, DNA ofrelatively good quality, less prone to faults

+ Next we conduct crtB amplified gene segment Results show that our PCRproducts obtained with 1 band approximately 1 kb in size equivalent to the size crtBtheoretical sequences is 930 bp

Result No 2: Designing vector expression carrying the 5 encoding genes forenzymes involved in β-carotene biosynthesis.

To design the expression vector carrying the 5 encoding genesfor the β-carotenebiosynthesis, we use vector halftone-B plug (was prewarsly cloned) and PR-iEIYexpression vector is the pRSET vector expression that was successfully camping 4genes such as idi, crtE, crtI and crtY

Result No 3: 5 targeted genes expression induces β-carotene and creates apreliminary assessment of the level of expression by cell color residue

After binding 5 genes into the vector, the vector was transformed into E colistrain BL21 (DE3) and induced by IPTG, we obtain the lines of characterizedorangecolonies of β-carotene

CONCLUSIONGene CrtB was successfully cloned with the size of 930 bp from bacteriaP.ananatis that has nucleotide sequence with the crtB genetic sequence of the bacterium

P ananatis LMG 20103 that was depisited NCBI gene bank with the accession numberCP001875.2

Vector pRSET-iEIBY has successfully designed by the carries of these genesincluding idi policistron 5, crtE, crtI, crtB and crtY encoding for enzymes of catalyzedbiosynthetic path β-carotene The gene expression in E coli combination BL21 (DE3) isunder the control of the promoter T7 bacterial residue obtained orange cells of β-carotene characteristics This result is a prerequisite for the next research steps includingdetermining β-carotene content by HPLC and design of other vector systems to compareand find optimal capacity of expression system

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Carotenoid là một dạng sắc tố tự nhiên xuất hiện chủ yếu ở thực vật và cácloài sinh vật quang hợp khác như nấm, tảo và một vài loại vi khuẩn (Schmidt-Dannert, 2000) Chúng có vai trò hình thành màu sắc cho cây, che chắn ánh sáng(Vershinin, 1999) và có khả năng chống oxy hóa mạnh (Stahl and Sies, 2003)

Ngày nay có khoảng 600 loại carotenoid được tìm thấy và 40 loại trong số đó làcần thiết cho chế độ dinh dưỡng của con người (Rao and Rao, 2007)

β-carotene là sắc tố có màu vàng hoặc da cam, được tìm thấy ở một số loạicây như cà rốt, khoai lang, hay đậu hà lan (Desobry, Netto et al., 1998) Chúngđược biết đến như một tiền chất để tổng hợp vitamin A – một loại vitamin rất cầnthiết cho mắt (Lampert, Holzschuh et al., 2003; Stutz, Bresgen et al., 2015).Theo tổ chức WHO và FAO mỗi năm có hàng triệu trẻ em bị mắc các bệnh vềmắt mà nguyên nhân chủ yếu là thiếu provitamin A trong khẩu phần ăn (Harjes,Rocheford et al., 2008) Ở động vật, β-carotene được sử dụng trong suốt quátrình sinh trưởng, chúng tham gia vào các quá trình sinh lý, sinh sản, phát triểncấu trúc biểu bì, xương và tăng cường khả năng miễn dịch (Sklan, 1987) Nhiềunghiên cứu đã chỉ ra rằng β-carotene có tác dụng ngăn ngừa quá trình oxy hóabằng cách loại bỏ các gốc oxy tự do để bảo vệ tế bào và cơ thể, ngăn ngừa quátrình phát triển của tế bào ung thư và các bệnh tim mạch (Igielska-Kalwat,Goscianska et al., 2015)

Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng.Theo thống kê của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường cho carotenoidđạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm 2018.Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệu USD(chiếm 21,8%) trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là1,8% dự kiến đến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) Để đáp ứngnhu cầu đó β-carotene được sản xuất theo hai con đường chính: Một là conđường tổng hợp hóa học, hai là chiết xuất từ các nguồn có sẵn trong tự nhiên(Bernardo Dias Ribeiro, Daniel Weingart Barreto et al., 2011; Vachali, Bhosale

et al., 2012) Tuy nhiên, sản phẩm β-carotene tổng hợp hóa học chỉ có chứa 1

β-carotene mà còn có α-carotene và γ-carotene; do đó β-carotene tự nhiên có hoạttính sinh học cao hơn 10% so với tổng hợp hóa học (Voutilainen, Nurmi et al.,2006; Baky and El-Baroty 2013) Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tựnhiên cũng được ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cungβ-carotene tự nhiên có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng

và quản lý vùng nguyên liệu Vấn đề đặt ra là cần phải có phương pháp khác đểtạo nguồn cung β-carotene tự nhiên

Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ nói chung và công nghệsinh học nói riêng, việc ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp cùng với ứng dụngcác kĩ thuật di truyền đã giải quyết được các vấn đề nêu trên Các nghiên cứu vềtạo chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh ra các enzyme tham gia vào quá trìnhtổng hợp β-carotene đang gặt hái được những thành công nhất định Năm 1990,Misawa và cộng sự tạo chủng sinh vật có khả năng sinh tổng hợp carotene, thànhcông đầu tiên trên Zymomonas mobilis, Agrobacterium tumefaciens (Misawa,Yamano et al., 1991) và sau đó là trên Escherichia coli (Lee, Momen et al.,2003)

Hiện nay, việc sản xuất các hợp chất carotenoid ở Việt Nam vẫn còn mộtvấn đề mới, các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc tách chiết từ thực vật và phânlập các chủng vi sinh vật sản xuất β-carotene ở quy mô nhỏ Việc sử dụng cáchợp chất β-carotene ở Việt Nam chủ yếu do nhập khẩu từ nước ngoài với giáthành cao Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạochủng Escherichia coli tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp β-carotene”.1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

+ Mục tiêu 1: Tách dòng gene crtB mã hóa cho enzyme phytoenedesaturase từ vi khuẩn Pantoea ananatis

+ Mục tiêu 2: Thiết kế vector biểu hiện chứa 5 gene mã hóa cho cácenzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp β-carotene

+ Mục tiêu 3: Cảm ứng biểu hiện 5 gene đích tạo ra β-carotene và đánh giá

sơ bộ mức độ biểu hiện bằng màu sắc cặn tế bào

1.3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là tiền đề cho các nghiên cứu về biểu hiện β-carotenetrong E coli sau này

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sản phẩm của nghiên cứu mở ra hướng nghiên cứu ứng dụng sản xuất β-carotene mới, rút ngắn thời gian sản xuất đáp ứng nhu cầu thực tiễn

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 KHÁI QUÁT VỀ SẮC TỐ β-carotene

2.1.1 Cấu trúc và tính chất lý hóa

Carotenoid là nhóm sắc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các loàithực vật, chúng có màu vàng, da cam đến đỏ, bao gồm 65-70 sắc tố tự nhiên và làmột trong những hợp chất màu quan trọng nhất được sử dụng trong công nghiệpthực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm Carotenoid thường được chia làm hai nhóm:Thứ nhất là nhóm caroten hydrocacbon như là β-carotene, torulen và nhóm cònlại là xanthophyl bị oxy hóa như astaxanthin Hiện nay, nhóm caroteonid đangđược nghiên cứu rộng rãi, tiêu biểu trong đó phải kể đến β-carotene

Cấu trúc: β-carotene là một trong số hơn 600 loại caroteoid đã được tìnthấy trong tự nhiên Chúng là một dẫn xuất isoprene chưa bão hòa bao gồm 40nguyên tử cacbon và 56 nguyên tử hydro (C40H56) β-carotene có dạng tinh thểhình kim, trong cấu trúc có các nối đôi đơn xen kẽ tạo nên một chuỗi polyen(hình 2.1)

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của β-carotene

Tính chất lý hóa: β-carotene là hợp chất có màu vàng cam, tan tốt trongdầu và các dung môi hữu cơ như aceton, etyl-ete, metanol, nhưng lại không tantrong nước Nhờ có hệ thống nối đôi liên hợp dài mà β-carotene có ái lực mạnhvới oxy đơn bội nên dễ bị oxy hóa, đồng phân hóa khi tiếp xúc với không khí,ánh sáng hay nhiệt độ (Goodwin, 1980)

2.1.2 Vai trò của β-carotene đối với con người

2.1.2.1 Vai trò của β-carotene đối với sức khỏe con người

Hiện nay, β-carotene được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm nghiên cứubởi tác dụng hữu ích của nó đối với sức khỏe con người (Nagao, 2009) β-carotene được biết đến như tiền chất vitamin A rất cần thiết cho mắt (Lampert,Holzschuh

et al., 2003), bên cạnh đó chúng cũng có khả năng chống oxy hóa mạnh và ngănngừa một số bệnh ung thư.

Vai trò là chất chống oxy hóa

Gốc tự do là những phân tử bị thiếu hụt điện tích Các gốc tự do này thườngkhông cân bằng và rất dễ phản ứng Chúng luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử từcác phân tử khác, các phân tử bị mất điện tích sẽ lại trở thành những gốc tự domới Quá trình này được gọi là quá trính oxy hóa và gốc tự do đó được gọi làchất oxy hóa Chất oxy hóa tiêu biểu đến nay được phát hiện là ROS ROS là mộtsản phẩm phụ của quá trình hô hấp và trao đổi chất trong cơ thể, đồng thời ROScũng được kích thích sinh ra do các tác động của môi trường như tia UV hay tiếpxúc với nhiệt độ cao ROS tích lũy có thể gây tổn thương tế bào và các phân tửsinh học như DNA, protein (Adetayo O.Omoni and Aluko, 2005) Theo nhiềunghiên cứu đã chỉ ra ROS tích lũy trong tế bào và cơ chế quá mức là nguyênnhân gây ra các bệnh thoái hóa như Alzheimer, ung thư, Parkinson, các bệnhmãn tính, bệnh tim mạch Các chất chống oxy hóa là các chất giúp ngăn chặnhoặc làm chậm quá trình oxy hóa Chúng ngăn quá trình phá hủy này bằng cáchkhử đi các gốc tự do (Guerin, Huntley et al., 2003) Carotenoid đã được chứngminh là chất chống oxy hóa sinh học, bảo vệ tế bào và mô từ các tác hại của cácgốc tự do (Maiani, Caston et al., 2009) Trong carotenoid, β-carotene có hiệu quảtrong việc bảo vệ màng lipid của tế bào khỏi tác hại của các gốc tự do (Britton,1995), bên cạnh đó cùng với một số nhóm carotenoid khác như lycopene có khảnăng loại bỏ oxy tốt nhất, lutein và zeaxanthin có hiệu quả trong việc loại bỏ cácgốc tự do là tăng tính toàn vẹn của tế bào (Smith, 1998)

β-carotene là tiền chất vitamin A

β-carotene còn được biết đến với tên gọi là tiền chất vitamin A (Lampert,Holzschuh et al., 2003) Khi vào cơ thể, β-carotene bị phân cắt ở giữa mạchcacbon trung tâm tạo thành hai phân tử retinal bằng enzyme 15,15’dioxygenase(Biesalski, Chichili et al., 2007) Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzymethành retinol Retinol tạo thành có thể được hấp thu trực tiếp từ thức ăn vào thànhruột hay sẽ được vận chuyển nhờ liên kết với protein đến các cơ quan cần thiếthoặc đến gan là nơi tích lũy vitamin A dưới dạng retinyl este Khi cơ thể cần,retinyl este được thủy phân thành retinol tự do và acid hữu cơ trước khi được hấp

thụ Quá trình thủy phân này được enzyme dịch tụy xúc tác, axit hữu cơ tạo thànhthường là acid palmitat chiếm thành phần chủ yếu trong retinyl este thực phẩm.Quá trình chuyển hóa β-carotene thành vitamin A được kiểm soát chặt chẽ nênkhông tạo thành lượng dư thừa vitamin A có độc tính cao Con người và động vậtcần β-carotene trong suốt quá trình sinh trưởng của mình, song bản thân chúnglại không có khả năng tổng hợp được mà chủ yếu thu nhận qua con đường tiêuhóa (Fujisawa, Watanabe et al., 2008).

Hình 2.2 Sơ đồ chuyển hóa β-carotene thành vitamin A

Tăng cường thị giác

Trong máu phân tử vitamin A dưới dạng retinol sẽ chuyển hóa thành retinal Trong bóng tối, retinal kết hợp với protein opsin để tạo thành Rhodopsin– một sắc tố nhạy cảm với ánh sáng ở võng mạc mắt, giúp võng mạc nhận đượccác hình ảnh trong điều kiện thiếu sáng Sau đó, khi ra sáng Rhodopsin lại bị

phân hủy thành opsin và trans-retinal, rồi trans-retinal vào máu để trở lại retinol (Wolf, 2001) Bên cạnh đó, theo một số nghiên cứu đã chỉ ra rằngβ-carotene có khả năng làm chậm sự tiến triển của bệnh thoái hóa điểm vàng làmgiảm thiểu các nguy cơ mù lòa (Snodderly, 1995; Gordon and Schooff, 2002).Việc thiếu hụt vitamin A gây ra một loạt các thay đổi về sinh lý mà trong đó cơquan bị ảnh hưởng nhiều nhất là mắt Một trong những biểu hiện đầu tiên là sựsuy giảm thị lực, điển hình như là bệnh quáng gà (khả năng nhìn giảm mạnh khi

cis-độ chiếu sáng thấp) (Roncone, 2006)

Giảm thiểu các bệnh về tim mạch

Theo WHO, bệnh tim mạch đang là nguyên nhân tử vong hàng đầu ở ngườitrên toàn thế giới và chiếm nhiều nhất ở các nước đang phát triển Mỗi năm,người chết do bệnh tim và đột quỵ nhiều hơn cả ung thư, lao, sốt rét và HIV cộnglại (Moran, Forouzanfar et al., 2014) Năm 1990, số ca tử vong do các bệnh timmạch là 13,3 triệu ca chiếm 25,8%, đến năm 2013 con số này đã tăng lên 17,5triệu người chiếm 31,5% tổng số ca tử vong trên toàn thế giới (Mendis, Shanthi;

et al., 2014) Bệnh tim mạch bao gồm các bệnh suy tim, sơ vữa động mạch, độngmạch vành và nhồi máu cơ tim (GBD 2015) Bệnh tim mạch được hình thành do

sự tích lũy quá nhiều sản phẩm oxy hóa gây nên (Singh, Dhalla et al., 1995), đặcbiệt là quá trình oxy hóa lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) do ROS dẫn đến hìnhthành các mảng bám trên thành mạch gây sơ vữa thành mạch (Dhalla, Temsah etal., 2000) Tác động chính của β-carotene tới các bệnh tim mạch là chống lại quátrình oxy hóa, do β-carotene được vận chuyển trong các lipoprotein tỷ trọng thấpthông qua đó có thể trực tiếp ức chế quá trình oxy hóa của LDL (Reaven,Ferguson et al., 1994) Chính vì thế, các chuyên gia thường khuyến các sử dụngcác thực phẩm giàu carotene để phòng ngừa và chữa trị các bệnh về tim mạch

Ngăn ngừa bệnh ung thư

Oxy là yếu tố không thể thiếu đối với cuộc sống Khi các tế bào sử dụngoxy để tạo ra năng lượng, các sản phẩm phụ được tạo ra như là một hệ quả củaATP (adenosine triphosphate) sản xuất bởi các ty thể và lạp thể Những sản phẩmphụ thường là chất oxy hóa (ROS) và các nitơ phản ứng (RNS) ROS và RNSđóng một vai trò kép vừa có lợi, vừa có hại đối với có thể Ở mức độ thấp hoặctrung bình, ROS và RNS phát huy tác dụng có lợi trên các phản ứng của tế bào

và chức năng miễn dịch Ở nồng độ cao, chúng tạo ra sự căng thẳng oxy hóa có

thể làm hỏng tất cả các cấu trúc tế bào gây nên các sai hỏng (Young andWoodside, 2001; Lien Ai Pham-Huy, Hua He et al., 2008) Những đột biến nàythường xảy ra ở một tế bào hoặc một nhóm tế bào dẫn đến sự tăng lên khôngkiểm soát hình thành các khối U (Cooper GM, 1992) β-carotene tác động mạnh

mẽ vào tế bào ung thư do chúng điều khiển tăng trưởng của tế bào, điều hòa biểuhiện gene và tác động lên các tế bào miễn dịch, hạn chế các sai khác bất thườngdẫn tới sự phát triển không ngừng của tế bào ung thư β-carotene tác động vàoquá trình ung thư theo hai hướng: Một là chúng tác động vào quá trình oxy hóa tếbào do tính chất chống oxy hóa mạnh, hai là chúng tham gia vào quá trình biệthóa và phân chia tế bào (Heller, Descamps et al., 1998)

2.1.2.2 Ứng dụng của β-carotene trong công nghiệp

β-carotene có tính chống oxy hóa mạnh giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngănngừa bệnh ung thư, các bệnh tim mạch và các bệnh mãn tính khác chính vì vậychúng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm và dượcphẩm (Luis Carlos Mata-Gómez, Julio César Montanez et al., 2014) Trong đó,

có hai mảng ứng dụng lớn là màu thực phẩm và thực phẩm bổ sung Trong côngnghiệp dược phẩm, β-carotene được sản xuất dưới dạng dược chất, sử dụng bổsung ngoài chế độ ăn của con người Trong ngành công nghiệp mỹ phẩm, β-carotene được thêm vào với tác dụng bảo vệ da chống lại tác hại của UV (DelCampo, Moreno et al., 2000) Trong lĩnh vực màu thực phẩm, do có khả năngmang màu sắc nên β-carotene được sử dụng là chất bổ sung màu cho các thựcphẩm tự nhiên như lòng đỏ trứng gà, thịt gà, cá Đồng thời bên cạnh các thuộctính màu sắc, β-carotene còn có tác dụng bảo quản thực phẩm, là nguồn cung cấpchất chống oxy hóa cho thực phẩm Ngoài ra, sử dụng β-carotene từ nguồn vi tảo

có thể tận dụng lượng chất khoáng có trong vi tảo để kích thích quá trình đồnghóa trong tế bào và cơ thể Việc sử dụng β-carotene làm màu thực phẩm ngàynay rất phổ biến và không gây độc hại cho sức khỏe

Trong những năm gần đây, nhu cầu sử dụng β-carotene ngày càng tăng.Theo báo cáo của công ty nghiên cứu thị trường BCC, thị trường dành chocarotenoid đạt 1,2 tỉ USD trong năm 2010 và có thể tăng lên 1,4 tỷ USD vào năm

2018 Trong đó, nhu cầu sử dụng β-carotene chiểm tỉ trọng cao nhất với 262 triệuUSD trong năm 2010; với mức tăng trưởng bình quân hằng năm là 1,8% dự kiếnđến năm 2018 sẽ tăng lên 334 triệu USD (BCC 2011) (hình 2.3)

Hình 2.3 Biểu đồ khảo sát thị trường carotenoid năm 2010

và dự kiến đến năm 2018

Để đáp ứng nhu cầu đó, β-carotene được sản xuất bằng hai phương pháp:

Đó là tổng hợp hóa học và chiết xuất từ tự nhiên Những nghiên cứu gần đây chothấy việc sử dụng β-carotene tổng hợp hóa học ở liều lượng cao có liên quan đếnhiện tượng biến đổi nhiễm sắc thể, dẫn đến nguy cơ ung thư trong khi đó β-carotene tự nhiên lại có khả năng chống lại sự sai khác này do đó có khả năngngăn ngừa ung thư Bên cạnh đó thì các sản phẩm β-carotene tự nhiên cũng được

ưa thích hơn, song ở mức độ công nghiệp thì nguồn cung β-carotene tự nhiên cónhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản lý vùngnguyên liệu Sự chênh lệch về giá giữa β-carotene tự nhiên (1000-2000 USD/kg)

và β-carotene tổng hợp hóa học (400-800 USD/kg) (Tawfiq Abu-Rezq S., SuadAl-Hooti et al., 2010) cũng luôn thôi thúc các nhà khoa học tìm ra con đườngchuyển hóa β-carotene tự nhiên

2.1.3 Con đường tổng hợp β-carotene

Tất cả các carotenoid nói chung và β-carotene nói riêng quá trình sinh tổnghợp đều đi theo con đường isoprenoid Con đường tổng hợp isotenoid được chiathành ba giai đoạn: (1) hình thành các đơn phân 5 cacbon (C5) gồm IPP vàDMAPP, (2) giai đoạn hình thành các hợp chất C40, (3) thay đổi chuỗi C40 trong

hệ thống các carotenoid để tạo thành β-carotene

Giai đoạn một: Sinh tổng hợp các chất đầu tiên để đi đến DMAPP và IPPdiễn ra theo 2 con đường riêng biệt: Con đường mevalonate (MAV) và conđường non-mevalonate (MEP).

Sinh vật nhân chuẩn thường sử dụng con đường MAV để chuyển hóaacetyl-CoA thành IPP, tiếp theo là đồng phân hóa IPP thành DMAPP Sinh vậtnhân sơ trừ một số trường hợp ngoại lệ, thường sử dụng con đường MEP để sảnxuất IPP và DMAPP qua phản ứng ngưng tụ đầu tiên giữa pyruvate andglyceraldehyde-3- phosphate Thực vật và Streptomycetes thì sử dụng cả hai conđường (Yoon, Hye- Min Park et al., 2007)

Con đường MAV

Con đường MAV lần đầu tiên được phát hiện bởi Bloch và Lynen vàonhững năm 60 (Lynen, 1967) Trong con đường này, hai phân tử acetyl-CoA đầutiên sẽ kết hợp lại với nhau để tạo thành acetoacetyl-CoA, sau đó một phân tửacetyl-CoA thứ ba được đưa vào thông qua liên kết cộng aldol để tạo thành beta-Hydroxy-beta-methylglutaryl-CoA (HMG – CoA) Sau đó, dưới sự xúc tác củaenzyme HMG – CoA reductase, HMG – CoA được chuyển hóa thànhmevalonate Mevalonate sau đó được phosphoryl hóa hai lần và decarbonxyl đểtạo ra IPP (Isopentenyl pyrophosphate) IPP sau đó được đồng phân hóa thànhmột isoprene khác là DMAPP (Dimethylallyl pyrophosphate) nhờ sự xúc tác củaenzyme IPP isomerase

Hình 2.4 Sinh tổng hợp IPP và DMAPP theo con đường MAV

Con đường MEP

Sau khi con đường MAV được khám phá, các nhà khoa học đã nghiên cứu

và phát hiện một số loại vi khuẩn như E coli và S chromofuscus có con đườngsinh tổng hợp carotenoid không phụ thuộc vào mevalonate, con đường này đượcgọi là non-mevalonate hay còn gọi là MEP Trong con đường này quá trình sinhtổng hợp IPP và DMAPP không cần mevallonate Cơ chất đầu tiên là phản ứngngưng tụ giữa pyruvate với glyceraldehyde-3-phosphate tạo thành DXD nhờ xúctác của DXD synthetase, tổng hợp chất trung gian không những cho IPP vàDMAPP mà còn để tổng hợp thiamine và pydoxol DXD có thể được đưa vào E.coli và A thaliana làm tiền chất cho các hợp chất này Sau đó diễn ra một loạtcác phản ứng chuyển hóa thành MEOP, MEP và tạo ra IPP và DMAPP Conđường MEP không có mặt trong các loài động vật có vú nhưng có nhiều trong vikhuẩn gây bệnh và kí sinh trùng

Giai đoạn hai: Hình thành các hợp chất C40 Trong giai đoạn tiếp theonày, DMAPP lần lượt thêm IPP vào nhờ enzyme IPP prenyltransferases tạo nêncác diphosphate tuyến tính geranyl pyrophosphate (GPP, C10, monoterpenoids),các phân tử GPP sau đó lại được liên kết với IPP để tạo thành các fanesypyrophosphate (FPP, C15, sesquiterpenoids), các FPP cũng tiếp tục liên kết vớiIPP để tạo thành geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP, C20, diterpenoids) Giaiđoạn tạo carotenoid bắt đầu với sự tạo thành các hợp chất C40 đầu tiên phyotene

từ hai phân tử GGPP

Hình 2.6 Quá trình sinh tổng hợp carotenoid từ IPP và DMAPP

 Giai đoạn ba: Phyotene được tạo thành ở dạng đồng phân 15C, có banối đôi liên hợp, không có màu sẽ chuyển hóa tiếp tục bằng những phản ứngdehydro

hóa tạo sản phẩm là lycopene

Hình 2.7 Quá trình chuyển hóa phyopene thành lycopene

Sau cùng, lycopene tiếp tục đóng vòng ở một hoặc hai đầu tạo ra các sản phẩm như α- carotene, β-carotene, ε- carotene

Hình 2.8 Tổng hợp β-carotene từ lycopene

2.1.4 Các nguồn cung cấp β-carotene

Nguồn cung cấp β-carotene cho con người có thể là tất cả các nguồn cóchứa carotenoid bao gồm từ thực vật, tảo, nấm hay tổng hợp hóa học Tuy nhiên,80-90% nguồn cung cấp β-carotene cho con người là từ thực phẩm Trong côngnghiệp, β-carotene có thể được tổng hợp hóa học hay lên men từ vi sinh vật tùytừng mục đích

2.1.4.1 Nguồn cung từ thực vật

Nguồn cung cấp β-carotene chủ yếu cho con người là từ các loại rau, củ,quả (Maiani, Caston et al., 2009) Các thực phẩm có chứa hàm lượng β-carotenecao như bí ngô, cà rốt, khoai lang (Desobry, Netto et al., 1998) Hàm lượngβ-carotene liên quan mật thiết đến kiểu gen trong các giống trái cây và rau củkhác nhau (Maiani, Caston et al., 2009) Con người có thể dễ dàng thu nhận trựctiếp β-carotene thông qua con đường ăn uống Sự hấp thu β-carotene chịu ảnhhưởng một số yếu tố như chế biến thực phẩm và nấu nướng (Parker, Swanson etal., 1999) Hiện nay ở quy mô công nghiệp đã có nhiều quy trình thu β-carotene

từ thực vật đã được xây dựng và thành công β-carotene trích ly từ cà rốt (vớikhoảng 34% ở dạng đồng phân cis, còn lại là 66% ở dạng đồng phân transβ-carotene) hoặc từ quả gấc với sản phẩm ở dạng dầu gấc (ANS 2012) Tuynhiên nhược điểm của phương pháp này là phục thuộc vào thời vụ, quy trình tinhchế phức tạp, thời gian dài và hiệu suất không cao (Smith, 1998)

Bảng 2.1 Hàm lượng carotenoid có trong thực vật

Nguồn: Hà Thị Bích Ngọc và Trần Thị Huyền Nga (2007)

2.1.4.2 Nguồn cung từ vi sinh vật

Một số loài vi sinh vật cũng có khả năng tổng hợp β-carotene như một sốloài vi khuẩn có khả năng quang hợp, vi tảo, nấm (Heller, Descamps et al.,1998) Con người có thể thu nhận β-carotene từ vi sinh vật để sử dụng Phươngthức thu β-carotene từ vi sinh vật là thu sinh khối, có thể tách chiết từ sinh khốihoặc sử dụng trực tiếp tùy thuộc yêu cầu chất lượng β-carotene (Heller,Descamps et al., 1998) β-carotene từ vi sinh vật chủ yếu được sủ dụng trongcông nghiệp làm chất phụ gia thực phẩm, thức ăn chăn nuôi (Hyung Seok Choi,Sang Yup Lee et al., 2010)

Tuy nhiên, đa số các vi sinh vật chỉ tổng hợp một lượng nhỏ β-carotene chobản thân chúng Chính vì vậy, ngày nay các nhà khoa học đã áp dụng các kỹthuật khác nhau tác động lên con đường trao đổi chất của vi sinh vật để chuyểnhướng, kích thích một số loại vi sinh vật sản xuất ra hợp chất mong muốn Bắtđầu từ thập niên 90, carotene đã được tổng hợp thành công đầu tiên trên Z.mobilis, A tumefaciens (Misawa, Yamano et al., 1991) và sau đó là trên E coli(Lee, Momen et al., 2003) không mang gene sinh tổng hợp carotene bằng kĩthuật DNA tái tổ hợp Có bốn yếu tố quyết định thành công của sản xuấtβ-carotene tái tổ hợp năng xuất cao: Thứ nhất là cung cấp đầy đủ các tiền chất(chất nền cho phản ứng), thứ hai là cần có sự cân bằng và đầy đủ các enzymecarotenogenic để có thể chuyển hóa tối đa mà không tạo ra các hợp chất trunggian, thứ ba là kết hợp với plastid để giảm thiểu sự tích tụ các các chất trung gian

và tăng lượng chất cuối cùng, thứ tư là vật chủ phải có con đường tổng hợpisoprenoids và khả năng tích trữ β-carotene cao (Sies and Stahl, 1998)

2.1.4.3 Nguồn cung từ tổng hợp hóa học

Phương pháp chung cho việc tổng hợp C40 carotenoid là sử dụng phươngpháp ngưng tụ Witting giữa C10-dialdehyde với hai phân tử C15-phosphoniumđối xứng để tạo nên cấu trúc đối xứng và sau đó thực hiện phản ứng đồng phânhóa và kết tinh tạo nên C40 hoàn chỉnh Phương pháp ngưng tụ Witting làphương pháp có hiệu quả cao được ứng dụng đa dạng trong giai đoạn cuối cùngcủa công nghiệp tổng hợp carotenoid Trong số 600 loại carotenoid được tìm thấythì có 8 loại được tổng hợp hóa học trên quy mô công nghiệp Các carotenoid nàybao gồm lycopene, lutein, zeaxanthin, β-carotene, canthaxanthin, astaxanthin, α-carotene và β-cryptoxanthin Những sản phẩm này được sử dụng làm chất phụ

β-carotene bắt đầu được tổng hợp hóa học từ những năm 1950 chủ yếu bởihai công ty là Hofman La Roche (Thụy sỹ) và BASF (Đức), chiếm khoảng 70%sản lượng thế giới, đạt khoảng 500 tấn/năm.

 Tổng hợp hóa học bởi Công ty BASF dựa trên phản ứng của Wittig vàđược thực hiện bởi Badische Anilin và Soda-Fabrik (BASF) Quá trình tổng hợpđược

thực bằng cách nối hai phân tử C20 đối xứng với nhau qua trung tâm

Hình 2.9 Sơ đồ tổng hợp β-carotene của BASF

 Cách tổng hợp thứ hai là dựa trên phản ứng Grignard và được thực hiệnbởi F Hoffman-la Roche và công ty (Roche), β-carotene được tổng hợp bằngcách nối ba phân tử C19, C2 và C19 với nhau

Hình 2.10 Sơ đồ tổng hợp β-carotene của Roche

2.1.5 Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp vào sản xuất β-carotene tự nhiênCông nghệ DNA tái tổ hợp là tập hợp các kỹ thuật tạo nên các DNA tái tổhợp để đưa các gene mong muốn vào cơ thể sống DNA tái tổ hợp là phân tửDNA được tạo thành từ hai hay nhiều trình tự DNA của các loài khác nhau.Trong kỹ thuật di truyền DNA tái tổ hợp thường được tạo thành nhờ việc gắn cácđoạn DNA có nguồn gốc khác nhau lên vector tách dòng hay vector biểu hiện.

Kỹ thuật điều hướng trao đổi chất là phương pháp sử dụng công nghệ DNAtái tổ hợp nhằm biến đổi mạng lưới trao đổi chất trong các tế bào sống để sảnxuất ra các hợp chất mong muốn với hiệu suất cao (Stephanopoulos 1994) Tức

là nghiên cứu sử dụng các vi sinh vật phù hợp để sản xuất ra các hợp chất cầnthiết trên quy mô công nghiệp, có thể thương mại hóa sản phẩm (Ikeda andKatsumata 1992) Sản phẩm được tạo ra bằng phương pháp này được coi như làsản phẩm tự nhiên, do đó việc sử dụng chúng sẽ an toàn hơn so với các phươngpháp tổng hợp hóa học (ANS, 2012)

Nhu cầu về β-carotene trong thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, công nghiệpdược phẩm ngày càng tăng, do đó yêu cầu đặt ra là phải tìm ra cách đổi mớiphương pháp sản xuất β-carotene để thu được lượng β-carotene cần thiết Điềuhướng trao đổi chất ở vi sinh vật có thể giúp sản xuất một cách hiệu quảβ-carotene trong các sinh vật không mang gene tham gia sinh tổng hợpβ-carotene mà các phương pháp khác không thể thực hiện được (Lee andSchmidt-Dannert, 2002) Việc sử dụng các phương pháp tách chiết truyền thốngtrước đây có nhược điểm là phụ thuộc thời vụ, phức tạp trong xây dựng và quản

lý vùng nguyên liệu

Năm 1990 Misawa và cộng sự đã tách dòng và xác định trình tự các geneCrt tham gia con đường sinh tổng hợp các carotenoid đồng thời làm sáng tỏ conđường sinh tổng hợp các carotenoid trong vi khuẩn Pantoea ananatis Sau đó,nhiều nghiên cứu sản xuất β-carotene được tiến hành trên các loài sinh vật khôngchứa các gene tham gia sinh tổng hợp β-carotene như S cerivisiae (Yamano,Ishii et al., 1994), C utilis (Miura, Kondo et al., 1998), E coli (Yoon, Lee et al.,2009) …bằng cách biến nạp các gene tham gia sinh tổng hợp β-carotene vào vật chủ khác nhau

2.2 VI KHUẨN E coli VÀ CÁC HỆ VECTOR BIỂU HIỆN TRONG SẢNXUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP

2.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn E coli trong sản xuất protein tái tổ hợp

Hiện nay, trong các kỹ thuật điều hướng trao đổi chất nhằm tập trung tổnghợp protein tái tổ hợp có rất nhiều chủng chủ được nghiên cứu sử dụng Songtrong số các chủng biểu hiện protein ngoại lai thì vi khuẩn Gram âm E coli vẫn

là một trong những hệ biểu hiện thu hút nhiều quan tâm của các nhà nghiên cứu,

do chúng có tốc độ tăng trưởng nhanh với mật độ tế bào cao trên cơ chất khôngđắt tiền cũng như các đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu đầy đủ (Baneyx,1999; Novagen, 2006) Từ đầu thập niên 1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng

E coli làm tế bào chủ để sản xuất các protein tái tổ hợp Nhiều chủng E colikhác nhau đã được nghiên cứu thiết lập để biểu hiện protein tái tổ hợp bằng cácvector biểu hiện khác nhau Vì vậy khi lập phương án sản xuất protein tái tổ hợptrong E coli cần phải lựa chọn các hệ thống vector biểu hiện và chủng E colithích hợp với protein mục tiêu

E coli BL21

E coli BL21 (DE3) pLysS

Chủng E coli BL21 (DE3) pLysS [F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal,dcm(DE3)] thường dùng trong biểu hiện protein dung hợp với 6xHis Hệ thốngnày cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế tối đa hiện tượngphiên mã rõ rỉ khi không có chất cảm ứng DNA hệ gene của chủng này có chứađoạn gene T7 mã hóa cho T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ bacteriophageDE3 dạng tiềm tan Gene T7 chịu sự điều khiển của promoter lac Gene lacI cókhả năng tạo ra một lượng lớn repressol của lac operon (lacO) tham gia kiểm soát

Hình 2.11 Cơ chế kiểm soát sự phiên mã của T7 promoter

Sự ức chế phiên mã sẽ được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO (Mbuyi,Dequeker et al., 1982, Novagen 2006) Ngoài ra chủng này có thể được thiết kếchứa thêm plasmid pLysS gọi là E coli BL21 (DE3) pLysS giúp tế bào chủ tổnghợp được 1 lượng nhỏ T7 lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase.Các hệ thống biểu hiện nhờ T7 promoter chỉ hoạt động khí có mặt của T7 RNApolymerase của tế bào chủ Như vậy chủng này có đặc điểm là hạn chế tối đa sựtổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện khi không được cảm ứng Cũngnhư một số chủng E coli BL21 khác, E coli BL21 (DE3) pLysS cũng bị đột biếnkhuyết sản phẩm protease OmpT và Lon nên luôn hạn chế tối đa sự phân hủy củaprotein tái tổ hợp

E coli M15 (pREP4)

E coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein vượt mức bằng hệ thốngvector biểu hiện pQE Chủng này có mang plsmid pREP4 mang gene lacI mã hóacho repressor lacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gene nằm sau promotor T5theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng Chủng E coli M15(pREP4) có kiểu gene [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA+,Uvr+, Lon+] Một chủng khác có đặc điểm tương tự như M15 (pREP4) là