Luận án tiến sĩ nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota (tt)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢP VÀ KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU ĐỂ ỨNG DỤNG PHÁT TRIỂN QUE THỬ PHÁT HIỆN NHANH VIRUS ROTA Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 62420201 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội – 2017 Công trình hoàn thành tại: Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trương Quốc Phong GS TS Nguyễn Đăng Hiền Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Trường họp Trường Đại học Bách khoa Hà Nội Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Do Thi Thu Ha, Ngo Thu Huong, Nguyen Dang Hien, Le Thi Luan, Luong Trinh Thuy Linh, Truong Quoc Phong (2015) Development of a lateral flow immunoassay strip for rapid detection of rotavirus in fecal samples Journal of Biology, Vietnam Academy of Science and Technology Vol 37(1SE):1217 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1se.6070 Do Thi Thu Ha, Truong Quoc Phong (2015) Cloning and expression of gene coding for rotavirus VP6 protein in Escherichia coli Journal of Science and Technology Technical Universities 105(A):10-14 Trương Quốc Phong, Đỗ Thị Thu Hà (2015) Tối ưu mã di truyền để biểu protein VP6 virus rota Escherichia coli Tạp chí Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, 13 (2A) 619-626 Do Thi Thu Ha, Luong Trinh Thuy Linh, Nguyen Thi Ngoc Anh, Ngo Thu Huong, Nguyen Dang Hien, Truong Quoc Phong (2015) Optimization of a lateral flow immunoassay test strip for the sensitive detection of rotavirus in fecal samples The Proceeding of the 9th South East Asian Technical University Consortium (SEATUC) Symposium, ISSN 1882-5796, pp 219224 Do Thi Thu Ha, Truong Quoc Phong (2015) Optimization of culture conditions for high-level expression of human rotavirus VP6 protein in Escherichia coli The Proceeding of the 9th South East Asian Technical University Consortium (SEATUC) Symposium, ISSN 1882-5796, pp 230-233 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Virus rota nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy nặng phải nhập viện, chí tử vong trẻ nhỏ toàn cầu Việt Nam ProteinVP6 nằm lớp hạt virus, VP6 lại coi tiểu phần quan trọng hạt virus, không khối lượng lớn, chiếm 51% khối lượng hạt virus mà protein, VP6 kháng nguyên chung cho tất nhóm A, bảo tồn với độ tương đồng khoảng 92% trình tự axit amin chủng virus rota nhóm A Do có tính bảo thủ cho chủng virus rota thuộc nhóm A nên protein VP6 coi dấu sinh học xác định virus rota Đã có nhiều nghiên cứu protein VP6 tiểu đơn vị để ứng dụng cho sản xuất vắc xin, hay sản xuất protein VP6 TTH kháng nguyên tạo kháng thể đặc hiệu cho phục vụ cho chuẩn đoán virus rota phương pháp ELISA sắc ký miễn dịch Xuất phát từ sở lý luận thực tiễn nêu tiến hành nghiên cứu đề tài: " Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát nhanh virus rota” - Mục tiêu đề tài - Tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp virus rota - Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 - Thử nghiệm ứng dụng cho phát triển que thử phát nhanh virus rota dựa vào nguyên lý sắc ký miễn dịch 2.Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tách dòng biểu gen mã hóa protein Vp6 tái tổ hợp (TTH) - Tạo chủng E.coli BL21(DE3) mang pET22(b)::vp6 nghiên cứu điều kiện biểu VP6 TTH dạng dại tối ưu hóa gen tổng hợp - Lựa chọn điều kiện thu hồi kháng nguyên VP6 TTH nghiên cứu đặc tính VP6 - Nghiên cứu gây miễn dịch thu kháng thể đặc hiệu kháng VP6 TTH - Ứng dụng kháng thể kháng VP6 tạo que thử phát nhanh rota vius Những đóng góp luận án - Thành công việc tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp có đặc tính tương tự VP6 tự nhiên virus rota - Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 virus rota - Ứng dụng kháng thể tạo que thử chẩn đoán rota vius Bố cục luận án Luận án gồm 149 trang, phần đặt vấn đề 02 trang, tổng quan tài liệu 48 trang, vật liệu phương pháp nghiên cứu 23 trang, kết nghiên cứu 52 trang, kết luận kiến nghị trang, phụ lục 12 trang, tài liệu tham khảo trang với 177 tài liệu tham khảo Trong luận án có Bảng 73 Hình Chương 1:TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH BỆNH TIÊU CHẢY DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM Theo thông kê bệnh tiêu chảy nguyên nhân gây bệnh tật tử vong cho trẻ em nước phát triển.Ước tính đến tháng năm 2016, tố chức Y tế giới (WHO) ước tính toàn cầu trung bình có 215.000 trẻ tuổi tử vong nguyên tiêu chảy virus rota Ở Việt Nam đến năm 1980 nghiên cứu xác định virus nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy trẻ em, theo thống kê dịch tễ tỷ lệ trẻ em mắc bệnh tiêu chảy cấp virus rota chiếm 50% tổng số trẻ mắc tiêu chảy cấp phải nhập viện hàng năm, số trẻ chết virus rota chiếm từ 4% - 8% tổng số trẻ tuổi bị chết nguyên nhân Bình quân nước ta, trẻ tuổi năm mắc từ 0,8 - 2,2 đợt tiêu chảy 1.2 ĐẶC ĐIỂM CỦA VIRUS ROTA Virus rota có dạng khối cầu 20 mặt, cấu tạo nên protein cấu trúc (VP1 tới VP7) protein phi cấu trúc (NSP1-NSP6) 11 mảnh gen mã hóa Protein VP2 VP6 tạo nên hạt hai lớp phủ lớp protein VP7, 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIRUS ROTA 1.3.1 Quan sát kính hiển vi điện tử 1.3.2 Phương pháp điện di 1.3.3 Phương pháp RT-PCR real time-PCR 1.3.4 Phương pháp giải trình tự gen 1.3.5 Phương pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 1.3.6 Phương pháp ngưng kết hạt nhựa (latex agglutination) 1.3.7 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatograpic) 1.4 ĐẶC ĐIỂM PROTEIN VP6 VIRUS ROTA 1.4.1 Gen tổng hợp VP6: Mảnh protein vỏ VP6 virus mã hóa từ dsRNA có trọng lượng 1356 bp, protein tổng hợp 44,8 kDa chứa 397 axit amin mRNA virus chứa cấu trúc đầu 5’-methylated cap khuyết đuôi polyA Thay vào mRNA có đầu kết thúc 3’ chứa chuỗi UGACC bảo tồn tất 11 gen virus 1.4.2 Đặc điểm protein VP6 Các tiểu đơn vị VP6 khối cuộn gấp nếp β với đầu N đầu C tạo thành hệ gấp α lớn Hai vùng A B tham gia giữ ổn định cấu trúc tam phân VP6, VP6 protein chứa ion kim loại Zn2+, axit amin His153 bảo tồn nghiêm ngặt nhóm virus rota A mặt nhóm huyết virus rota khác 1.5 MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP PROTEIN TÁI TỔ HỢP 1.5.1 Ảnh hưởng chất cảm ứng 1.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ tổng hợp protein tái tổ hợp 1.5.3 Ảnh hưởng thời gian cảm ứng 1.5.4 Ảnh hưởng tối ưu hóa codons 1.6 TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH PROTEIN 1.6.1 Thu nhận làm tan thể vùi 1.6.2 Tinh VP6 cột sắc ký lực Ni2+ 1.6.3 Tái cuộn gấp VP6 tái tổ hợp 1.6.4 Định lượng định tính đánh giá hoạt tính protein VP6 1.7 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘNG VẬT 1.7.1 Chọn lọc động vật 1.7.2 Quy trình gây miễn dịch giám sát động vật 1.8 CÁC KIT THƯƠNG MẠI CHO CHUẨN ĐOÁN VIRUS ROTA Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.2 Plasmid 2.1.3 Các cặp mồi sử dụng 2.1.4 Các kháng thể sử dụng 2.1.4.1 Kháng thể cho tạo que thử 2.1.4.2 Kháng thể cho Western Blot ELISA 2.1.5 Hóa chất thiết bị máy móc 2.1.5.1 Vật liệu, hóa chất 2.1.5.2 Thiết bị máy móc 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Các phương pháp vi sinh Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật Phương pháp giống vi sinh vật Phương pháp tạo tế bào khả biến 2.2.2 Các phương pháp sinh học phân tử Phương pháp tách chiết RNA tổng số (QIAgen RNA extract Kit) Phương pháp RT-PCR PCR Phương pháp tách chiết plasmid Phương pháp ghép nối gen vào vector tách dòng Biến nạp vào tế bào E.coli Phương pháp cắt DNA plasmid enzyme giới hạn Thiết kế vector biểu pET22b(+) mang gen vp6 Phương pháp tinh DNA từ gel agarose QIAquick Gel Extraction kit Điện di DNA gel agarose Phương pháp biểu gen Điện di biến tính gel polyacrylamide-SDS 2.2.3 Các phương pháp hóa sinh protein 2.2.3.1 Phương pháp tách chiết protein thể vùi 2.2.3.2 Phương pháp thu nhận làm tan thể vùi 2.2.3.3 Phương pháp tinh protein sắc ký lực his-tag tái cuộn gấp 2.2.3.4 Phương pháp Western Blot 2.2.3.5 Phương pháp ELISA 2.2.4 Phương pháp miễn dịch học 2.2.4.1 Phương pháp sản xuất kháng thể 2.2.4.2 Phương pháp chẩn độ hiệu giá kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp phương pháp ELISA 2.2.4.3 Phương pháp tinh IgG cột sắc ký lực gắn protein A-Sepharose 2.2.4.4 Phương pháp soi hiển vi miễn dịch 2.2.5 Phương pháp tạo que thử sắc ký miễn dịch 2.2.6 Các phương pháp tin sinh Nghiên cứu sử dụng phương pháp: Kiểm tra mồi phần mềm FastPCR Kiểm tra vị trí enzyme hạn chế gen đích phần mềm Nebcutter Phân tích trình tự gen phần mềm NCBI(Blast,…) Chuyển mã trình tự DNA sang trình tự axit amin ExPASy.Dự đoán cấu trúc VP6 phần mềm RaptorX Xác định độ protein VP6 sau tinh phần mềm Quantity One Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6 TRONG E COLI 3.1.1 Tách dòng gen vp6 từ virus rota 3.1.1.1 Khuếch đại gen vp6 Gen vp6 khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu VP6nat F VP6nat R, khuôn RNA virus rota Qua Hình 3.1 sản phẩm PCR ta thấy xuất băng DNA với kích thước khoảng 1,2 Kb, kích thước phù hợp với kích thước lý thuyết đoạn gen mã hóa protein VP6 theo thiết kế Từ kết kết luận khuếch đại thành công đoạn gen mã hóa protein VP6 kỹ thuật RT – PCR Hình 3.1: Điện di đồ sản phẩm Hình 3.2: Sản phẩm PCR thu khuếch đại gen vp6 gel từ dòng với cặp mồi agarose 0,8% Đường chạy M: VP6nat đặc hiệu Đường chạy 1thang DNA chẩn 100 bp : Sản phẩm PCR từ ḍng (Thermo Scientific) Đường Đường chạy M: DNA chẩn 100bp chạy 1: sản phẩm RT-PCR (Thermo Scientific) khuếch đại gen vp6 3.1.1.2 Tách dòng gen vp6 vector pJET1.2 Sản phẩm phản ứng PCR khuếch đại gen vp6 tinh gắn vào vector tách dòng pJET1.2/blunt Sau biến nạp vào tế bào E.coli DH5α, plasmid pJET1.2::vp6 tách từ khuẩn lạc ngẫu nhiên sử dụng làm khuân cho PCR với cặp mồi VP6nat F VP6nat R sử dụng enzyme Taq polymerase Kết điện di đồ xuất băng có kích thước ~1,2kDa (Hình 3.2) Cho nên khẳng định băng sản phẩm PCR phổ điện di đồ từ đoạn gen vp6 chèn vào, chứng tỏ dòng kiểm tra mang gen đích vp6 Hai dòng khuẩn lạc có kết PCR tốt tiếp tục xử lý với hai enzyme giới hạn BamHI SalI Kết điện di Hình 3.3A thấy xuất hai băng DNA rõ nét có kích thước 1,2kb 2,9kb, thể cho kích thước gen vp6 vector pJET1.2 Đồng thời kết cắt enzyme NheI kết nhận thấy đường chạy xuất hai sản phẩm với trọng lượng 337 831 bp tương đương với tổng trọng lượng gen vp6 (1168 bp) ( Hình 3.3 B) Từ kết khẳng định plasmid pJET1.2 nhận gen vp6 plasmid tái tổ hợp pJET1.2::vp6, lựa chọn plasmid cho nghiên cứu Hình 3.3: Kết chọn dòng xử lý plasmid pJET::vp6 với enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI (A) Đường chạy 1, 2: plasmid trước cắt Đường chạy 1RE 2RE: xử lý với enzyme cắt hạn chế BamHI/SalI (B) Đường chạy 3: sản phẩm PCR từ dòng xử lý với enzyme cắt hạn chế NheI Đường chạy M: DNA chẩn 100 bp (Thermo Scientific) Gen vp6 plasmid dòng phân tích giải trình tự gen vp6 vector tách dòng pJET1.2::vp6,trình tự gen vp6 phân tích Trình tự đăng ký ngân hàng gen NCBI với mã số KR261090.1 So sánh trình tự gen lên ngân hàng liệu để tìm trình tự tương đồng, kết phân tích trình tự gen vp6 ngân hàng liệu có độ tương đồng trình tự gen vp6 99% với typ virus rota nhóm A G1P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[8] AB605599.1, JN258829.1, KT921117.1, KT921018.1, KT920886.1, KJ559167.1, KJ559068.1, KJ559057.1, KF371996.1, KJ559101.1, EF426125.1, EF426122.1, KC687050.1, KJ559253.1, KJ412714.1, GQ477099.2, Q477096.2, EF472944.1, EU372748.1, EF426121.1 98% với virus rota KT988220.1, KT988209.1, KT988165.1, KT988154.1, KT988143.1, KJ454599.1, KJ454598.1 So sánh trình tự amino acid suy diễn protein VP6 phân tích với chủng virus rota 100% độ tương đồng với chủng ALH21152.1 99% với chủng AIL83499.1, AFI59853.1, AHZ91014.1, AGM46790.1, AGF86310.1, ACV85661.2, AEO45626.1, ADK46567.1, ABA34211.1, ANN82937.1, ANN82935.1, ANC33794.1, ALQ76591.1, AJA72632.1 nói thành công việc tạo cấu trúc biểu gen vp6opt plasmis pET22b(+) Kết khung đọc mở tổng hợp VP6opt dự đoán bao gồm 430 axit amin tương đương 47kDa  Dự đoán cấu trúc vp6 phần mềm RaptorX Sử dụng phần mềm RaptorX để kiểm tra trình tự axit amin gen vp6opt có nối đuôi 6His-tag đầu C pelB đầu N, đồng thời xét trình tự VP6opt không mang His-tag pelB Hình 3.17: Cấu trúc 3D protein VP6 tái tổ hợp dự đoán phần mềm RaptorX (A): Trình tự axit amin gen VP6opt không mang his-tag pelB đầu C N (B): Trình tự axit amin gen VP6opt có nối đuôi 6His-tag đầu C pelB đầu N (87 – 96) (231 – 240): vị trí dự đoán epitope LLGTTLLNLD FEHIVQLRRAL  Dự đoán trình tự epitope phần mềm SVMtriP Chúng nhận thấy có khả tồn epitope LLGTTLLNLD, FEHIVQLRRAL cao trình tự axít amin protein VP6 TTH (score >=0,9).Định vị trình tự LLGTTLLNLD (87-96) phía gần đầu N, thuộc vùng xoắn α trình tự FEHIVQLRRAL (231-240) nằm vùng gấp nếp β cấu trúc monomer cấu trúc dự đoán Hình 3.17 Trên trimer, hai trình từ nằm vùng dự đoán chứa epitope protein VP6 virus rota thuộc tác giả Aiyegbo, et al., (2013) Trình tự pElB His-tag không xuất epitope chứng tỏ có mặt trình tự không ảnh hướng đến khả gây miễn dịch kháng nguyên Từ kết phân tích trên, khẳng định protein VP6 TTH có đủ khả gây miễn dịch tạo kháng thể 3.1.2.4 Nghiên cứu biểu gen vp6 tối ưu (VP6opt ) Vậy từ kết western blot kiểm tra biểu 6xHis-tag kết luận tạo cấu trúc vector tái tổ hợp chứa đoạn gen 10 vp6opt biểu protein tái tổ hợp chứa đuôi dung hợp histag Hình 3.19: Kết kiểm tra biểu Hình 3.20: Kết kiểm tra 6xHis-VP6opt chủng E biểu protein VP6 với coli BL21(DE3)/ pET22::vp6 (A) Điện mAb anti-vp6 (Abcam) (A): di protein tổng số trên gel Màng nhuộm ink (B): Kết polyacrylamid 12% (B) Western Blot Westernt Đường chạy 1, 2: Đường chạy 1,3: Dịch protein tổng số Protein tổng số từ E.coli từ E.coli BL21(DE3)/pET22 BL21(DE3)/pET22::VP6opt Đường chạy 2,4: Dịch protein tổng số Đường chạy M: protein chẩn từ E.coli BL21(DE3)/pET22::vp6opt (GiangNam-stain iNtRON) Đường chạyM: protein chẩn (Thermo Scientific, Mỹ) Kết WB đánh giá độ đặc hiệu protein VP6opt với kháng thể kháng VP6 tự nhiên cho thấy tạo protein VP6 virus rota tái tổ hợp hệ biểu E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)  Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến tổng hợp VP6opt Hàm lượng protein VP6 tái tổ hợp đạt cực đại (37,2%) ngưỡng IPTG 0,1mM lựa chọn nông độ để nghiên cứu  Ảnh hưởng nhiệt độ đến tổng hợp protein VP6opt Tất trạng thái protein VP6 thể thể vùi nhiệt độ, lượng protein VP6 nhiệt độ 300C (40%) 370C (40,4%) tổng hợp gần tương đương nhau, chọn nhiệt độ 300C cho nghiên cứu  Ảnh hưởng thời gian đến biểu protein VP6opt Hàm lượng protein VP6 đạt cực đại sau cảm ứng (36,5%), so với thời điểm sau cảm ứng (36,2%) lượng protein cao 11 không đáng kể Chúng chọn điều kiện thu protein tái tổ hợp VP6opt thời điểm sau tổng hợp làm sở cho nghiên cứu khác 3.1.3 Đánh giá so sánh biểu VP6nat VP6opt Với điều kiện tổng hợp protein thưc hiện, tiến hành đánh giá khả biểu protein VP6nat VP6opt gel phương pháp sử dụng phần mềm QuantyOne Bio-Rad Hình 3.24: So sánh khả biểu protein VP6 tự nhiên tối ưu hệ biểu Đường chạy 1: Protein tổng số từ E.coli BL21(DE3)/ pET22::VP6opt Đường chạy 2; E.coli BL21(DE3)/ pET22::VP6nat Đường chạy M: protein chẩn (GiangNam-stain iNtRON) Lượng protein nạp giếng mẫu 15μg/ giếng Yếu tố so sánh VP6 tự nhiên VP6 tối ưu Độ tương đồng protein 100% Điều kiện biểu protein: 0,3 mM 0,1 mM - Nồng độ ITPG: 370C 300C - Nhiệt độ: giờ - Thời gian: Trạng thái protein biểu Thể vùi Thể vùi Có lực với kháng thể đơn dòng + + kháng VP6 (Abcam-USA) % protein VP6 (Quanty One) 9,3 36.3 Lượng VP6 tổng hợp (mg/ml dịch 0,058 0,24 nuôi) Bảng 3.1: Đánh giá so sánh biểu VP6nat VP6opt hệ biểu Từ kết Hình 3.23 Bảng 3.1 thấy khả biểu protein gen vp6 tự nhiên vp6 tối ưu hóa khác Khả tạo thành protein VP6 gen tối ưu gấp gần lần gen tự nhiên Chúng chọn hệ biệu E.coli BL21(DE3)/pET22::vp6opt ưu để tiến hành nghiên cứu 3.2 THU NHẬN PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢP TINH SẠCH 12 3.2.1 Tách chiết protein VP6 Hình 3.25: Kết xử lý hòa tan protein phương pháp Đường chạy VB: protein tổng số biến tính sóng viba Đường chạy UR: protein tổng số biến tính Urea Đường chạy MC: protein tổng số biến tính hỗn hợp có βMercaptonethanol Đường chạy M: thang protein chẩn (GiangNam-stain iNtRON) 3.2.2 Tinh protein sắc ký lực qua cột Histrap tái cuộn gấp Tinh protein VP6 cột sắc ký lực Histrap HP (GE).Kết tinh sắc ký lực trình bày Hình 3.26 Protein VP6 tinh phương pháp đạt độ cao ~90%, lượng protein thu hồi ~0,24 mg Hình 3.26: Kết tinh protein VP6 sắc ký lực thông qua tương tác 6xHis Ni2+ (A): Protein không bám cột (B): protein VP6 tinh Các đường chạy MC, VB UR tương ứng với phương pháp xử lý Đường chạy M: thang protein chẩn (GiangNam-stain iNtRON) Protein VP6 tiếp tục kiểm tra trạng thái tái cuộn gấp phương pháp ELISA gián tiếp với kháng thể đơn dòng kháng VP6 thương mại Kháng thể đơn dòng nhận biết epitope lập thể VP6opt Kết ELISA trình bày Hình 3.26 3.27 L1 L2 O D 450nm PBS VB MC U re a Hình 4: Kết ELISA đánh giá khả tái cuộn gấp protein VP6 TTH tinh 13 OD 450nm Giếng 1: Mẫu trắng (PBS) Giếng 2: Protein VP6 TTH tinh từ phương pháp VB Giếng 2: Protein VP6 TTH tinh từ phương pháp MC Giếng 3: Protein VP6 TTH tinh từ phương pháp Urea Từ kết chọn phương pháp thu nhận xử lý protein VP6 hỗn hợp đệm gồm PBS 1X pH 7,4, 0,5% SDS, 20mM β-mercaptonethanol mM DTT (MC) Tinh kết hợp tái cuộn gấp sắc ký thay đệm hòa tan PBS pH 7,4 để thu nhận protein VP6 tinh cho nghiên cứu Chúng tiến hành xử lý sơ để sinh khối thu protein thể vùi Sản phẩm protein thể vùi tiếp tục xử lý theo phương pháp khác Kết Hình 3.25 cho thấy phương pháp thu protein dạng tan có hàm lượng VP6 khác không nhiều 3.2.3 Đánh giá đặc tính protein VP6 tinh Đặc tính kháng nguyên đánh giá thông qua phản ứng WB ELISA với kháng thể kháng VP6 thương mại Các tín hiệu so sánh với tín hiệu phản ứng với dịch ly giải protein tổng số virus rota nhóm A, typ G1P[8] xem mức độ cấu trúc phù hợp Kết thể Hình 3.28 3.29 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 PBS Hình 3.28: Kết kiểm tra đặc hiệu protein VP6 phương pháp WB (A): Bản Western Blot (B): Nhuộm ink màng Đường chạy 1,4: Protein tổng số E.coli BL21(DE3)/pET22::VP6opt Đường chạy 2,5: VP6opt tinh sau xử lý phương pháp βmercaptonethanol Đường chạy 3,6: Protein tổng số ly giải từ virus rota A, 14 VP6 TTH VP6 tự nhiên Hình 3.29: Kết ELISA so sánh cấu hình cuộn gấp VP6opt VP6 virus rota Giếng 1: Mẫu trắng (PBS) Giếng 2: ProteinVP6opt tái tổ hợp Giếng 2: Dịch ly giải protein từ virus rota Hình 3.30: Hiệu giá kháng thể kháng VP6 protein virus rota thời điểm lấy máu Hiệu giá kháng thể (đơn vị)độph typ G[1]P[8] Đường chạy M: thang protein chẩn (GiangNam-stain iNtRON) Kết Hình 3.28 ta nhận thấy xuất vạch tín hiệu có kích thước ~47kDa đường chạy và ~45kDa đường chạy Kết cho thấy có tương đồng trình tự đặc hiệu VP6opt tái tổ hợp so với VP6 virus rota tự nhiên Khi tiến hành phản ứng ELISA nhận tín hiệu hai mẫu VP6 tái tổ hợp VP6 từ dịch ly dải protein vius rota Như vậy, VP6opt tái tổ hợp sau tái cuộn gấp giữ cấu trúc tự nhiên, có hoạt tính 3.3 TẠO KHÁNG THỂ KHÁNG PROTEIN VP6OPT VIRUS ROTA TÁI TỔ HỢP 3.3.1 Quy trình gây miễn dịch thỏ 3.3.2 Xác định hiệu giá kháng thể phương pháp ELISA Kháng thể thu sau lần gây miễn dịch xác đinh hiệu giá kết thể Hình 3.30 1000000 655,360 100000 81,920 10000 5,120 2,560 1000 100 10 10 163,840 2,560 40 20 Thỏ 11 Thỏ 13 M0 M1 M2 M3 M4 M5 Thời điểm lấy máu Kết cho thấy, hiệu giá kháng thể tăng cao hai thỏ sau mũi tiêm lần Thỏ 13 cho hiệu giá cao Chúng chọn huyết thỏ 13 để thực nghiên cứu 3.3.3 Thu nhận tinh kháng thể sắc ký lực cột protein A-Sepharose Huyết thỏ sau gây miễn dịch tinh qua cột protein A Kết sắc ký lực tinh kháng thể IgG thể sắc ký đồ Hình 3.31.Kết từ sắc ký đồ cho thấy xuất hai đỉnh tương đương với thời gian lưu 1,55 phút 50,85 phút Đỉnh thứ dự đoán phân đoạn protein không bám cột, đỉnh thứ hai dự đoán phân đoạn IgG đảy khỏi cột Glycine 0,1M Để khẳng định chắn, tiến hành chạy điện di kiểm tra (Hình 3.33) Kết điện di khẳng định protein thu đỉnh thứ Hình 3.32 IgG Nồng độ protein thu 3,94 mg/ml Độ xác định phương pháp Quanti One-Biorad 97% 15 Hình 3.31: Sắc ký đồ tinh IgG từ Hình 3.32: Phổ điện di tinh huyết thỏ sử dụng cột protein A- kháng thể thỏ kháng Sapharose (thể tích gel 2ml, vận tốc dòng VP6opt virus rota 1ml/phút) 3.3.4 Xác định độ đặc hiệu kháng thể Độ đặc hiệu kháng thể sau tinh so với VP6 tái tổ hợp VP6 từ rota virus đánh giá thông qua hai phương pháp WB ELISA Kết thể Hình 3.33 3.34 Từ kết thu ta nhận thấy tín hiệu thu phương pháp WB (B) xuất vạch đặc hiệu 47kDa trọng lượng VP6 tái tổ hợp trọng lượng 45kDa protein VP6 virus rota Từ kết cho thấy rằng, kháng thể thu kháng thể đặc hiệu kháng VP6 tái tổ hợp VP6 tự nhiên virus rota 1.8 OD 450 nm 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 VP6 tự nhiên A B Hình 3.33: Kết Western blot kiểm tra độ đặc hiệu kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp.(A): Nhuộm ink màng (B): Western blot Đường chạy 1: Protein tổng từ chủng E.coli 16 VP6 T T H PBS Hình 3.34: Kết ELISA kiểm tra tính đặc hiệu IgGVP6opt với protein VP6opt tái tổ hợp vp6 RRV Giếng 1: Dịch ly giải protein từ virus rota Giếng BL21(DE3)/pET22::VP6opt Đường 2: ProteinVP6opt tái tổ chạy 2: Protein VP6 tinh qua cột hợp Giếng 3: Mẫu trắng HistrapFF Đường chạy 3: Protein tổng (PBS) từ dịch ly giải virus rota Kết ELISA cho thấy tín hiệu tương tự với hai mẫu VP6 tái tổ hợp VP6 từ dịch ly giải rota virus Kết cho thấy kháng thể kháng VP6 tái tổ hợp đặc hiệu với kháng nguyên VP6 tự nhiên  Đánh giá tính đặc hiệu anti-VP6IgG phương pháp miễn dịch hiển vi Protein VP6 kháng nguyên nằm lớp capsit hạt virus rota, vùng epitop kháng nguyên bộc lộ qua kênh hạt thường nằm tập trung vùng xoắn α (vùng A) cấu trúc VP6 Chúng sử dụng phương pháp miễn dịch hiển vi để đánh giá khả phát bắt cặp kháng thể với VP6 hạt virus nguyên vẹn Kết thể Hình 35 Hình 35: Đánh giá khả nhận biết antiVP6IgG với vùng lộ epiope VP6 protein hạt virus rota nguyên vẹn Từ hình ảnh quan sát thấy, với thị hạt nano vàng (kích thước xấp xỉ 30nm) gắn với anti-VP6IgG, hạt nano vàng vây xung quanh hạt virus rota, điều chứng tỏ anti-VP6IgG có lực với vùng bộc lộ VP6 hạt virus rota nguyên vẹn Từ kết kết luận anti-VP6IgG đặc hiệu với kháng nguyên VP6 tự nhiên virus rota Vậy khả phát protein VP6 dạng tự do, kháng thể tạo phát VP6 qua vùng bộc lộ epitope hạt virus rota, điều phù hợp với nghiên cứu Aiyegbo cộng 3.4TẠO QUE THỬ CHẨN ĐOÁN VIRUS ROTA Que thử nghiên cứu thiết kế hoạt động theo nguyên tắc sắc ký miễn dịch mô tả phần tổng quan Dựa vào tài liệu công bố, yếu tố cấu thành que thử thiết để tạo que thử ban đầu 17 Điều kiện thiết lập tạo que thử ban đầu có kết khả quan, vạch tín hiệu lên rõ ràng mẫu âm tính dương tính Để que thử hoạt động hiệu nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến que thử Hình 3.36: Thử nghiệm thiết lập que thử với điều kiện ban đầu Nghiên cứu điều kiện cộng hợp IgGVP6opt với phức PEG- 3.4.1 AuPNs 3.4.1.1 Ảnh hưởng nồng độ IgGVP6opt cộng hợp – KT1 Trong nghiên cứu này, dải nồng độ IgGVP6opt kháng VP6 virus rota sử dụng để tạo cộng hợp với 20 µl AuNP-PEG 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,1 µg IgGVP6opt /que, thí nghiệm lặp lại lần kèm theo kiểm chứng Kết biểu diễn Hình 3.37 Từ kết thu được, chọn lựa nồng độ 0,3 0,5 μg IgGVP6opt nghiên cứu với điều kiện cố định vạch phun kháng thể 0,1μg protein kháng thể 0,3μg protein Hình 3.37: Ảnh hưởng nồng độ IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs Hình 3.38: Ảnh hưởng nồng độ IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs Tiếp tục nghiên cứu với giá trị nồng độ kháng thể 0,3 0,5 μg IgGVP6opt với điều kiện cố định vạch phun kháng thể 0,1μg protein kháng thể 0,3μg protein Từ kết Hình 3.38 nhận thấy, xuất thêm vạch kiểm chứng (control) tín hiệu vạch kiểm tra thay đổi Nồng độ kháng thể cộng hợp (KT1) 0,3μg xuất vạch cường độ yếu, lượng kháng thể cộng hợp không tương tác đủ với KT2 KT3 Kết với nồng độ 0,5μg 18 xuất tín hiệu rõ ràng chứng tỏ lượng KT1 đủ phản ứng với kháng thể in que Chúng chọn kháng thể cộng hợp IgGVP6opt nồng độ 0,5μg protein để thực nghiên cứu 3.4.1.2 Xác định pH thích hợp tạo cộng hợp Thí nghiệm xác định với dải pH từ 3,5-6,0 cho thấy giá trị pH 4,0 cho vạch tín hiệu rõ nét Kết Hình 3.39, tiến hành lựa chọn pH 4,0 để tiến hành nghiên cứu 3.4.1.3 Ảnh hưởng nồng độ EDC/NHS Hình 3.39: Ảnh hưởng pH cộng hợp IgGVP6opt với phức PEGAuNPs KC: mẫu PEG-AuNPs Que thử ứng với dãy pH cộng hợp IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs Hình 3.40: Ảnh hưởng nồng độ EDC/NHS tới cộng hợp IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs Xác định nồng độ EDC/NHS thích hợp cho phản ứng cộng hợp việc đáng quan tâm Ở nghiên cứu này, dải nồng độ EDC/NHS sử dụng để xúc tác cho phản ứng cộng hợp kháng thể với hạt nano vàng 0,1; 1; 10; 100; 1000; 10000 µM Kết Hình 3.40 cho thấy nồng độ 100µM thấy xuất vạch tín hiệu đậm Vì chọn nồng độ EDC/NHS để thực nghiên cứu 3.4.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ tạo cộng hợp Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng tạo cộng hợp kháng thể phức PEG-AuNPs, phản ứng tạo cộng hợp tiến hành ba nhiệt độ khác (4oC, 28oC 37oC) thời gian 19 90 phút 24 Kết thể Hình 3.41 cho thấy mẫu 280C 90 phút cho vạch tín hiệu rõ nét Vì nhiệt độ 280C lựa chọn để thực nghiên cứu 3.4.1.5 Ảnh hưởng thời gian gắn cộng hợp Để nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến phản ứng tạo cộng hợp kháng thể phức PEG-AuNPs, tiến hành phản ứng tạo cộng hợp với thời gian sau: 30 phút, 60 phút, 90 phút 120 phút nhiệt độ phòng 280C Kết Hình 3.42 cho thấy sau 60 phút xuất vạch hồng tía, thời điểm 30 phút không xuất vạch tín hiệu Vậy thời gian đủ tạo cộng hợp 60 phút, chọn thời gian cho nghiên cứu tiếp Hình 3.41: Ảnh hưởng nhiệt độ cộng hợp IgGVP6opt với phức PEGAuNPs.KC: mẫu PEG-AuNPs Que thử từ nhiệt cộng hợp PEGAuNPs-IgGVP6opt Hình 3.42: Ảnh hưởng thời gian cộng hợp IgGVP6opt với phức PEG-AuNPs KC: mẫu PEG-AuNPs Que thử từ nhiệt độ 280C cộng hợp PEG-AuNPs-IgGVP6opt ủ thời gian 102, 90, 60 30 phút 3.4.2 Nghiên cứu cố định kháng thể Thí nghiệm cố định yếu tố như: kháng thể cộng hợp IgGVP6opt : 0,5μg/ que, kháng thể in vạch kiểm tra 0,3μg/ que Kháng thể in vạch kiểm chứng phun que với nồng độ 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 0,5μg kháng thể/ que Kết Hình 3.43 20 Hình 3.43: Kết ảnh hưởng nồng độ vạch kiểm chứng (control line) ảnh hưởng đến tín hiệu que thử Quan sát kết quả, nhận thấy: Khi tăng nồng độ vạch kiểm chứng vạch đậm dần lên Cường độ mầu đồng chấp nhận cho vạch vạch phun kiểm chứng 0,3μg kháng thể/ que thử Chúng chọn điều kiện cho nghiên cứu 3.4.3 Tối ưu dịch ly giải mẫu Do đặc trưng mẫu phân trẻ em tiêu chảy nhớt, nhày, khó lấy với số lượng đồng thời điểm khác nên cần xử lý mẫu phân trước nạp vào que thử để kiểm tra Chúng tiến hành với loại dung dịch chuẩn bị mẫu khác nhau, quy trình thử nghiệm mẫu phân trình bày chi tiết Mục 2.2.5.6 Kết thể Hình 3.44 Đệm hòa mẫu SPS1: PBS 1X, 0,1M NaCl, 0,5% Tween 20 SPS2: Sodium Borate 0,1M, 2% Triton X-100 Hình 3.44: Ảnh hưởng dịch ly giải mẫu tới tín hiệu que thử Kết nhận thấy, xét thành phần đệm thấy có chất hoạt động bề mặt (Tween, Triton X-100), chất giúp mẫu bị phá vỡ, nhanh chóng hòa vào đệm, ly giải hạt virus chứa phân Tín hiệu khác đệm SPS1 chứa muối, phân tử muối tạo cầu Na liên kết protein gây tượng dương tính giả Đệm SPS2 cho kết tốt hơn, dung dịch chạy màng, tín hiệu vạch rõ ràng, không xuất vạch mẫu âm tính Chúng chọn đệm SPS2 làm đệm hòa mẫu thử xác đinh mẫu phân 3.4.4 Đánh giá que thử 21 3.4.4.1 Ngưỡng phát Để xác định ngưỡng phát que thử, dải nồng độ virus rota chẩn sử dụng để thử nghiệm: 1,6 x 106, 1,6 x 105 1,6 x 104 1,6 x 103 hạt virus/ml Kết cho thấy nồng độ 1,6 x 105 xuất vạch tín hiệu mờ Do đó, xác định ngưỡng phát que thử 1,6 x 105 hạt virus/ml Tiến hành thí nghiệm song song với kit thử virus rota SD Hàn Quốc thị trường Khi so sánh độ nhạy kit, nhận thấy kit tạo có kết tương đương với kit thương mại SD Kết thể Hình 3.50 Hình 3.49: Kiểm tra phản ứng chéo Hình 3.50: Kiểm tra que thử với 10 tác nhân gây bệnh tiêu chảy ngưỡng phát que thử 3.4.4.2 Phản ứng chéo Chúng tiến hành thử phản ứng chéo với tác nhân vi sinh vật gây bệnh đường ruột Các vi sinh vật sử dụng bao gồm: 1_ Salmonella enteritidis, 2_Proteus mirabilis, 3_Clostridium sporogenes, 4_Candida albicans, 5_Vibrio haemolyticus, 6_Escherichia coli, 7_Shigella flexneri, 8_Polio virus I, 9_Polio virus II, 10_Polio virus III, 11_Adenovirus , 12_Astrovirus, 13_ Norovirus 14_Sapovirus Kết Hình 3.47 cho thấy vi sinh vật dýõng tính với que thử phát virus rota Từ kết Hình 49, khẳng định kháng thể kháng protein virus rota VP6opt đặc hiệu với virus rota phản ứng chéo với vi sinh vật 3.4.4.3 Khả que thử với nhóm virus rota khác typ Virus rota phân loại dựa vào tính kháng nguyên protein capsid lớp Các typ huyết phổ biến gây bệnh cho 22 người G1P[8], G2P[93], G3P[8], G4P[8] tỷ lệ nhỏ G5, G8 G9 [144], [115] Chúng thử khả xác định khả que thử với virus rota khác typ, typ đưa vào thử nghiệm định typ phương pháp ELISA (Polyvac cung cấp) Kết biểu diễn Hình 3.48 cho thấy tín hiệu nhận giống typ virus rota Điều cho thấy khả thử nghiệm que có khả quan đưa vào thực tế Kết Mã Kết Mã Typ Typ OD450nm que số OD450nm que số (PCR) (PCR) thử NC mẫu thử NC 202 0,339 G2P[4] + 733 1,244 G1P[8] + 209 0,230 G2P[8] + 189 0,167 G3P[8] + 104 0,278 G8P[8] + 732 0,274 G3P[4] + Hình 3.51: Kết que thử với typ virus rota 3.4.4.4 Độ nhạy độ đặc hiệu Chúng tiến hành xác lập độ nhạy độ đặc hiệu với 30 mẫu bệnh phẩm dương tính 30 mẫu âm tính kiểm tra virus rota phương pháp ELISA (mẫu bệnh phẩm thuộc trung tâm Nghiên cứu sản xuất vắc-xin sinh phẩm y tế, Bộ Y tế) Các mẫu bệnh phẩm tách chiết RNA, tạo cDNA khuếch đại cặp mồi đặc hiệu thử nghiệm song song với que thử Kết nhận thấy que thử đạt độ nhạy độ đặc hiệu 100% so với hai phương pháp PCR ELISA phạm vi 30 mẫu thử Que thử nhóm nghiên cứu tạo có khả tiếp tục phát triển để ứng dụng rộng bệnh viện phòng phân tích CHƯƠNG KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Đã tách dòng xác định trình tự gen vp6 từ virus rota có nguồn gốc phân lập Việt Nam Trình tự gen phân lập có độ tương đồng 99% với trình tự gen vp6 virus rota nhóm A, type G1P(8) đăng ký ngân hàng gen NCBI với mã số KR261090.1 Đã tạo cấu trúc biểu biểu thành công gen tự nhiên tối ưu mã hóa protein VP6 E coli BL21(DE3) Việc tối ưu hóa trình tự gen vp6 tăng mức độ biểu protein VP6 lên lần, đạt 0,24 mg protein VP6/ml dịch nuôi điều kiện biểu hiện: IPTG 0,1 mM, nhiệt độ cảm ứng 300C, thời gian cảm ứng 23 Đã xây dựng quy trình tách chiết, tinh tái cuộn gấp protein VP6 tái tổ hợp với hiệu suất thu hồi 80,2% độ tương đối 90,7% Protein VP6 tái tổ hợp có đặc tính kháng nguyên tương đương VP6 tự nhiên virus rota, đảm bảo yêu cầu gây miễn dịch thỏ Đã gây miễn dịch thỏ với điều kiện thể tích tiêm 1ml/lần gồm: 250μg protein VP6, 10μg FCA với mũi da lần đầu 200μg FIA cho mũi tiêm bắp, khoảng cách lần 14 ngày Thu nhận tinh kháng thể đa đòng kháng protein VP6 tái tổ hợp virus rota với hiệu suất 3,94 mg/ml huyết độ tương đối đạt 97% Kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợp đặc hiệu với protein VP6 virus rota Khảo sát ứng dụng kháng thể kháng protein VP6 virus rota để chế tạo que thử phát nhanh virus rota với điều kiện thiết lập ban đầu: nồng độ kháng thể kháng protein VP6 phức cộng hợp AuNPs 0,5μg, hai kháng thể in vạch là: vạch kiểm tra 0,1μg, vạch kiểm chứng 0,3μg Que thử có ngưỡng phát 1,6.105 hạt virus rota/ml Độ nhạy, độ đặc hiệu khảo sát đạt 100%, tương đương phương pháp ELISA PCR phạm vi thử nghiệm 30 mẫu dương tính 30 mẫu âm tính với virus rota KIẾN NGHỊ Tiếp tục hoàn thiện quy trình sản xuất kháng nguyên VP6 TTH virus rota thử nghiệm ứng dụng cho phát triển vắc xin hệ Tiếp tục ứng dụng kháng thể kháng VP6 cho phát triển phương pháp chẩn đoán ứng dụng khác 24 ... dụng phát triển que thử phát nhanh virus rota - Mục tiêu đề tài - Tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp virus rota - Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 - Thử nghiệm ứng dụng cho phát triển que thử. .. hiệu kháng VP6 TTH - Ứng dụng kháng thể kháng VP6 tạo que thử phát nhanh rota vius Những đóng góp luận án - Thành công việc tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp có đặc tính tương tự VP6 tự nhiên virus. .. nhiên virus rota - Tạo kháng thể đặc hiệu kháng protein VP6 virus rota - Ứng dụng kháng thể tạo que thử chẩn đoán rota vius Bố cục luận án Luận án gồm 149 trang, phần đặt vấn đề 02 trang, tổng quan