Nghiên cứu tạo kháng nguyên VP6 tái tổ hợp và kháng thể đặc hiệu để ứng dụng phát triển que thử phát hiện nhanh virus rota

BỘ GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO TẠ O TRƯ Ờ NG ĐẠ I HỌ C BÁCH KHOA HÀ NỘ I - ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨ U TẠ O KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢ P VÀ KHÁNG THỂ ĐẶ C HIỆ U ĐỂ Ứ NG DỤ NG PHÁT TRIỂ N QUE THỬ PHÁT HIỆ N NHANH VIRUS ROTA LUẬ N ÁN TIẾ N SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C HÀ NỘ I – 2017 BỘ GIÁO DỤ C VÀ ĐÀO TẠ O TRƯ Ờ NG ĐẠ I HỌ C BÁCH KHOA HÀ NỘ I - ĐỖ THỊ THU HÀ NGHIÊN CỨ U TẠ O KHÁNG NGUYÊN VP6 TÁI TỔ HỢ P VÀ KHÁNG THỂ ĐẶ C HIỆ U ĐỂ Ứ NG DỤ NG PHÁT TRIỂ N QUE THỬ PHÁT HIỆ N NHANH VIRUS ROTA Chuyên ngành: Công nghệ sinh họ c Mã số : 62420201 LUẬ N ÁN TIẾ N SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌ C NGƯ Ờ I HƯ Ớ NG DẪ N KHOA HỌ C PGS TS TRƯ Ơ NG QUỐ C PHONG GS TS NGUYỄ N ĐĂNG HIỀ N HÀ NỘ I – 2017 LỜ I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên u củ a mộ t số kế t cộ ng tác vớ i cộ ng khác Các số liệ u kế t trình bày luậ n án trung thự c, mộ t phầ n đư ợ c công bố tạ p chí khoa họ c chuyên ngành vớ i đồ ng ý cho phép củ a đồ ng tác giả Phầ n lạ i chư a đư ợ c tác giả công bố bấ t kỳ cơng trình nghiên u khác GVHD GVHD Nghiên u sinh PGS TS Trư ng Quố c Phong GS TS Nguyễ n Đăng Hiề n Đỗ Thị Thu Hà LỜ I CẢ M Ơ N Tơi xin bày tỏ lòng biế t n chân thành sâu sắ c tớ i PGS TS Trư ng Quố c Phong – giám đố c Trung tâm nghiên u phát triể n CNSH, Việ n CN Sinh họ c - CN Thự c phẩ m, trư ng Đạ i họ c Bách khoa Hà Nộ i GS TS Nguyễ n Đăng Hiề n – giám đố c Trung tâm nghiên u, sả n xuấ t vắ c xin sinh phẩ m y tế (Bộ Y tế ) tậ n tình hư ng dẫ n, quan tâm tạ o điề u kiệ n cho hoàn thành luậ n án này; Để hoàn thành luậ n án, nhậ n đư ợ c nhiề u giúp đỡ độ ng viên từ PSG TS Tô Kim Anh, PGS TS Khuấ t Hữ u Thanh – Nguyên ban lãnh đạ o Trung tâm nghiên u - phát triể n CNSH toàn thể bạ n bè đồ ng nghiệ p Tôi xin chân thành m giúp đỡ quý báu đó; Tôi chân thành m n tậ p thể cán mộ t số phòng nghiên u thuộ c Trung tâm nghiên u, sả n xuấ t vắ c xin sinh phẩ m y tế tạ o điề u kiệ n giúp đỡ để hồn thành nghiên u củ a mình; Vớ i tấ t lòng kính u biế t n chân thành nhấ t, xin dành cho gia đình: bố , mẹ , chồ ng con, nhữ ng ngư i thân yêu thông m, độ ng viên, tạ o điề u kiệ n chia sẻ khó khăn tơi suố t thờ i gian qua! Hà Nộ i, ngày 30 tháng 08 năm 2017 Đỗ Thị Thu Hà DANH MỤ C CHỮ VIẾ T TẮ T VI DANH MỤ C CÁC HÌNH Ả NH .IX DANH MỤ C CÁC BẢ NG X ĐẶ T VẤ N ĐỀ CHƯ Ơ NG I TỔ NG QUAN TÀI LIỆ U 1.1 TÌNH HÌNH BỆ NH TIÊU CHẢ Y DO VIRUS ROTA TRÊN THẾ GIỚ I VÀ VIỆ T NAM 1.1.1 Tình hình nhiễ m virus rota giớ i 1.1.2 Tình hình nhiễ m virus rota Việ t Nam 1.2 ĐẶ C ĐIỂ M CỦ A VIRUS ROTA 1.2.1 Phân loạ i virus rota 1.2.2 Đặ c điể m cấ u trúc củ a virus rota 1.2.3 Cơ chế xâm nhiễ m nhân lên củ a virus rota 1.3 CÁC PHƯ Ơ NG PHÁP PHÁT HIỆ N VIRUS ROTA 1.3.1 Quan sát bằ ng kính hiể n vi điệ n tử 10 1.3.2 Phư ng pháp điệ n di 10 1.3.3 Phư ng pháp Real time -PCR 11 1.3.4 Phư ng pháp giả i trình tự gen 11 1.3.5 Phư ng pháp ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 11 1.3.6 Phư ng pháp ngư ng kế t hạ t nhự a (latex agglutination) 12 1.3.7 Kỹ thuậ t sắ c ký miễ n dị ch ( immunochromatographic) 12 1.4 ĐẶ C ĐIỂ M PROTEIN VP6 VIRUS ROTA 12 1.4.1 Gen tổ ng hợ p VP6 12 1.4.2 Đặ c điể m protein VP6 13 1.4.2.1 Cấ u trúc protein 13 1.4.2.2 Đặ c tính củ a VP6 15 1.5 PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢ P VÀ Ứ NG DỤ NG 18 1.5.1 Protein VP6 tái tổ hợ p 18 1.5.2 Sả n xuấ t protein tái tổ hợ p hệ biể u hiệ n E coli 20 1.5.2.1 Hệ biể u hiệ n E coli .20 1.5.2.2 Các mã hiế m biể u hiệ n protein E coli 21 1.5.3 Ứ ng dụ ng kháng thể kháng VP6 tạ o kit thử chẩ n đoán 22 1.6 MỘ T SỐ YẾ U TỐ Ả NH HƯ Ở NG ĐẾ N SINH TỔ NG HỢ P PROTEIN TÁI TỔ HỢ P 23 1.6.1 Ả nh hư ng củ a chấ t m ứ ng 24 1.6.2 Ả nh hư ng củ a nhiệ t độ 24 I 1.6.3 Ả nh hư ng củ a thờ i gian m ứ ng 25 1.6.4 Ả nh hư ng củ a tố i u hóa codons 25 1.7 TINH SẠ CH PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢ P 26 1.7.1 Thu nhậ n làm tan thể vùi 26 1.7.2 Tái cuộ n gấ p VP6 tái tổ hợ p 27 1.8 SẢ N XUẤ T KHÁNG THỂ ĐA DÒNG Ở ĐỘ NG VẬ T 27 1.8.1 Quy trình gây miễ n dị ch giám sát độ ng vậ t 28 1.8.1.1 Chuẩ n bị kháng nguyên 28 1.8.1.2 Lự a chọ n tá dư ợ c 29 1.8.1.3 Đư ng tiêm 29 1.8.1.4 Liề u lư ợ ng kháng nguyên, thể tích số mũi ti êm 29 1.8.1.5 Giám sát độ ng vậ t 29 1.8.1.6 Lấ y máu 30 1.8.1.7 Tinh sạ ch kháng thể .30 1.9 KỸ THUẬ T SẮ C KÝ MIỄ N DỊ CH 30 1.9.1 Nguyên lý que thử 30 1.9.2 Ðặ c tính thành phầ n que thử 31 1.9.2.1 Hạ t nano vàng (AuNPs) 31 1.9.2.2 Cộ ng hợ p kháng thể VP6 - hạ t nano vàng 32 1.9.2.3 Miế ng cộ ng hợ p 33 1.9.2.4 Miế ng thấ m mẫ u 33 1.9.2.5 Màng nitrocellulose .34 1.9.2.6 Miế ng thấ m hút (absorbent pad) 34 1.10 CÁC KIT THƯ Ơ NG MẠ I CHO CHẨ N ĐOÁN VIRUS ROTA 34 CHƯ Ơ NG ĐỐ I TƯ Ợ NG VÀ PHƯ Ơ NG NGHIÊN CỨ U 36 2.1 ĐỐ I TƯ Ợ NG, VẬ T LIỆ U, HÓA CHẤ T VÀ THẾ T BỊ 36 2.1.1 Sơ đồ tổ ng thể nghiên u 36 2.1.2 Đố i tư ợ ng nghiên u 36 2.1.3 Vậ t liệ u 36 2.1.4 Các cặ p mồ i sử dụ ng 37 2.1.5 Các kháng thể sử dụ ng 38 2.1.5.1 Kháng thể cho tạ o que thử 38 2.1.5.2 Kháng thể cho Western Blot ELISA .38 2.1.6 Hóa chấ t thiế t bị máy móc 39 2.1.6.1 Vậ t liệ u, hóa chấ t 39 II 2.1.6.2 Thiế t bị máy móc bả n .40 2.2 PHƯ Ơ NG PHÁP NGHIÊN CỨ U 40 2.2.1 Các phư ng pháp vi sinh 40 2.2.1.1 Phư ng pháp nuôi cấ y vi sinh vậ t 40 2.2.1.2 Phư ng pháp giữ giố ng vi sinh vậ t 40 2.2.2 Các phư ng pháp sinh họ c phân tử 41 2.2.2.1 Phư ng pháp tách chiế t RNA tổ ng số (QIAgen RNA extract Kit) 41 2.2.2.2 Phư ng pháp RT – PCR .41 2.2.2.3 Phư ng pháp tách chiế t plasmid [17] .42 2.2.2.4 Phư ng pháp ghép nố i gen vào vector tách dòng [182] 42 2.2.2.5 Biế n nạ p vào tế bào E.coli 43 2.2.2.6 Phư ng pháp tạ o tế bào khả biế n 43 2.2.2.7 Phư ng pháp cắ t DNA plasmid bằ ng enzyme giớ i hạ n 43 2.2.2.8 Thiế t kế vecter biể u hiệ n pET 22b(+) mang gen vp6 43 2.2.2.9 Phư ng pháp tinh sạ ch DNA từ gel agarose bằ ng QIAquick Gel Extraction kit 44 2.2.2.10 Phư ng pháp biể u hiệ n gen 44 2.2.3 Phư ng pháp hóa sinh 45 2.2.3.1 Điệ n di DNA gel agarose [110] 45 2.2.3.2 Phư ng pháp điệ n di biế n tính gel polyacrylamide – SDS .45 2.2.3.3 Phư ng pháp tách chiế t protein tổ ng số [120] 45 2.2.3.4 Phư ng pháp tách chiế t protein thể tan [169] 45 2.2.3.5 Thu nhậ n làm tan thể vùi [48, 145] 46 2.2.3.6 Phư ng pháp tinh sạ ch protein cộ t His-tag kế t hợ p tái cuộ n gấ p [32] 46 2.2.3.7 Phư ng pháp lọ c tách hạ t virus rota tiể u thể thành phầ n 46 2.2.3.8 Đị nh lư ợ ng protein bằ ng phư ng pháp Bradford [24] 47 2.2.4 Phư ng pháp miễ n dị ch họ c 47 2.2.4.1 Phư ng pháp sả n xuấ t kháng thể 47 2.2.4.2 Phư ng pháp Western Blotting [158] .48 2.2.4.3 Phư ng pháp ELISA [162] 49 2.2.4.4 Phư ng pháp tinh sạ ch IgG bằ ng cộ t sắ c ký lự c gắ n protein A-Sepharose .50 2.2.4.5 Phư ng pháp soi hiể n vi miễ n [112] 50 2.2.5 Phư ng pháp tạ o que thử sắ c ký miễ n dị ch [93, 171, 174] 51 2.2.5.1 Tìm pH tố i u cho phả n ứ ng gắ n kháng thể nano vàng .51 2.2.5.2 Phư ng pháp tạ o cộ ng hợ p kháng thể - hạ t nano vàng 51 2.2.5.3 Phư ng pháp cố đị nh kháng thể lên màng .51 III 2.2.5.4 Phư ng thứ c hoạ t độ ng que thử nhanh 52 2.2.5.5 Phư ng pháp phân tích mẫ u bằ ng que thử 52 2.2.5.6 Phư ng pháp tính độ nhạ y độ đặ c hiệ u củ a que thử 52 2.2.6 Các phư ng pháp tin sinh 53 2.2.6.1 Kiể m tra mồ i bằ ng phầ n mề m FastPCR 53 2.2.6.2 Kiể m tra vị trí củ a enzyme hạ n chế gen đích bằ ng phầ n mề m Nebcutter 53 2.2.6.3 Phân tích trình tự gen bằ ng phầ n mề m NCBI (Blast,…) 53 2.2.6.4 Chuyể n mã trình tự DNA sang trình tự axit amin bằ ng ExPASy 53 2.2.6.5 Dự đoán cấ u trúc VP6 bằ ng phầ n mề m RaptorX [124] 53 2.2.6.6 Dự đốn trình tự epitope chuỗ i axit amin bằ ng phầ n mề m SNMTriP 53 2.2.6.7 Xác đị nh độ sạ ch củ a protein VP6 sau tinh sạ ch bằ ng phầ n mề m Quanty-One 4.6.9 (Bio-rad) 53 CHƯ Ơ NG KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬ N 54 3.1 TÁCH DÒNG VÀ BIỂ U HIỆ N GEN MÃ HÓA PROTEIN VP6 TRONG E COLI 54 3.1.1 Tách dòng gen vp6 kiể u i 54 3.1.1.1 Khuế ch đạ i gen vp6 .54 3.1.1.2 Tách dòng gen vp6 vector pJET1.2 55 3.1.2 Biể u hiệ n gen vp6 mã hóa protein VP6 59 3.1.2.1 Tạ o cấ u trúc biể u hiệ n tái tổ hợ p mang gen kiể u i mã hóa protein VP6 (VP6nat) 59 3.1.2.2 Nghiên u biể u hiệ n gen vp6nat E coli BL21(DE3) 61 3.1.2.3 Tạ o cấ u trúc biể u hiệ n tái tổ hợ p mang gen tố i u mã hóa protein VP6 (VP6opt) .66 3.1.2.4 Nghiên u biể u hiệ n gen vp6 tố i u E coli BL21(DE3) 72 3.1.3 Đánh giá so sánh biể u hiệ n gen vp6nat vp6opt 77 3.2 THU NHẬ N PROTEIN VP6 TÁI TỔ HỢ P TINH SẠ CH 78 3.2.1 Tách chiế t protein VP6 78 3.2.2 Tinh sạ ch protein VP6 tái tổ hợ p tái cuộ n gấ p 80 3.2.2.1 Tinh sạ ch protein VP6 tái tổ hợ p bằ ng sắ c ký lự c gắ n Ni2+ 80 3.2.2.2 Đánh giá khả tái cuộ n gấ p củ a protein VP6 tái tổ hợ p sau tinh sạ ch 81 3.2.3 Đánh giá đặ c tính protein VP6 tái tổ hợ p sau tinh sạ ch 82 3.3 TẠ O KHÁNG THỂ KHÁNG PROTEIN VP6 VIRUS ROTA TÁI TỔ HỢ P 84 3.3.1 Quy trình gây miễ n dị ch thỏ 84 3.3.2 Xác đị nh hiệ u giá kháng thể bằ ng phư ng pháp ELISA 84 3.3.3 Thu nhậ n tinh sạ ch kháng thể kháng protein VP6 bằ ng sắ c ký lự c cộ t protein ASepharose 85 3.3.4 Xác đị nh đặ c tính kháng thể 87 3.4 TẠ O QUE THỬ CHẨ N ĐOÁN VIRUS ROTA 90 IV 3.4.1 Nghiên u điề u kiệ n cộ ng hợ p anti-VP6IgG vớ i phứ c PEG-AuPNs 91 3.4.2 Nghiên u cố đị nh kháng thể màng nitrocellulose 95 3.4.3 Tố i u dị ch ly giả i mẫ u 96 3.4.4 Khả o sát đánh giá que thử 97 3.4.4.1 Khả o sát phả n ứ ng chéo .99 3.4.4.2 Khả o sát ngư ỡ ng phát hiệ n 100 3.4.4.3 Khả o sát khả củ a que thử vớ i nhóm virus rota khác type 101 3.4.4.4 Khả o sát độ nhạ y độ đặ c hiệ u mẫ u bệ nh phẩ m 103 3.4.4.5 Khả o sát thờ i gian bả o n que thử 103 CHƯ Ơ NG KẾ T LUẬ N – KIẾ N NGHỊ 105 4.1 KẾ T LUẬ N 105 4.2 KIẾ N NGHỊ 106 DANH MỤ C CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦ A LUẬ N ÁN 107 TÀI LIỆ U THAM KHẢ O 108 PHỤ LỤ C 117 Phụ lụ c 1: Môi trư ng hóa chấ t 117 Phụ lụ c 2: Trình tự gen vp6 ngân hàng liệ u NCBI 119 Phụ lụ c 3: Trình tự gen vp6 vector tách dòng pJET1.2 so sánh vớ i trình tự gen (GenBank: HQ392338.1) 120 Phụ lụ c 4: Cây phân loạ i theo trình tự gen vp6 củ a virus rota 122 Phụ lụ c 5: Cây phân loạ i theo trình tự axit amin VP6 củ a virus rota 123 Phụ lụ c 6: Thông tin trình tự gen vp6 từ virus rota nhóm A G1P(8) phân lậ p Việ t Nam 124 Phụ lụ c 7: Kế t giả i trình tự gen vp6nat vector pET22b+ 126 Phụ lụ c 8: Kế t giả i trình tự gen vp6opt vector pET22b+ 129 Phụ lụ c 9: Trình tự gen VP6opt pET22b(+) so sánh vớ i trình từ gen VP6 tổ ng hợ p (Genscript) 133 Phụ lụ c 10: Kế t tín hiệ u ELISA OD450nm 135 Phụ lụ c 11: Tóm tắ t quy trình xét nghiệ m 136 Phụ lụ c 12: Kế t khả o sát thử nghiệ m kit mẫ u bệ nh phẩ m 138 Phụ lụ c 13: Nguồ n gố c mẫ u sử dụ ng nghiên u 142 V DANH MỤ C CHỮ Từ viế t tắ t VIẾ T TẮ T Tiế ng Anh Tiế ng Việ t Amp Ampicillin Kháng sinh Ampicilline AP Alkaline phosphatase Enzyme Alkaline phosphatase Anti-VP6IgG Anti VP6 protein-IgG Kháng thể kháng protein VP6 tái tổ hợ p AuNPs Gold nanoparticle Hạ t nano vàng 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl Muố i 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate disodium salt phosphate disodium bp Base pair Cặ p base BSA Bovine Albumine Serum Albumine huyế t bò CBB Coomassie Brilliant Blue Coomassie Brilliant Blue Complementary Chuỗ i Axit Deoxyribonucleic acid bổ Deoxyribonucleic acid sung CFU Colony forming unit Đơ n vị hình thành huẩ n lạ c dATP Deoxyadenosine triphosphate Nucleotid Adenosine -A dCTP Deoxycytidine triphosphate Nucleotid Cytidine - C dGTP Deoxyguanosine triphosphate Nucleotid Guanosine -G dTTP Deoxythymidine triphosphate Nucleotid Thymidine - T dNTPs Deoxyribonucleoic Triphosphates Chứ a nucleotid A,T,C G BCIP cDNA dsRNA DTT Double stranded Ribonucleic Acid 1,4-Dithiothreitol 1-Ethyl-3-(3- EDC dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTA RNA sợ i đôi 1,4-Dithiothreitol 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Ethylene diamine tetraacetic acid Ethylene diamine tetraacetic acid Enzyme-Linked ImmunoSorbent Thử nghiệ m hấ p phụ miễ n dị ch liên kế t Assay enzyme EtBr Ethidium bromide Ethidium bromide FCA Freund’ s Complete Adjuvant Tá dư ợ c toàn phầ n FIA Freund’ s Incomplete Adjuvant Tá dư ợ c khơng tồn phầ n ELISA FPLC Fast protein liquid chromatography Sắ c ký lỏ ng nhanh VI 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV 2165728_pV | | | | | | | | | | 960 970 980 990 1000 TGGCTTTCGC GCGCCATTTC ATCCATGCAC ACGTTATCAA TAAAATCAAT | | | | | | | | | | 1010 1020 1030 1040 1050 AAAATATTCA ATGGTGGTGC GCGCGGTTTC CACATAGTTC GCATCCAGGT | | | | | | | | | | 1060 1070 1080 1090 1100 TCAGCAGGGT GGTGCCCAGC AGGCCAAAAT CAAAGGTCCA GTTGCGAATC | | | | | | | | | | 1110 1120 1130 1140 1150 GGCAGGTTGC CAATGCCCGC CGGTCTGAAA ATCGTTGCCG TTCATGGTCA | | | | | | | | | | 1160 1170 1180 1190 1200 CAATCATCTG GTTAAACTGC TGAATCAAAT CGCTCACGTT GCTATACAGG | | | | | | | | | | 1210 1220 1230 1240 1250 GGTGCCTTCC CCAATTTTTA TCGCCGGACT TCTTTCAGGG GTTGGATCCC | | | | | | | | | | 1260 1270 1280 1290 1300 AATTAATTCC GAAATCCCAG GGCCATTGCC CGGTTTGGGG CACGAGGAAA | | | | | | | | | | 1310 1320 1330 1340 1350 ACCCAAAAAC AACCCAACCC GGTTGGCGAC ACGGGATTTT CATTGGTTAA | | | | | | | | | | 1360 1370 1380 1390 1400 TTCTTCCTAT AAAGTTACAC AATTTATTTT TCAAAGGGGA AATTGTTTCT | | | | | | | | | | 1410 1420 1430 1440 1450 CCGCCCAACT TCCCCTTAAG GGGGGCCGAT TATTTTTCCG GCGCAAAAAT | | | | | | | | | | 1460 1470 1480 1490 1500 TTCCGATCCC TTGCCGGAAT AACTTGGCGG CAGTAAACCG CGCCCACACT | GGCGTCCGG 132 Phụ lụ c 9: Trình tự gen VP6opt pET22b(+) so sánh vớ i trình từ gen VP6 tổ ng hợ p (Genscript) RBS Start pelB T7primer.pETVP6opt pt TAAGAAGGAGATATACATATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCTGGTCTGCTGCTC VP6opt pt.Seque T7primer.pETVP6opt pt CTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCCATGGATATCGGAATTAATTCGGATCCAACCCTGAAA VP6opt pt.Seque GGATCCAACCCTGAAA BamHI **************** T7primer.pETVP6opt pt GATGCGCGCGATAAAATTGTGGAAGGCACCCTGTATAGCAACGTGAGCGATCTGATTCAG VP6opt pt.Seque GATGCGCGCGATAAAATTGTGGAAGGCACCCTGTATAGCAACGTGAGCGATCTGATTCAG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CAGTTTAACCAGATGATTGTGACCATGAACGGCAACGATTTTCAGACCGGCGGCATTGGC VP6opt pt.Seque CAGTTTAACCAGATGATTGTGACCATGAACGGCAACGATTTTCAGACCGGCGGCATTGGC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AACCTGCCGATTCGCAACTGGACCTTTGATTTTGGCCTGCTGGGCACCACCCTGCTGAAC VP6opt pt.Seque AACCTGCCGATTCGCAACTGGACCTTTGATTTTGGCCTGCTGGGCACCACCCTGCTGAAC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CTGGATGCGAACTATGTGGAAACCGCGCGCACCACCATTGAATATTTTATTGATTTTATT VP6opt pt.Seque CTGGATGCGAACTATGTGGAAACCGCGCGCACCACCATTGAATATTTTATTGATTTTATT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt GATAACGTGTGCATGGATGAAATGGCGCGCGAAAGCCAGCGCAACGGCGTGGCGCCGCAG VP6opt pt.Seque GATAACGTGTGCATGGATGAAATGGCGCGCGAAAGCCAGCGCAACGGCGTGGCGCCGCAG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AGCGAAGCGCTGCGCAAACTGGCGGGCATTAAATTTAAACGCATTAACTTTAACAACAGC VP6opt pt.Seque AGCGAAGCGCTGCGCAAACTGGCGGGCATTAAATTTAAACGCATTAACTTTAACAACAGC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AGCGAATATATTGAAAACTGGAACCTGCAGAACCGCCGCCAGCGCACCGGCTTTGTGTTT VP6opt pt.Seque AGCGAATATATTGAAAACTGGAACCTGCAGAACCGCCGCCAGCGCACCGGCTTTGTGTTT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CATAAACCGAACATTTTTCCGTATAGCGCGAGCTTTACCCTGAACCGCAGCCAGCCGATG VP6opt pt.Seque CATAAACCGAACATTTTTCCGTATAGCGCGAGCTTTACCCTGAACCGCAGCCAGCCGATG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CATGATAACCTGATGGGCACCATGTGGCTGAACGCGGGCAGCGAAATTCAGGTGGCGGGC VP6opt pt.Seque CATGATAACCTGATGGGCACCATGTGGCTGAACGCGGGCAGCGAAATTCAGGTGGCGGGC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt TTTGATTATAGCTGCGCGCTGAACGCGCCGGCGAACATTCAGCAGTTTGAACATATTGTG VP6opt pt.Seque TTTGATTATAGCTGCGCGCTGAACGCGCCGGCGAACATTCAGCAGTTTGAACATATTGTG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CAGCTGCGCCGCGCGCTGACCACCGCGACCATTACCCTGCTGCCGGATGCGGAACGCTTT VP6opt pt.Seque CAGCTGCGCCGCGCGCTGACCACCGCGACCATTACCCTGCTGCCGGATGCGGAACGCTTT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt AGCTTTCCGCGCGTGATTAACAGCGCGGATGGCGCGACCACCTGGTTTTTCAACCCGATT 133 VP6opt pt.Seque AGCTTTCCGCGCGTGATTAACAGCGCGGATGGCGCGACCACCTGGTTTTTCAACCCGATT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt ATTCTGCGCCCGAACAACGTGGAAGTGGAATTTCTGCTGAACGGCCAGATTATTAACACC VP6opt pt.Seque ATTCTGCGCCCGAACAACGTGGAAGTGGAATTTCTGCTGAACGGCCAGATTATTAACACC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt TATCAGGCGCGCTTTGGCACCATTGTGGCGCGCAACTTTGATACCATTCGCCTGAGCTTT VP6opt pt.Seque TATCAGGCGCGCTTTGGCACCATTGTGGCGCGCAACTTTGATACCATTCGCCTGAGCTTT ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CAGCTGATGCGCCCGCCGAACATGACCCCGGCGGTGAACGCGCTGTTTCCGCAGGCGCAG VP6opt pt.Seque CAGCTGATGCGCCCGCCGAACATGACCCCGGCGGTGAACGCGCTGTTTCCGCAGGCGCAG ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt CCGTTTCAGCGCCATGCGACCGTGGGCCTGACCCTGCGCATTGAAAGCgcggtgtgcgaa VP6opt pt.Seque CCGTTTCAGCGCCATGCGACCGTGGGCCTGACCCTGCGCATTGAAAGCGCGGTGTGCGAA ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt agcgtgctggcggatgcgaacgaaaccctgctggcgaacgtgaccgcggtgcgccaggaa VP6opt pt.Seque AGCGTGCTGGCGGATGCGAACGAAACCCTGCTGGCGAACGTGACCGCGGTGCGCCAGGAA ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt tatgcgattccggtgggcccggtgtttccgccgggcatgaactggaccgaactgattacc VP6opt pt.Seque TATGCGATTCCGGTGGGCCCGGTGTTTCCGCCGGGCATGAACTGGACCGAACTGATTACC ************************************************************ T7primer.pETVP6opt pt aactatagcccgagccgcgaagataacctgcagcgcgtgtttaccgtggcgagcattcgc VP6opt pt.Seque AACTATAGCCCGAGCCGCGAAGATAACCTGCAGCGCGTGTTTACCGTGGCGAGCATTCGC ************************************************************ SalI 6xHis Stop T7primer.pETVP6opt pt gtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgct VP6opt pt.Seque GTCGAC -****** 134 Phụ lụ c 10: Kế t tín hiệ u ELISA OD450nm Kế t ELISA đánh giá khả tái cuộ n gấ p củ a protein VP6 TTH tinh sạ ch Giế ng Mẫ u L1 L2 Trung SD bình PBS 0,214 0,236 0,225 0,011 VB 0,530 0,571 0,550 0,021 MC 0,685 0,702 0,693 0,009 Ure 0,570 0,600 0,585 0,015 Kế t tín hiệ u ELISA đánh giá trạ ng thái cấ u trúc VP6 TTH so vớ i VP6 tự nhiên Giế ng Mẫ u PBS L2 Trung bình SD 0,223 0,207 0,215 0,002 VP6 TTH 0,678 0,708 0,693 0,033 0,578 0,007 VP6 tự L1 nhiên 0,577 0,58 Kế t ELISA đánh giá khả nhậ n biế t củ a anti-VP6IgG vớ i kháng nguyên VP6 TTH VP6 tự nhiên Trung Giế ng Mẫ u L1 L2 VP6 tự nhiên 1,429 1,416 1,423 0,007 VP6 TTH 1,673 1,647 1,660 0,013 PBS 0,197 0,204 0,201 0,004 bình SD 135 Phụ lụ c 11: Tóm tắ t quy trình xét nghiệ m I Thành phầ n xét nghiệ m - Kit thử - Tăm lấ y mẫ u - Ố ng đự ng dị ch đệ m hòa mẫ u - Hư ng dẫ n sử dụ ng - Ố ng bóp hút mẫ u II Bả o n - Bả o n kit thử nhiệ t độ phòng (1-300C) - Không bả o n nhiệ t độ âm - Không sử dụ ng kit thử túi nhôm bị rách hoặ c hỏ ng - Không sử dụ ng kit hế t hạ n sử dụ ng III Thu mẫ u bệ nh phẩ m, bả o n thậ n trọ ng Lấ y mẫ u Chuẩ n bị - Dùng tăm lấ y khoả ng 50 mg mẫ u phân - Đặ t tăm vào ố ng nghiệ m có dung mơi - Xoay tăm bơng nhấ t 10 lầ n cho đế n mẫ u đư ợ c hòa tan dung mơi Loạ i bỏ tăm bơng Hút 100 µl vào que thử Vậ n chuyể n mẫ u bả o n - Mẫ u nên sử dụ ng sau lấ y - Mẫ u đư ợ c bả o n nhiệ t độ 2-8oC 72 Trong trư ng hợ p lư u mẫ u lâu phả i bả o n nhiệ t độ âm sâu: -200C Thậ n trọ ng - Nên lấ y mẫ u triệ u ng bệ nh xuấ t hiệ n - Mẫ u phân trự c tiế p xét nghiệ m nên đư ợ c đự ng ố ng nghiệ m không a bấ t kỳ môi trư ng, chấ t bả o n hay phụ gia gây phả n ứ ng vớ i kit thử IV Quy trình xét nghiệ m Chuẩ n bị mẫ u chiế t - Que thử mẫ u đư a nhiệ t độ phòng để tiế n hành xét nghiệ m - Cho dung dị ch hòa vào ố ng nghiệ m - Lấ y khoả ng 50 mg phân bằ ng tăm bơng vơ trùng có sẵ n - Nhúng tăm bơng vào ố ng nghiệ m a dung môi - Lắ c đề u nhấ t 10 lầ n cho đế n mẫ u hòa tan đề u dung môi - Bỏ tăm khỏ i ố ng nghiệ m Quy trình thự c hiệ n 136 - Lấ y thử khỏ i túi đặ t bề mặ t phẳ ng, khơ - Hút 100 µl vào giế ng mẫ u củ a thử Khi test thử bắ t đầ u hoạ t độ ng, mộ t màu đỏ tía chạ y dọ c cử a sổ đọ c kế t V Đọ c kế t vòng 15-20 phút Nhậ n đị nh kế t • Test thử hoạ t độ ng tố t nế u xuấ t hiệ n vạ ch đỏ tía phía trái cử a sổ đọ c kế t - vạ ch ng C • Vị trí bên phả i củ a vùng đọ c kế t thử vị trí thử T Nế u thử xuấ t hiệ n vạ ch màu đỏ tía vạ ch thử T - Âm tính: xuấ t hiệ n nhấ t vạ ch màu đỏ tía vị trí C - Dư ng tính: xuấ t hiệ n vạ ch màu đỏ tía vạ ch ng C vạ ch thử T - Khơng có giá trị : khơng có vạ ch màu thử sau nhỏ mẫ u bệ nh phẩ m hoặ c xuấ t hiệ n vạ ch T Ngun nhân khơng làm theo hư ng dẫ n sử dụ ng hoặ c kit thử hỏ ng 137 Phụ lụ c 12: Kế t khả o sát thử nghiệ m kit mẫ u bệ nh phẩ m Que thử PCR ELISA OD450nm Chứ ng KC+ KC- 10 0.682 0,492 0,392 0,396 0,289 0,537 0,513 0,351 0,338 0,421 1,6.106 PBS2 Que thử PCR 138 ELISA OD450nm Chứ ng KC+ 11 KC- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0,231 0,689 0,401 0,489 0,378 0,513 0,536 0,413 0,322 0,253 1,6.106 PBS2 Que thử PCR ELISA OD450nm Chứ ng KC+ 21 KC- 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0,887 0,497 0,429 0,534 0,501 0,488 0,489 0,327 0,398 0,467 1,6.106 PBS2 Hình 53: Thử nghiệ m que thử mẫ u bệ nh phẩ m dư ng tính vớ i virus rota 139 Que thử PCR ELISA OD450nm Chứ ng KC+ KC- 10 0,043 0,067 0,065 0,059 0,078 0,038 0,069 0,068 0,061 0,063 1,6.106 PBS2 Que thử PCR 140 ELISA OD450nm Chứ ng KC+ 11 KC- 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0,047 0,047 0,066 0,053 0,069 0,048 0,055 0,055 0,058 0,050 1,6.106 PBS2 Que thử PCR ELISA OD450nm Chứ ng KC+ 21 KC- 22 23 24 25 26 27 28 29 30 0,046 0,054 0,066 0,053 0,067 0,065 0,045 0,066 0,068 0,052 1,6.106 PBS2 Hình 54: Thử nghiệ m que thử mẫ u bệ nh phẩ m âm tính vớ i virus rota 141 Phụ lụ c 13: Nguồ n gố c mẫ u sử dụ ng nghiên u 142 143 144 145 146 ... nguyên VP6 tái tổ hợ p củ a virus rota Tạ o đư ợ c kháng thể đặ c hiệ u kháng protein VP6 virus rota Thử nghiệ m ứ ng dụ ng cho phát triể n que thử phát hiệ n nhanh virus rota dự a vào nguyên. .. tái tổ hợ p có đặ c tính tư ng tự kháng - nguyên VP6 tự nhiên củ a virus rota kháng thể đa dòng kháng VP6 tái tổ hợ p Bư c đầ u thử nghiệ m ứ ng dụ ng kháng thể kháng protein VP6 tạ o que thử nhanh. .. hành nghiên u đề tài: " Nghiên u tạ o kháng nguyên VP6 tái tổ hợ p kháng thể đặ c hiệ u để ứ ng dụ ng phát triể n que thử phát hiệ n nhanh virus rota" - - - Vớ i mụ c tiêu: Tạ o đư ợ c kháng nguyên