Nghiên cứu tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt ứng dụng trong chẩn đoán (TT)

1 Bộ giáo dục đào tạo y Tế Tr-ờng đại học y hà nội M TH T ANH NGHIấN CU TO KHNG TH C HIU KHNG NGUYấN UNG TH TUYN TIN LIT NG DNG TRONG CHN ON Chuyờn ngnh : D ng v dch Mó s : 62720109 Tóm tắt luận án tiến sĩ y học Hà NộI 2016 CễNG TRèNH C HON THNH TI: TRNG I HC Y H NI NGI HNG DN KHOA HC: PGS TS PHM THIN NGC PGS TS Lấ QUANG HUN Phn bin 1: Phn bin 2: Phn bin 3: Lun ỏn s c bo v trc Hi ng chm lun ỏn cp Trng hp ti Trng i hc Y H Ni Vo hi gi ngy thỏng nm Cú th tỡm hiu lun ỏn ti - Th vin i hc Y H Ni - Th vin Quc gia - Th vin thụng tin Y hc Trung ng GII THIU LUN N T VN Ung th tuyn tin lit (UTTTL) c mụ t ln u tiờn nm 1853 Cỏc kt qu nghiờn cu ó chng minh hiu qu iu tr UTTTL rt ph thuc vo thi im phỏt hin bnh Vi nhng trng hp ung th (UT) cũn giai on khu trỳ tuyn tin lit (TTL), khong 70- 85% bnh nhõn sng n 10 nm sau iu tr trit Vi cỏc trng hp u ó xõm ln bao tuyn lan rng, t l sng sau nm ch l 70% v 10 nm l 40% Vỡ vy yờu cn chn oỏn sm ung th núi chung hay UTTTL núi riờng l rt quan trng Khỏng nguyờn sm ung th tuyn tin lit (EPCA-2) l mt du n phõn t ó c cụng nhn l c hiu cho UTTTL Du n ny cú v trớ khỏng nguyờn ó c bit rừ trỡnh t v cú th c phỏt hin c mụ v cỏc dch sinh hc ca bnh nhõn UTTTL bng khỏng th (KT) c hiu EPCA-2 cũn c chng minh l xut hin sm nm trc cú cỏc biu hin mụ bnh hc, ng thi s dng KT xỏc nh EPCA-2 mỏu cho phộp chn oỏn UTTTL vi nhy l 92% c hiu l 94% S dng khỏng th c hiu phỏt hin cỏc du n ung th ti mụ v cỏc dch sinh hc cú giỏ tr sm cỏc phng phỏp chn oỏn ng thi, nhiu nghiờn cu cũn s dng khỏng th nh mt cht dn ng cho cỏc thuc chng ung th n ỳng cỏc t bo ung th cn tiờu dit, hn ch tỏc dng khụng mong mun trờn t bo lnh ng dng khỏng th chn oỏn v iu tr l nhng lnh vc ang ngy cng c phỏt trin hon thin cú th ng dng rng rói ti nghiờn cu ny c thc hin vi mc tiờu: To khỏng th c hiu khỏng nguyờn tỏi t hp EPCA-2 ỏnh giỏ kh nng ng dng khỏng th c hiu khỏng EPCA-2 chn oỏn ung th tuyn tin lit TNH CP THIT CA TI Ung th tuyn tin lit l nan y hu ht cỏc quc gia Bnh thng biu hin cỏc triu chng ó giai on mun Bnh cú th cha hon ton nu c chn oỏn sm iu ny cho thy tm quan trng ca chn oỏn sm ung th tuyn tin lit T l bnh nhõn ung th tuyn tin lit ngy cng tng Vit Nam ũi hi cn chn oỏn nhanh, sm, d thc hin, chớnh xỏc t yờu cu Cỏc du n c hiu cho mi bnh ung th huyt l iu lý tng chn oỏn ung th sm, d dng v khụng xõm ln Bng vic to cu trỳc khỏng nguyờn ung th bng phng phỏp tỏi t hp, lun ỏn gii quyt vic chn oỏn sm ung th tuyn tin lit bng khỏng th c hiu khỏng nguyờn tuyn tin lit theo cỏch ch ng to khỏng th t cu trỳc khỏng nguyờn ó bit T ú s dng khỏng th to ng dng chn oỏn NHNG ểNG GểP CA LUN N - õy l cụng trỡnh u tiờn Vit Nam kt hp cỏc k thut phõn t hin i liờn hon to sn phm dch l khỏng th c hiu EPCA-2 v s dng khỏng th to chn oỏn ung th tuyn tin lit - ti ó thit k thnh cụng vector biu hin polEPCA-2tỏi t hp mang gen mó húa epitop EPCA-2.22 v EPCA-2.19 ca khỏng nguyờn ung th tuyn tin lit sm - PolEPCA-2 tỏi t hp thu c cú hot tớnh vi khỏng th c hiu kớt ELISA phỏt hin EPCA-2 ca hóng CUSABIO - To thnh cụng khỏng th th c hiu khỏng nguyờn sm ung th tuyn tin lit (tng lng khỏng huyt th thu c l 330 ml, nng khỏng th to c l 229,17ng/ml) - Giỏ tr xỏc nh EPCA-2 bc u bnh nhõn ung th tuyn tin lit ca khỏng th th ti to tng ng kớt thng phm ca CUSABIO - Khỏng th c to thnh cú th hon thin tip to kớt xỏc nh khỏng nguyờn EPCA-2 B CC LUN N Lun ỏn gm 135 trang, phn: t trang, chng 1: Tng quan 47 trang, chng 2: i tng v phng phỏp nghiờn cu 30 trang, chng 3: Kt qu nghiờn cu 30 trang, chng 4: Bn lun 20 trang, kt lun trang Lun ỏn cú 26 bng, 37 hỡnh, s , 99 ti liu tham kho ú ting Vit 18, ting Anh 81 NI DUNG LUN N CHNG 1:TNG QUAN 1.1 I CNG V UNG TH TUYN TIN LIấT Ung th tuyn tin lit (UTTTL) l nguyờn nhõn gõy t vong ng hng th hai cỏc bnh ung th nam gii Thc t ó cho thy UTTTL cú th iu tr hon ton nu c phỏt hin sm Tuy nhiờn, ging nh mi ung th, cỏc triu chng lõm sng ca bnh thng ch xut hin ung th ó giai on mun, õy chớnh l nguyờn nhõn gõy tht bi iu tr v dn ti t vong ca UTTLT 1.1.1 Tỡnh hỡnh ung th tuyn lin lit trờn th gii Theo cụng b ca T chc Y t th gii, tớnh n ht nm 2012 trờn ton th gii cú khong 1.111.689 ngi mc UTTTL, 307.481 ngi ó t vong vỡ bnh Bnh cú t l mc cao nht cỏc nc cú nn kinh t phỏt trin Nm 2008, tớnh riờng Chõu u cú 338.000 n ụng c chn oỏn UTTTL Theo thng kờ ca Hip hi ung th M, nm 2015 M ó cú khong 220.800 ngi mc UTTTL mi v 158.040 ngi ó cht vỡ UTTTL [11] Trong nm (2001-2005) cỏc thng kờ cho thy t l mc UTTTL nhng ngi da en cao nht 249 ngi trờn 100.000 v thp nht nhng ngi M gc l 94 ngi trờn 100.000 T l mc UTTTL nhỡn chung tng nhanh theo tui hn so vi bt k loi ung th no khỏc 1.1.2 Tỡnh hỡnh ung th tuyn tin lit ti Vit Nam Vit Nam nm s cỏc nc cú t l UTTTL khụng cao Nhng theo c tớnh ca T chc y t th gii s lng mc UTTTL Vit Nam ht nm 2012 l khong 1275 ngi Trong ú s t vong khong 872 ngi Mt nghiờn cu nc ca Nguyn Vn Hng trờn 633 bnh nhõn ó c phu thut TTL Kt qu mụ bnh hc cho thy t l UTTTL c phỏt hin l 7,9 % Trong ú ch yu gp l dng ung th biu mụ tuyn bit húa cao (95,2%) mt nghiờn cu khỏc cụng b nm 2010 ca V Lờ Chuyờn sng lc UTTTL cho 87 nam gii ti thnh ph H Chớ Minh da trờn kt qu sinh thit TTL, mc PSA huyt v kt qu siờu õm trc trng thy cú 10/87 (2,5%) c chn oỏn l UTTTL 1.2 CC HIU BIT V CHN ON UNG TH TUYN TIN LIT 1.2.1 Cỏc hiu bit mi chn oỏn UTTTL Siờu õm ct lp: siờu õm ct lp (ULT) l phng phỏp chn oỏn hỡnh nh hin i Phng phỏp ny cho phộp thm dũ v hỡnh thỏi vi nhiu lp mụ vi bao ph ca hỡnh nh ti cỏc v trớ l 100% v tớnh chớnh xỏc v quang hc l 95% Phng phỏp siờn õm ct lp hin ang tip tc c nghiờn cu v th nghim trc a vo ng dng rng rói trờn lõm sng PET/CT Chp ct lp phỏt x positron (PET/CT) l mt hỡnh thc chn oỏn bng hỡnh nh cỏc chuyn húa sinh hc hoc chc nng c th mc t bo Trong UTTTL hỡnh nh PET/CT cú kh nng d oỏn thi gian sng thờm nhng bnh nhõn UTTTL b suy gim cỏc chc nng sinh húa sau iu tr ni tit t androgen Cỏc du n sinh hc ung th tuyn tin lit Du n sinh hcl cỏc phõn t c sn xut bi cỏc t bo bỡnh thng, t bo bt thng v phn ng ca c th vi ung th Cỏc phõn t ny lu hnh huyt thanh, huyt tng, cỏc dch sinh hc ca c th, nc tiu v ti mụ TTL ung th Vỡ vy,cỏc phõn t ny cú th c xỏc nhbng cỏc xột nghim Nhiu cỏc du n huyt ó c ng dng v cú giỏ tr lõm sng tt chn oỏn v chn oỏn giai on ca UTTTL nh: Khỏng nguyờn sm ung th tuyn tin lit (EPCA) Khỏng nguyờn t bo gc tin thõn ca tuyn tin lit (PSCA) Hexokinase 2(hK2) Osteoprotegerin (OPG) Human Glandular Kalikrein (huK2).Transforming Growth Factor - and Interleukin-6 (TGF- ) Yu t tng trng ni mụ mch mỏu(VEGF) Khỏng nguyờn ung th tuyn tin lit sm (EPCA) EPCA c phỏt hin t cỏc nghiờn cu proteomic v cỏc protein cht nn nhõn t bo ung th.Thỏng nm 2007, ln u tiờn Leman, Getzenberg v cng s ó xỏc nh chớnh xỏc mt protein xut hin nhõn ca t bo UTTTL vi lng nh m khụng cú nhõn ca t bo TTL bỡnh thng, ú l EPCA-2 EPCA-2 khụng cú liờn quan vi EPCA Tờn ca cỏc loi khỏng nguyờn ny l lch s phỏt hin chỳng EPCA l protein khỏng nguyờn UTTTL sm phỏt hin u tiờn cũn EPCA-2 l protein khỏng nguyờn UTTTL sm phỏt hin th hai EPCA-2 l protein ch tng mnh t bo ỏc tớnh TTL vỡ vy nú rt c trng cho UTTTL nờn ó c xut l mt du n sinh hc mi tn thng ỏc tớnh ca TTL Nm 2008 Getzenberg v cng s ó cụng b trỡnh t peptid c cho l epitope ca EPCA-2 ú l on EPCA-2.22, EPCA-2.19 v EPCA-2.4 Nm 2009, Getzenberg c cp bng sỏng ch cho nhng nghiờn cu v giỏ tr chn oỏn UTTTLca EPCA-2 EPCA-2 tng t bo TTL b ung th v t chc xung quanh nhng khụng xut hin cỏc mụ TTL bỡnh thng cng nh mụ bnh nhõn u phỡ i lnh tớnh TTL Mt nghiờn cu trờn cỏc bnh nhõn cú kt qu sinh thit ban u u õm tớnh, ó cú ti 75% cỏc trng hp cú EPCA-2 dng tớnhv tin trin thnh ung th nm sau ú ỏng chỳ ý, EPCA-2cũn c phỏt hin tuyn tin lit ca nhng ngi ny ớt nht hai nm trc cú cỏc biu hin hỡnh thỏi hc ca ung th Nh vy s hin din ca EPCA2 l c hiu vi UTTTL giai on rt sm Bng phn ng kt hp khỏng nguyờn (KN)-KT, ngi ta cú th s dng KTc hiu vi EPCA xỏc nh s cú mt ca EPCA-2 mỏu, mụ, huyt hay cỏc dch sinh hc ca bnh nhõn UTTTL KT ny cũn cú th giỳp cho vic d oỏn mc v nguy c hỡnh ung th v nguy c di cn ca UTTTL.Mt nghiờn cu ca Getzenberg o nng EPCA-2 330 n ụng Kt qu xỏc nh chớnh xỏc ti 90% cho nhng ngi n ụng b UTTTL cũn khu trỳv 98% nhng ngi cú u ó lan ngoi tuyn Cỏc th nghim ny õm tớnh 97% nhng ngi n ụngkhụng UTTTL.Mt nghiờn cu khỏc s dng phng phỏp ELISA xỏc nh nng EPCA huyt 449 bnh nhõn ó c phu thut ct b TTL phỡ i so sỏnh vi 112 nam gii khe mnh Vi ngng cutoff 10ng /ml, kt qu cho thy 100% nhng ngi n ụng khe mnh khụngthyEPCA-2 huyt cũn nhng nam gii UTTTL phng phỏp ELISA ó xỏc nh ỳng vi c hiu 98% v nhy 100% Nghiờn cu ny kt lun: cú th s dng EPCA-2 nh mt du n sinh hc huyt cú nhy cao chn oỏn sm UTTTL 1.2.2 Cỏc nghiờn cu ti Vit nam Nguyn Vn Hng nm 2005 cho thy t l UTTTL phỏt hin bng sinh thit l 7,9 % Trong ú ch yu gp l dng ung th biu mụ tuyn bit húa cao (95,2%) Khỏnh H v Hong Th Phng Liờn kt lun giỏ tr PSA trờn lõm sng khụng cho phộp chn oỏn xỏc nh UTTTL c bit vi PSA cú giỏ tr vựng xỏm (4 - 10ng/ml) Nguyn Th Phng Ngc nm 2009: Cú tng nng PSA mỏu c nhúm bnh nhõn ung th v bnh nhõn u phỡ i lnh tớnh TTL V EPCA, nht cú mt nghiờn cu ca Lờ Quang Hun ó tỏch dũng v xỏc nh thnh cụng trỡnh t nucleotide gen mó húa KN EPCA t mu bnh phm bnh nhõn UTTTL Hc vin quõn Y ó cy ghộp thnh cụng UTTTL ca ngi trờn chut thiu ht dch (chut Nude) v ỏnh giỏ trung ca ANA - 131 I vo ung th Nhúm nghiờn cu cũn th nghim tỏc dng phõn gii t bo UTTTL trờn chut Nude bng phc b vi rỳt dng vc xin si v quai b Kt qu cho thy hai vi rỳt si v quai b cú tỏc dng hn ch kớch thc UTTTL 1.3 KHNG TH V CHN ON UNG TH TUYN TIN LIT 1.3.1 Khỏng th nh ngha: Khỏng th cú bn cht l protein t bo lympho tit loi b cỏc yu t l vi c th 1.3.2 Cu to ca khỏng th Mt KN xõm nhp c th, h thng dch s nhn bit,v c hot hoỏ loi tr KN ny ỏp ng dch t bo v ỏp ng dch dch th l hai phng thc c hiu bo v c th i vi ỏp ng dch dch th, cỏc khỏng th ( KT) l cỏc globulin dch (Ig) dng hũa tan, ỏp ng dch qua trung gian t bo c thc hin bi t bo lympho T Mi phõn t KT cú cu trỳc gm mt hay nhiu n v c bn, mi n v cú chui polypeptid ging tng ụi mt: chui nh v chui nng C chui nh v chui nng u gm phn: Phn hng nh, cú trt t acid amin tng i n nh.Phn thay i vi trt t acid amin cú mt s on cc k thay i, chớnh nhng vựng cc k thay i, tham gia trc tip vo vic hỡnh thnh v trớ kt hp KN (paratop) 1.3.3 Khỏng th n dũng Khỏng th n dũng l mt hp cỏc KT cú y chui nng v chui nh cú cựng mt loi paratope vỡ vy ch kt hp c hiu vi mt loi epitope Khỏng th n chui l mt hp cỏc KT khụng y thng ch cú vựng thay i ca chui nng v chui nh mang cựng mt loi paratope vỡ vy ch kt hp c hiu vi mt loi epitope (vớ d: KT n chui ScFV) to khỏng th n dũng hay khỏng th n chui ngi ta cú th s dng mt cỏc phng phỏp:(1) Phng phỏp gõy dch trờn ng vt (2) Phng phỏp to t bo lai (3) Phng phỏp DNA tỏi t hp (4) Phng phỏp sng lc t cỏc th vin KT (th vin cỏc th thc khun th Phage display, th vin khỏng th Aptamer) 1.4 CC K THUT S DNG TRONG NGHIấN CU 1.4.1 K thut tỏi t hp DNA Cụng ngh protein l mt hng nghiờn cu quan trng ca cụng ngh sinh hc vi tim nng ng dng rt ln trờn c s cụng ngh DNA tỏi t hp Nh cụng ngh protein cú th to protein nguyờn th, protein ó c sa i hoc protein mi thụng qua s sn xut ca vi khun E.coli Cỏc bc chớnh ca cụng ngh protein: Nhn dng trỡnh t, Xỏc nh cu trỳc v mụ hỡnh húa, Bin i trỡnh t Phỏt trin phõn t Thit k trỡnh t de novo Biu hin7 Phõn tớch8 Quỏ trỡnh tỏch chit v tinh sch protein 1.4.2 K thut to khỏng th bng gõy dch trờn ng vt iu ch khỏng huyt bng gõy dch trờn ng vt l mt nhng phng phỏp to khỏng th ó c s dng t lõu v ngy cng c hon thin bờn cnh s i ca nhiu k thut to khỏng 10 th hin i Kt qu to khỏng huyt bng gõy dch ph thuc mt s yu t: Cht lng khỏng nguyờn: tớnh KN ca mt cht ph thuc vo cu trỳc, trng lng, phõn t, tớnh l v kh nng chuyn húa ca cht ú c th ng tiờm ca khỏng nguyờn.Liu lng ca khỏng nguyờn, thi gian gia cỏc ln tiờm: Tựy thuc KN v yờu cu iu ch khỏng huyt m la chn tin hnh gõy dch vi cỏc dung dch v thi gian tiờm khỏc Dung dch gõy dch cú loi: (1) dung dch khỏng nguyờn n thun, (2) khỏng nguyờn cựng tỏ cht Fruend, (3) Dung dch phi hp ca c (1) v (2) Phng phỏp thng s dng hin l gõy dch bng dung dch hn hp KN vi tỏ cht vỡ kt qu cho hiu giỏ KT cao hn so vi phng phỏp dựng KN n thun 1.4.3 K thut ELISA ELISA l k thut chn oỏn da trờn nguyờn lớ dch hc rt ph bin rt nhiu lnh vc ELISA l k thut hp ph dch gn enzym da vo tớnh hp ph t nhiờn ca protein trờn mt s cht nh polystyren Cỏc k thut ELISA hin cú bao gm: ELISA trc tip, ELISA giỏn tip, ELISA cnh tranh v ELISA sandwich K thut ELISA sandwich Nguyờn lý: KT khụng ỏnh du (bit trc) c gn lờn cht mang (polystyren), KN cn tỡm c vi cht mang cú KT Ra b KN tha v cho tip KT cú gn enzym Nh vy, KN cn tỡm s b kp gia hai KT Sau ln loi b KT gn enzyme tha, dung dch c cht c thờm vo sinh mu c trng Mc lờn mu ca phn ng c o mt quang bng quang ph k bc súng thớch hp K thut ELISA sandwich cú khỏ nhiu u im vt tri: th nht l gim c nhum mu nn v cỏc phn ng khụng c hiu Th hai phn ng c thc hin d dng, KT mt cú th c gn sn trờn b mt rn to thnh cỏc b KIT v cú th thc hin cỏc chn oỏn m ú KN khụng th gn c lờn mt rn CHAPTER RESEARCH RESULTS 3.1 Create recombinant proteins carrying epitopes EPCA-2 3.1.1 Create recombinant vector carrying the gene pole PCA-2 Vector pET-28a (+) which is derived from the Novagen company (USA) was chose as the vector carrying the encoding gene polEPCA2.22,2.19 and could expressed in E coli cells and produced the desired protein product in secretion form In the multi-position mounting cut site of this vector and gene-2.22,2.19 polEPCA both contained aware position of two enzymes I and Not I Pol EPCA-2 gene with the sequence that contains epitope of gene encoding early prostate cancer antigen (EPCA-2) was repeated times in tandem, and was designed by reseach team 3.1.2 Identify the gene sequence in the recombinant expression vector We used recombinant plasmid as a template for PCR reaction with a pair of primer of the vector pET-28a (+) that were T7 F and T7 R, then purified PCR products Obtained samples were sent to determine the sequence by automated sequence analysis machines Results of obtained gene transcription deduced protein sequence showed that the intact protein will consist of 210 amino acids corresponding with a molecular weight of about 23.1 kDa At this point, we can claim to haveability to link gene polEPCA-2 to vector pET-28a (+) in upright and correct reading frame 3.1.3 Express recombinant vector in E coli bacteria strain BL21 (DE3) to create polEPCA-2 protein Transformed recombinant expression vector pET-28a (+) / polEPCA2 into E coli BL21 (DE3) bacteria After having determined correctly the gene sequence of polEPCA-2 in expression vector pET-28a (+), the plasmids of all races were transformed into expression strain E coli BL21 (DE3) Electrophoresis results on polyacylamid gel showed good product with corrected size of expected protein of 23,1kDa was presented Surveying appropriate conditions for the expression process of the protein in our study was the time manifested 3.1.4 Purify recombinant protein by nickel Resin Kit ProBondTM By we made the recombinant protein with the end of 6-Histidine that has affinity with Ni2+, so we use purity column by affinity chromatography method, with chelating agent for stuffing into column is agarose-Ni2+ The His- Tag polEPCA-2 will have an affinity for Ni2 + and were clinging to the chelating agent on the column Then the affinity protein gets out of the column by pushing buffer (NEB) After purifying of the recombinant proteins, the products are checked by electrophoresis on gel polyacrylamide 12.6% The results showed that the recombinant protein was very dark in the position that equivalent to a size of 23.1 kDa Thus, protein polEPCA-2 was purified successfully by column chromatography affinity His- Tag, this product can be used for subsequent experiments 3.1.5 Develop baseline curve quantitating antigen or antibody We conducted to build baseline curve as instructed by the manufacturer (Kit determine EPCA-2, CSB-EQ 027679HU) Chart baseline curve kit (with r2 = 0.986) 3.1.6 Checking the activity of the product polEPCA after purification by kit ELISA Recombinant protein polEPCA-2 was conducted trialing activity simultaneously preliminary testing EPCA-2 protein levels after purification by ELISA with specific antibodies in the diagnosis kit of CUSABIO Results: polEPCA-2 activated, combined specifically with anti-EPCA-2 antibody in kit ELISA When compare to baseline curve, the concentration of obtained antigen equivalent to 41.185 ng / mL 3.2 RESULTS OF IMMUNIZATION IN RABBIT BY RECOMBINANT ANTIGEN PolEPCA -2 Immunization procedure was conducted repeatedly times independently with three different experiment batches The results presented in this report are in rabbit batch with the best antibody concentration The concentration of anti-polEPCA-2 antibodies in rabbit serum Theoritically, the specific antibody will be presented in experiment rabbit serum after the 3rd injection from day onwardly So we conducted taking venous blood in the edge ear of rabbit to test antibody concentration in different time days after the 3rd injection and 15 and 20 days after the 4th injection Comment: After the 3rd injection in day 7, the rabbit has specific antibody in serum with the concentrations 3.5 times higher than in control rabbit On the 15th day, after the 4th injection, the concentration of obtained antibody 3.5 times higher than after the 3th injection Concentration of antibody in the time of 20 days after the 4th injection reached the highest concentrations 8.4 times higher than concentration of antibody after the 3rd injection 3.3 RESULTS DETERMINATION OF SERUM EPCA-2 IN STUDY GROUPS 3.3.1 General Information of prostate patients group 3.3.1.1 Information about the age of prostate patients group Comment: Patients with prostate cancer and hypertrophic prostate tumor both have the highest susceptible age range from 76 to 85, the lowest susceptible age range that is less than 60 3.3.1.2 The concentration of serum tPSA of three research groups Comment: Two groups of prostate patients with tPSA concentration at all levels from high to low concentration tPSA concentrations > 30 ng / ml is in high percentage of prostate cancer group (30%) 3.3.2 Serum EPCA-2 concentration of prostate patient groups were quantitated by rabbit anti EPCA-2 antibody and kit CUSABIO 3.3.2.1 EPCA-2 concentration in the serum of patients with prostate cancer Comment: Prostate cancer patients with EPCA-2 concentration from 100 to 30 ng / ml (30%) while the highest percentage of BPHT group at concentration of 4-20 ng / ml (55%) Our results are also consistent with studies of Thomson and Catalon that said there is a significant increase of the PSA index in patients with prostate cancer, but there were prostate cancer patients who have no increase in serum PSA 4.3.2 Results determining EPCA-2 in serum of patient with prostate cancer by a rabbit antibody controlled with commercial kit EPCA-2 is the specific biomarker of prostate cancer Two epitopes EPCA-2:22, 2:19 have proven that appearing early and being popular in the serum of patients with prostate cancer Using specific antibody to determine EPCA-2 not only allows us to identify the disease, but also can diagnose stage of disease In this study, we used specific antibody resisted to EPCA-2.22,2.19 which we have created to determine concentration of antigen in serum of reseach groups The result is controlled to the results of the determination of the EPCA-2 of Kit ELISA (CUSABIO, codes CSB - EQ 027679HU) EPCA-2 concentrations of the two ELISA methods was quantitated based on the baseline curve of kit ELISA The baseline curve of kit ELISA was built based on concentration points with r2 = 0.986 roughly equivalent to showed that it is a reliable baseline curve to infer the concentration of the measured results Results determined EPCA-2 concentration of both ELISAmethods in our study have confirmed the presence of EPCA-2 100% in the serum of prostate cancer patients Simultaneously the majority were high EPCA-2 concentrations that range from 100ng /ml to 400 ng / ml The number of patients at this concentration level was 28/40 patients with results determined by kit ELISA, and 30/40 patients with results determined by rabbit specific antibody Simultaneously, the results in our study are similar to the results of commercial kit in detecting there were prostate cancer patients with EPCA-2 concentration at the lowest detectable level( 12,5ng / ml) Positive values obtained in our study are high because when selecting the samples for disease group, we selected patients who definitely have prostate cancer Because all patients had fully positive results with prostate cancer by method of immunohistochemistry staining multiple slices (8 to 10 slices) in the tumor after surgery from two central pathology of Friendship Hospital and Vietnam- Germany Hospital This result confirms not only the specific value of new biomarkers EPCA-2, but also the best application - value of specific antibody anti EPCA-2 in the diagnosis of prostate cancer To compare the value of the detectable concentration of EPCA-2 of two ELISA- methods We calculated the mean value of EPCA-2 concentration in 40 serum samples of prostate cancer patients that were determined parallel by ELISA- methods (ELISA- method using rabbit antibody compare with the ELISA- method using kit commercial ELISA) Results showed that the mean value of EPCA- concentration was detected by kit ELISA was higher than results were detected by rabbit antibody The mean value and the variance of the results from two ELISA-methods respectively are 279.8974 172.1579 compared to 208.658 136.651 4.3.3 Results determine EPCA-2 in serum of patients with benign prostatic hypertrophic tumor and normal male by ELISA methods To further confirm the results of the research, we selected two control groups for the study they were: group of BPHT patients, and group of normal men having the same age with the research group The reason why we chose group of BPHT patients is that by the fact that currently the tests are difficult in differential diagnosis of prostate cancer and BPHT The patients were only selected in our research group when histopathological results with staining HE were negative for prostate cancer on the tissue after removal surgery of the prostate gland The results were quite similar in both ELISA methods that 38/40 patients of BPHT group have no EPCA-2 in serum This result showed that appearing EPCA-2 is specific for prostate cancer The reason for the almost absolutee results obtained from both ELISAmethods determined EPCA-2 here is because we chose the gold standard in diagnosing prostate patients and that histopathology results is the reference basis for our study This has helped increasing the reliability of the research results Our research results are also consistent with the studies of Hansel (2009) and Barbara (2005) about the value of EPCA-2 in diagnosing prostate cancer We used the serum of 30 normal men which not have the clinical manifestations of the prostate disease, no other cancer diseases, with the same age with two groups of prostate patients for negative control The results from both ELISA methods indicate 100% serum samples of negative control group did not have the presence of EPCA- This result once again confirms the high specificity of EPCA-2 with prostate cancer as well as good specificity value of test determined EPCA-2 by rabbit specific antibody anti EPCA-2:22, 2:19 Our research results are also consistent with the measurement of the EPCA-2 concentration in Getzenbergs study that conducted in 330 men, it found that the results of the EPCA-2 test were negative in 97% of the men without prostate cancer It is consistent with the results in another study using ELISA to quantitate serum EPCA of prostate cancer patients The results obtained in this study: the test's sensitivity was 92%, the specificity was 94% The specificity of the healthy group was 100% Currently, the use of both EPCA-2 and tPSA to diagnose prostate cancer screening 4.3.4 Compare the sensitivity, specificity of ELISA methods using rabbit specific antibody anti EPCA-2.22,2.19 with antibody in the kit determined EPCA-2 of CUSABIO To consolidate data for diagnostic value of ELISA method using rabbit specific antibody anti EPCA-2, we conducted testing the sensitivity and specificity of the technique With the results that EPCA-2 was positive in 100% serum samples of prostate cancer patients, it showed that the sensitivity of the technical is 100% Simultaneously, this method also has results EPCA-2 negative in 38/40 serum samples of patients with benign prostatic hypertrophic tumor that equivalent specificity of 95% The sensitivity and specificity of ELISA method using rabbit specific antibodies anti EPCA-2 in our study were completely homologous with the sensitivity and specificity of commercial kit determine EPCA-2 of Cusabio This sensitivity and specificity were also consistent with the results of Barbara when using ELISA technique study in 385 male serum samples that obtained the results of a sensitivity and specificity, respectively 92% and 94% CONCLUSIONS We have been successful recombinant EPCA-2.22,2.19 polyepitpe activity with specific antibody By the process of induced immunization in rabbit, the project has successfully created rabbit specific antibody for EPCA-2 (with a total amount of serum rabbit obtained was 330ml and antibody concentration was 229,17ng / ml) Rabbit antibody which was created in our project has been applied initially in the ELISA sandwich technique identified EPCA-2 in prostate cancer patients Results showed that the determination of EPCA-2 by rabbit antibody has result equivalent with commercial kit of CUSABIO The antibody obtained in the project may continue to be completed and used for creating kit determinate EPCA-2 PUBLISHED SCIENTIFIC WORKS RELATED TO THESIS Dam Thi Tu Anh, Phan Mai Hoa, Ngo Thi Thu Hien, Le Minh Phuc (2013), The create rabbit specific antibody of early prostate cancer antigen (EPCA-2), Vietnam Medical Journal Dam Thi Tu Anh, Phan Mai Hoa, Le Quang Huan, Pham Thien Ngoc (2014), Determination of early prostate cancer antigen ( EPCA-2) in the serum of prostate cancer patients , Juornal of clinical medicine Ngo Thi Thu Hien, am Thi Tu Anh, Le Thi Minh Phuc, Pham Thien Ngoc, Le Quang Huan (2014), Expression of gene encoding for polyepitope of early prostate cancer antigen (EPCA-2) in Escherichia coli, Journal of clinical medicine Second Prize Conference Science Fellows [...]... với kháng thể đặc hiệu 2 Bằng qui trình gây miễn dịch trên thỏ, đề tài đã tạo thành công kháng thể thỏ đặc hiệu với EPCA-2 (với tổng lượng huyết thanh thỏ thu được là 330ml và nồng độ kháng thể là 229,17ng/ml) 3 Kháng thể thỏ do đề tài tạo ra đã được ứng dụng bước đầu trong kĩ thuật ELISAsandwich xác định EPCA-2 ở bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt Kết quả cho thấy việc xác định EPCA-2 bằng kháng thể. .. POLYEPITOPE CỦA KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT SỚM 4.1.1 Lựa chọn biểu hiện các epitope của kháng nguyên thay vì biểu hiện toàn bộ phân tử kháng nguyên Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hòa tan luôn mang tính đặc hiệu cao Sự liên kết đặc hiệu này xẩy ra với chỉ với một phần nhất định của KN Các vùng cấu trúc có sự liên kết đặc hiệu này gọi là epitope Phần tương ứngtrên mỗi kháng thể gọi là paratope... tôi đánh giá với kháng thể kháng EPCA-2 trong kít của CUSABIO Kết quả thử nghiệm thu được:sản phẩm polEPCA-2.22, 2.19 sau tinh sạch có hoạt tính kháng nguyên và có nồng độ 41,185 ng/mL, có thể sử dụng để thực hiện các bước gây miễn dịch 21 4.2.VỀ KẾT QUẢ TẠO KHÁNG THỂ THỎ ĐẶC HIỆU KHÁNG PolEPCA-2  Lựa chọn phương pháp tạo kháng thể PolEPCA-2 tiếp tục được sử dụng để tạo kháng thể đặc hiệu bằng phương... PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu của mục tiêu tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên UTTTL - Gen mã hóa KN ung thư tuyến tiền liệt sớm theo thiết kế của nhóm nghiên cứu gắn trong vector tách dòng pBSK-GS53545 được đặt hàng tổng hợp từ hãng Cosmo Genetech - Protein tái tổ hợp mang 8 lần lặp lại của hai epitope EPCA-2.22 và 2.19 đã được xác định có hoạt tính với KT đặc hiệu. .. EPCA trong huyết tươngbệnh nhân UTTTL.Kết quả thu được ở nghiên cứu này: độ nhậy của xét nghiệm là 92% độ đặc hiệu là 94% Độ đặc hiệu của nhóm người khỏe mạnh là 100% 4.3.4 So sánh độ nhậy, độ đặc hiệu của 2 phương pháp ELISA sử dụng kháng thể thỏ đặc hiệu kháng EPCA-2.22,2.19 và kháng thể trong kít xác định EPCA-2 của CUSABIO Để củng cố dữ liệu cho giá trị chẩn đoán của phương pháp ELISA sử dụng kháng. .. Lê Quang Huấn, Phạm Thiện Ngọc (2014), Xác định kháng nguyên ung thư sớm tuyến tiền liệt ( EPCA-2) trong huyết thanh bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt, Y học lâm sàng, tháng 10, 80 3 Ngô Thị Thu Hiền, Đàm Thị Tú Anh, Lê Thị Minh Phúc, Phạm Thiện Ngọc, Lê Quang Huấn (2014), Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa Polyepitop của kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt sớm (EPCA-2) trên vi khuẩn E.coli, Y học lâm... dịch trên thỏ để tạo kháng thể  Lựa chọn qui trình gây miễn dịch và thời điểm thu nhận kháng thể phù hợp Có nhiều qui trình khác nhau để gây miễn dịch tạo kháng thể Nhìn chung kết quả tạo kháng thể bằng phương pháp gây miễn dịch trên động vật phụ thuộc chủ yếu vào 3 yếu tố: (1) Bản chất của kháng nguyên (2) Đường vào của kháng nguyên (3) Thời điểm thu nhận kháng thể Trong nghiên cứu này chúng tôi... EPCA-2.22, 2.19 đã được chứng minh là xuất hiện sớm và phổ biến trong huyết thanh các bệnh nhân UTTTL Sử dụng KT đặc hiệu để xác định EPCA-2 không chỉ cho phép xác định bệnh mà còn có thể chẩn đoán giai đoạn bệnh Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng KT đặc hiệu kháng EPCA-2.22,2.19 do chúng tôi tạo ra để xác định nồng độ KN trong huyết thanh 3 nhóm nghiên cứu Các kết quả được đối chứng với kết quả xác... cho kết quả tương đương với kít thư ng phẩm của CUSABIO 4 Kháng thể thu được của đề tài có thể tiếp tục hoàn thiện và sử dụng cho việc tạo kít xác định EPCA-2 27 NHỮNG CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ 1 Đàm Thị Tú Anh, Phan Mai Hoa, Ngô Thị Thu Hiền, Lê Minh Phúc (2013), Tạo kháng thể thỏ đặc hiệu kháng kháng nguyên ung thư sớm tuyến tiền liệt (EPCA-2), Y học Việt Nam, tháng... hợp với các nghiên cứu của Thomson và Catalon cho rằng có sự tăng cao có ý nghĩa của chỉ số PSA ở những bệnh nhân UTTTL, tuy nhiên cũng có bệnh nhân UTTTL không có tăng PSA trong huyết thanh 24 4.3.2 Kết quả xác định EPCA-2 trong huyết thanh bệnh nhân ung thư tuyến tiền liệt bằng kháng thể thỏ có đối chứng với kít thư ng phẩm EPCA-2 là dấu ấn sinh học đặc trưng của tuyến tiền liệt bị ung thư Hai epitope