NGHIÊN cứu tạo KHÁNG THỂ đặc HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN đoán

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI ĐÀM THỊ TÚ ANH NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2016 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ ĐÀM THỊ TÚ ANH NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN Chuyên ngành : Dị ứng miễn dịch Mã số : 62720109 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Phạm Thiện Ngọc PGS TS Lê Quang Huấn HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực nghiên cứu tơi nhận thấy người thật may mắn dìu dắt thầy cô - học giả uyên bác lĩnh vực nghiên cứu Em muốn bầy tỏ kính trọng lời cảm ơn sâu sắc tới Phó giáo sư tiến sĩ Phạm Thiện Ngọc Phó giáo sư tiến sĩ Lê Quang Huấn - hai người thầy sẵn sàng dành tất tâm huyết nguồn lực cho học trò tơi thành công nghiên cứu Dõi theo đề tài từ ngày đầu, bảo cho nhiều ý kiến quí báu đúc kết qua bao năm nghiên cứu cô, thành công tơi có phần giúp đỡ khơng nhỏ Giáo sư tiến sĩ khoa học Phan Thị Phi Phi Em xin gửi đến cô lời cảm ơn trân trọng sâu sắc Em xin cảm ơn Phó giáo sư tiến sĩ Phạm Đăng Khoa - Chủ nhiệm môn Sinh lí bệnh-Miễn dịch, tồn thể anh chị em mơn Nơi gia đình thứ hai em gắn bó bước trưởng thành Nghiên cứu có lẽ khơng hồn tất thiếu hỗ trợ sở nghiên cứu, viện nhiều cá nhân liên quan Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến đồng nghiệp nghiên cứu viên phòng Cơng nghệ tế bào động vật - Viện hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam, TS Nguyễn Thế Trường - Trưởng khoa ngoại Bệnh viện Hữu Nghị Hà Nội, TS Nguyễn Thị Phương Ngọc - Trưởng khoa Hóa sinh Bệnh viện Hữu Nghị Hà Nội, ThS Phương Việt Trung - Trưởng phòng đạo tuyến Bệnh viện Hữu Nghị Hà Nội, CN Nguyễn Thu Hà - Khoa ngoại Bệnh viện Hữu nghị Hà Nội CN Phan Mai Hoa - Bộ mơn Sinh lí bệnh - Miễn dịch trường Đại học Y Hà Nội Hà Nội, ngày 20 tháng05 năm 2016 Đàm Thị Tú Anh LỜI CAM ĐOAN Tôi là: Đàm Thị Tú Anh, nghiên cứu sinh khóa 30 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Miễn dịch Dị ứng xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn nhà khoa học: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc PGS.TS Lê Quang Huấn Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà nội, ngày 20 tháng 05 năm 2016 Tác giả Đàm Thị Tú Anh DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CGA Chromogranin A CT (Protein chế tiết tuyến cận giáp) Computed Tomography DRE (Chụp cắt lớp) Digital Rectal Examination DBB DNA DWB E coli ELISA EPCA (Thăm khám trực tràng) Denaturing Binding Buffer Deoxyribonucleic acid Denaturing Wash Buffer Escherichia coli Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Early prostate cancer antigen HE (Kháng nguyên ung thư tuyến tiền liệt sớm) Hematoxylin Eosin HIFU (Thuốc nhuộm mô bệnh phẩm) High-Intensity Focused Ultrasound hK2 (Siêu âm tập trung cường độ cao) Hexokinase huK2 (Hexokinases phosphorylate glucose) Human glandular kallikrein IL KN KT NDV (Một protease serine) Interleukine Kháng nguyên Kháng thể Newcastle disease vius NEB (Vi rút bệnh Newcastle) Native Elution Buffer NPB (Đệm rửa giải) Native Purification Buffer NWB (Đệm phân tách) NativeWash Buffer MCS (Đệm làm sạch) Multiple Cloning Site MRI (Vùng cắt gắn đa vị) Magnetic resonance imaging OPG (Chụp cộng hưởng từ) Osteoprotegerin PSA (Yếu tố ức chế osteoclastogenesis) Prostate specific antigen PET/CT (Kháng nguyên đặc hiệu tuyến tiền liệt) Positron Emission Tomography - Computed Tomography PSCA (Chụp cắt lớp phát xạ positron) Prostate Stem Cell Antigen PBS (Kháng nguyên tế bào gốc tiền thân tuyến tiền liệt) Phosphate Buffered Saline PIN (Dung dịch đệm phosphate) Prostatic Intraepithelial Neoplasia PCR (Tân sản nội biểu mô tuyến tiền liệt) Polymerase chain reaction rNDV (Phản ứng khuếch đại chuỗi) Recombinant Newcastle disease virus (Vi rút bệnh Newcastle tái tổ hợp) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS Sodium dodecyl sulfate TTL Tuyến tiền liệt TCA Trichloroacetic acid UT Ung thư UTTTL Ung thư tuyến tiền liệt UPĐLTTTL U phì đại lành tính tuyến tiền liệt ULT Ultrasonic Tomography VEGF (Siêu âm cắt lớp) Vascular Endothelial Growth Factor (Yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu) MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình CĨ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư tuyến tiền liệt (UTTTL) mô tả lần năm 1853 Năm 1890 nhờ thủ thật gây mê đời, lần UTTTL điều trị cắt tinh hồn, hiệu khơng cao Rất nhiều thành tựu khoa học áp dụng vào điều trị UTTTL kết cho thấy hiệu điều trị UTTTL phụ thuộc vào thời điểm phát bệnh Với trường hợp ung thư (UT) giai đoạn khu trú tuyến tiền liệt (TTL), khoảng 70- 85% bệnh nhân sống đến 10 năm sau điều trị triệt để Với trường hợp u xâm lấn vỏ bao vi thể TTL, tỷ lệ sống sau năm 85% sau 10 năm 75% Còn với trường hợp khối u xâm lấn bao tuyến lan rộng, tỷ lệ sống sau năm giảm xuống 70% 10 năm 40% [1],[2],[3] Vì u cầu chẩn đốn sớm ung thư nói chung hay UTTTL nói riêng quan trọng Trước việc chẩn đoán UTTTL chủ yếu dựa vào biểu lâm sàng rối loạn hay tắc nghẽn đường niệu; Siêu âm nội soi đánh giá tình trạng, kích thước tuyến tiền liệt; Phương pháp mô bệnh học mẫu mô sinh thiết TTL Tất phương pháp chẩn đoán xác định bệnh khối u hình thành Vì vậy, phát bệnh thường giai đoạn muộn Hiện nay, công nghệ tiến tiến áp dụng ngày sâu nghiên cứu xác định chế bệnh lý khối u Các nghiên cứu chứng minh tế bào ác tính TTL tế bào ung thư nói chung hình thành tích lũy phát triển thơng qua loạt thay đổi yếu tố di truyền, biến đổi nội bào, ngoại bào yếu tố di truyền gen dẫn đến gia tăng bất thường tế bào ác tính, tăng sinh mạch, lẩn tránh apoptosis, di đến quan Đồng thời nghiên cứu phát số phân tử mới: xuất tế bào ung thư; số 10 phân tử sản xuất tế bào ung thư; số phân tử thể sản xuất phản ứng với khối ung thư Tất phân tử gọi dấu ấn phân tử Các dấu ấn phân tử có đặc điểm cung cấp thơng tin sớm đặc tính sinh học khối u định tính phương pháp mơ bệnh học, định lượng số phương pháp sinh học phân tử huyết dịch sinh học Việc xác định dấu ấn cho phép chẩn đoán sớm, đặc hiệu bệnh UTTTL Kháng nguyên (KN) sớm ung thư tuyến tiền liệt (EPCA-2) dấu ấn phân tử công nhận đặc hiệu cho UTTTL Dấu ấn có vị trí kháng ngun biết rõ trình tự phát mô dịch sinh học bệnh nhân UTTTL kháng thể (KT) đặc hiệu [4], [5] Sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát dấu ấn ung thư mô dịch sinh học có giá trị chẩn đốn sớm Hoặc sử dụng kháng thể chất dẫn đường cho thuốc chống ung thư đến tế bào ung thư cần tiêu diệt, hạn chế tác dụng không mong muốn tế bào lành hướng nhiều triển vọng Ứng dụng kháng thể chẩn đoán điều trị lĩnh vực ngày hồn thiện để ứng dụng rộng rãi Đề tài nghiên cứu thực với mục tiêu: Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên EPCA-2 tái tổ hợp Đánh giá khả ứng dụng kháng thể đặc hiệu kháng EPCA-2 chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt - Phương pháp biến đổi trình tự khơng dùng PCR Ở phương pháp trình tự DNA biến đổi liên kết với gốc tái (ví dụ plasmid, bacteriophage phagemid), cho phép khuếch đại in vivo kiểu gen bố mẹ kiểu gen sửa đổi Một oligonucleotide tổng hợp mang đột biến cần thiết gắn với khuôn mẫu ssDNA mạch vòng (ví dụ: genome phage có ssDNA M13, ФX174 dạng ssDNA phagemid), với khn mẫu dsDNA sợi đơn hóa phần Các oligonuleotide sau gắn vào ssDNA hoạt động primer cho tổng hợp in vitro DNA cách dùng enzyme DNA polymerase (thường DNA polymerase T4 T7), với enzyme DNA ligase, phân tử DNA sợi đơi (dsDNA) mạch vòng đóng tạo DNA sợi đôi đưa vào tế bào vật chủ thích hợp để tái phân chia Sau đó, biến đổi mong muốn xác định số phương thức sàng lọc chọn lọc - Phương pháp biến đổi dựa PCR.Đây phương pháp ứng dụng rộng rãi để tái xếp nhanh vùng protein nơi mà vị trí cắt hạn chế phổ biến khơng có sẵn Phương pháp thực biến đổi mong muốn khuếch đại in vitro cách ủ DNA đích biến tính với oligonucleotide mang đột biến cần thiết để hoạt động primer cho tái sợi DNA bổ sung Có nhiều cách thức khác để thực biến đổi nhiên điểm cần lưu ý chung cách thiết kế trình tự oligonucleotide, điều kiện phản ứng, lựa chọn xác DNA polymerase ổn nhiệt tiêu chuẩn phải xem xét cẩn thận Các phương thức cho phép tiến hành biến đổi nhanh hiệu cao Phát triển phân tử: Trong nhiều trường hợp biến đổi có định hướng trình tự khơng phải phương thức thích hợp để thu kết mong muốn khơng xác định acid amin đích nằm đâu biến đổi chúng thành Vì thế, số phương thức khác phát triển để sản xuất thử nghiệm thư viện lớn tập hợp biến thể trình tự đặc biệt Các phương thức thường dựa vào ba đặc điểm chính: Thứ nhất, acid nucleic mã hóa cho trình tự protein quan tâm trì liên kết vật lý với protein Thứ hai, tạo số lượng lớn biến thể cách đưa đoạn oligonucleotide thối biến vào trình tự mã hóa theo phương thức chèn đoạn dùng kỹ thuật PCR, phương thức phát sinh đột biến in vitro Tuy nhiên, với phương thức lần có đoạn nhỏ protein sửa đổi.Thứ ba, phương thức sàng lọc chọn lọc từ thư viện trình tự protein có kiểu hình quan tâm Phương thức sàng lọc bao gồm việc gắn với phối tử protein xuất giữ lại giá thể rắn Thiết kế trình tự de novo: Thiết kế de novo protein công việc phức tạp Về nguyên tắc, protein có (n) gốc acid amin khả có 2×10n trình tự khác Các sở liệu cấu trúc trình tự protein cho thấy nhiều trình tự có cuộn xoắn điều chỉnh tương tự chúng thực chức Vì thế, phương pháp tiếp cận ngược lại tức chọn cấu trúc cuộn xoắn thích hợp trước sau xác định trình tự cần thiết để tạo cuộn xoắn chức mong muốn sau cách tiếp cận thích hợp Dahiyat Mayo (1997) mơ tả phương pháp máy tính để thiết kế trình tự vùng peptide từ xây dựng protein Biểu hiện: Khi trình tự xác định, sản phẩm trình tự protein việc chứng minh chức protein cho phép đánh giá vai trò trình tự Việc tạo protein sản phẩm theo trình tự biết bước biểu cơng nghệ protein Biểu protein tái tổ hợp công việc vô phức tạp cần hệ thống biểu vật chủ phạm vi từ vi khuẩn (E.coli sử dụng phổ biến nhất), tới nấm men, tới tế bào côn trùng, tế bào động vật có vúni cấy động-thực vật chuyển gen Quy mô biểu tinh protein thay đổi khác tùy mục đích sử dụng Ở giai đoạn đầu trình phát triển protein (ví dụ phân tử protein nhận dạng thư viện biểu hiện), lượng nhỏ (μg) protein đủ để xác nhận đặc tính sinh học Nhưng giai đoạn hailà giai đoạn thu thập thông tin cấu trúc đặc trưng, cần thực thêm số thử nghiệm in vitro in vivo Nên số lượng nguyên liệu tinh cần lớn (từ 10 đến 100 mg chí đến vài kg) Vì vậy, người ta thường phải thử nghiệm số phương pháp khác để tìm kiếm vật chủ biểu thích hợp Phân tích: Có nhiều phương pháp khác để phân tích đặc điểm protein, tính chất sinh học thích hợp để phát triển sản xuất protein từ lượng nhỏ nguyên liệu ban đầu Tuy nhiên, thông tin cấu trúc chi tiết sản phẩm protein cuối bước hạn chế thiết kế triển khai cơng nghệ protein thích hợp Quá trình tách chiết tinh protein: Nhiều năm qua, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protein, đặc biệt enzyme, cải thiện đáng kể hiệu qui trình sản xuất chất lượng sản phẩm Phần lớn enzyme sử dụng công nghiệp protein ngoại bào từ thể Aspergillus sp Bacillus sp, bao gồm: amylase, glucanase, cellulase, dextranase, protease glucoamylase Nhiều loại số sản xuất từ chủng gốc tự nhiên vi sinh vật Tuy nhiên, protein để sử dụng lĩnh vực chẩn đoán lâm sàng ứng dụng trị liệu đòi hỏi cơng nghệ protein cơng nghệ DNA tái tổ hợp mức độ cao Công nghệ DNA tái tổ hợp cho phép chuyển vật liệu di truyền vốn có lượng nhỏ từ mơ động vật vào vi khuẩn vật chủ Công nghệ cho phép tận dụng sinh trưởng gần vô hạn vật chủ để sản xuất lượng lớn protein quan tâm Sự thu hồi tinh protein quan trọng giai đoạn sản xuất xét theo góc độ kinh tế q trình sản xuất Thách thức bước thu hồi giảm thiểu hoạt tính protein Với protein ngoại bào việc thu hồi tinh tương đối dễ dàng Với protein nội bào: qui trình thu hồi tinh phức tạp cần phá vỡ mơ, tế bào để giải phóng protein trước thực thu hồi tinh Có ba phương pháp để giải phóng protein nội bào khỏi vi sinh vật phương pháp enzyme, hóa học vật lý Tinh sơ bộ:tinh protein bước cần thiết, nhiên thường thực protein có giá trị ứng dụng cao Bước trình tinh protein nội bào loại bỏ mảnh vỡ tế bào Bước thường tiến hành phương pháp ly tâm lọc phân tách hai pha nước hay chất lỏng-chất lỏng Các protein mảnh vỡ tế bào có khả hòa tan khác hai pha, kỹ thuật dùng cho hai trường hợp: phân tách protein khỏi mảnh vỡ tế bào phân chia (partitioning) protein suốt trình tinh Phương pháp kết tủa cách đơn giảngiúp loại bỏ protease, tạo kết tủa chọn lọc loại bỏ protein không mong muốn Tinh sắc ký kỹ thuật phân tách điều chế cho phép tách biệt hợp phần khác hỗn hợp Phép phân tách sắc ký dựa vào di chuyển khác pha động chất hòa tan gắn pha tĩnh trạng thái rắn Người ta thường chọn chất có khả gắn kết với chất (hòa tan) định phân tách làm pha tĩnh Tương tác chất hòa tan pha tĩnh tương tác hấp phụ, tương tác ion (trao đổi ion), tương tác kỵ nước, tương tác kiểu rây phân tử tương tác đặc hiệu sinh học Tinh protein phương pháp sắc ký thực hành chuẩn phòng thí nghiệm cho phép tinh sản phẩm tích nhỏ giá trị cao Sắc ký tinh protein từ hỗn hợp phức tạp protein đạt tới tinh cuối 95% Thiết kế protein để tinh sạch: Cơng nghệ DNA tái tổ hợp có ảnh hưởng quan trọng lên tinh protein Bằng cách dung hợp gen quan tâm với trình tự promoter hiệu quả, protein ngoại lai biểu thể vật chủ từ 10 tới 40% protein tổng số hòa tan tế bào Vì vậy, trình tinh protein đơn giản hóa Các protein biểu dạng hòa tan, kỹ thuật di truyền dùng để hướng tới việc protein tổng hợp gian bào, chí môi trường nuôi cấy giúp tinh đơn giản Đuôi lực histon thiết kế xuất protein với mục đích giúp cho tinh protein enzyme hiệu theo nguyên tắc trao đổi ioncủa phân tử Ni + Khó khăn chủ yếu dung hợp lực để tinh protein phải loại bỏ thành công đuôi lực tác nhân sử dụng Vấn đề giải cắt bỏ liên kết acid không bền chỗ nối protein tái tổ hợp đuôi lực [58],[59] Sử dụng công nghệ di truyền tái tổ hợp DNA công nghệ protein ứng dụng 10 năm qua có hiệu lớn sản xuất protein vi sinh vật Ứng dụng công nghệ protein sử dụng nhiều lĩnh vực: sản xuất tá dược vắc xin, kháng thể… ... tiêu: Tạo kháng thể đặc hiệu kháng nguyên EPCA-2 tái tổ hợp Đánh giá khả ứng dụng kháng thể đặc hiệu kháng EPCA-2 chẩn đoán ung thư tuyến tiền liệt 11 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ UNG THƯ TUYẾN... GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ ĐÀM THỊ TÚ ANH NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐẶC HIỆU KHÁNG NGUYÊN UNG THƯ TUYẾN TIỀN LIỆT ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN Chuyên ngành : Dị ứng miễn dịch... đặc hiệu với UTTTL sử dụng kháng thể (KT) đặc hiệu để phát có mặt EPCA-2 qua chẩn đốn sớm UTTTL hướng nghiên cứu mong muốn chẩn đoán sớm UTTTL  Kháng nguyên tế bào gốc tiền thân tuyến tiền liệt