Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NÔNG THU HẰNG NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERONE Ngành: Chăn nuôi Mã số: 60 62 01 05 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Bá Mùi TS Cù Thị Thiên Thu NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan chưa dùng để bảo vệ lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nông Thu Hằng i LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn, nhận hướng dẫn, bảo tận tình thầy giáo, giúp đỡ, động viện bạn bè, đồng nghiệp gia đình Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Bá Mùi, TS Cù Thị Thiên Thu tận tình hướng dẫn, dành nhiều cơng sức, thời gian tạo điều kiện cho suốt trình học tập thực đề tài Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Sinh lý - Tập tính động vật, Khoa Chăn ni - Học viện Nơng nghiệp Việt Nam tận tình giúp đỡ tơi q trình học tập, thực đề tài hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tới cán viên chức Phịng thí nghiệm Khoa Chăn ni, Phịng thí nghiệm Cơng ty Cổ phần phát triển công nghệ nông thôn (RTD) giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt trình thực đề tài Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn./ Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận văn Nông Thu Hằng ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt .v Danh mục bảng vi Danh mục hình vii Trích yếu luận văn viii Thesis abstract ix Phần 1: Mở đầu 1.1 Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục đích đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực đề tài nước .3 2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu nước .3 2.2 Quá trình hình thành chức progesterone 2.2.1 Sự rụng trứng 2.2.2 Sự hình thành thể vàng 2.2.3 Động thái thể progesterone chu kỳ động dục .7 2.2.4 Thể vàng chế tiết progesterone mang thai 2.2.5 Vai trò, chức progesterone 2.3 Một số hiểu biết miễn dịch học 13 2.3.1 Miễn dịch đáp ứng miễn dịch 13 2.3.2 Các quan tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch 15 2.3.3 Kháng nguyên (Antigen) 17 2.3.4 Kháng thể 18 2.3.5 Sự kết hợp kháng nguyên kháng thể 20 2.3.6 Kháng thể đơn dòng .21 2.4 Kỹ thuật ELISA 28 Phần Đối tượng, nội dung, phương pháp nghiên cứu 30 iii 3.1 Nguyên vật liệu 30 3.1.1 Động vật thí nghiệm 30 3.1.2 Dòng tế bào ung thư tủy (Myeloma) 30 3.1.3 Các thiết bị thí nghiệm 30 3.1.4 Các hóa chất thí nghiệm 30 3.1.5 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 3.2 Nội dung 31 3.2.1 Gây miễn dịch cho chuột .31 3.2.2 Dung hợp tế bào Myeloma tế bào lympho B 31 3.2.3 Sàng lọc dòng tế bào dương tính với kháng nguyên phương pháp ELISA 31 3.2.4 Nhân giống dòng tế bào chọn lọc 31 3.2.5 Gây báng cho chuột .31 3.3 Phương pháp nghiên cứu 32 3.3.1 Phương pháp gây miễn dịch cho chuột 32 3.3.2 Phương pháp lấy tế bào LymphoB chuột 34 3.3.3 Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp2/0 34 3.3.4 Phương pháp tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng 35 3.3.5 Phương pháp sàng lọc tế bào tách dòng 36 3.3.6 Nhân giống tế bào 38 3.3.7 Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể đơn dòng 39 3.3.8 Phương pháp ELISA để sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng 40 Phần Kết quả, thảo luận 42 4.1 Đánh giá kết gây đáp ứng miễn dịch phương pháp elisa 42 4.3 Kết sàng lọc kháng thể đơn dòng 50 4.4 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng sau tách dòng 54 4.5 Nhân giống tế bào 56 4.6 Gây báng cho chuột .58 Phần Kết luận, kiến nghị 59 5.1 Kết luận 59 5.2 Kiến nghị .59 Tài liệu tham khảo 60 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa Tiếng Việt BSA Albumin huyết bò CS Cộng ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch FBS Huyết bò KN Kháng nguyên KT Kháng thể KTĐD Kháng thể đơn dòng v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Sơ đồ thí nghiệm tách dòng tế bào lai 38 Bảng 4.1 Kết đáp ứng miễn dịch chuột thí nghiệm 43 Bảng 4.2 Mẫu huyết thu từ chuột gây đáp ứng miễn dịch với Progesterone - CMO 45 Bảng 4.3 Kết lai (fusion) tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào lympho B chuột BAL b/c gây miễn dịch với kháng nguyên progesterone - CMO 49 Bảng 4.4 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên phản ứng ELISA 51 Bảng 4.5 Kết kiểm tra phương pháp ELISA giếng dương tính (Sàng lọc lần 22 giếng) 52 Bảng 4.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để sàng lọc kháng thể đơn dòng 53 Bảng 4.7 Kết sàng lọc lần (Giá trị OD) 54 Bảng 4.8 Kết dịng tế bào lai có hiệu giá tốt đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO 55 Bảng 4.9 Tính đặc hiệu kháng thể đơn dịng dòng tế bào tạo 55 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Điều hồ tiết hormone vị trí tác động chúng kỳ động dục bò Hình 2.2 Biến thiên nồng độ progesteron sau thụ tinh có kết thời điểm lấy mẫu chẩn đốn có thai .10 Hình 2.3 Công thức cấu tạo kháng thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999) 19 Hình 2.4 Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng 27 Hình 3.1 Gây miễn dịch cho chuột 33 Hình 3.2 Dung hợp tế bào đĩa ni cấy 36 Hình 3.3 Tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột 40 Hình 3.4 Thu dịch báng xoang bụng chuột 40 Hình 4.1 Tế bào Myeloma phục hồi thời gian khác 47 Hình 4.2 Tế bào lai hybridoma thu thời điểm nuôi cấy khác 48 Hình 4.3 Tế bào lai nhân giống qua thời điểm khác 57 vii TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nơng Thu Hằng Tên Luận văn: “Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng Progesterone” Ngành: Chăn nuôi Mã số: 60 62 01 05 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tạo kháng thể đơn dịng kháng progesterone ứng dụng vào việc tạo kít hay que thử nhanh chẩn đốn có thai trường hợp bất thường sinh sản bò Vật liệu phương pháp nghiên cứu - Thí nghiệm tiến hành chuột trắng dòng BAL b/c chủng - tuần tuổi, số lượng 30 tế bào Myeloma Sp2/0 - Kháng nguyên 4-pregnene-3 20-dione 3-O-Carboxymethyloxime (Progesterone - CMO), Reference Code (Q2606-000) hãng Steraloids - Mỹ cung cấp - Phương pháp tiến hành cách gây miễn dịch cho chuột kháng nguyên đặc hiệu Sau tế bào Lympho B thu dung hợp tế bào Myeloma Sử dụng phương pháp ELISA để sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng sau tách dịng, tiếp tục nhân lên với số lượng lớn để sản xuất kháng thể đơn dòng tạo dịch báng xoang bụng chuột Kết kết luận - Sử dụng kháng nguyên Progesterone - CMO gây miễn dịch cho chuột Với nồng độ 200µg/ml Progesterone - CMO cho kết đáp ứng miễn dịch tốt Đáp ứng miễn dịch thể phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch mà phụ thuộc vào cá thể động vật - Sử dụng công nghệ hybridoma, chúng tơi tạo dịng tế bào dòng 2E4 dòng 2E7 Sau dung hợp tách dịng lai tạo thành cơng dịng tế bào (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có khả sinh kháng thể đơn dòng kháng progesterone Các kết cho thấy kháng thể đơn dòng (2E4 2E7) sử dụng q trình lai tạo nhận biết progesterone hệ thống xét nghiệm chẩn đoán miễn dịch (tức ELISA) viii THESIS ABSTRACT Author: Nong Thu Hang Title: “Production of mono antibodies specific for Progesterone” Major: Animal science Code: 60 62 01 05 Educational organization: Vietnam National University of Agriculture Aims of research To produce môn antibodies specific for progesterone Applied to making kit or quick test strips for the diagnosis of pregnancy and abnormalities of reproduction in cows Materials and Methods - The experiment was carried out on 30 female mouse BAL b/c from - weeks and Myeloma Sp2/0 cells - Antibody (4-pregnene-3 20-dione 3-O-Carboxymethyloxime (Progesterone CMO), Reference Code (Q2606-000), by Steraloids - from America company - The mouses were injected by Progesterone - CMO Lympho B cells was sellected from the spleen donors and and hybrided with Myeloma Sp 2/c cells Elisa reation is used to srceen the the cells producing mono antibody specific for progesterone hormone The cells produced mono antibodies was kept in freezer to use for further study Results and discussion - Mouse immunizasion by injecting of Progesterone - CMO antigen, dose 200µg/ml the optimal immune response Body immune responseis depended on not only antigen doses but also individual - Using hybridoma technology, we developed hybrid cells producing antibodies for progesterone (2E4 and 2E7) progesterone-reactive clones (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) were obtained in two fusions, two of which proved to be progesterone specific They exhibited moderate to negligible reactivity with the other steriods when tested with ELISA The results show that the monoclonal antibodies (2E4 and 2E7) can be used efficiently in the early and sensitive digagnosis of progesterone by immune diagnostic test systems (i.e ELISA) ix đòi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn lấy từ mơi trường Để có tế bào Myeloma khỏe mạnh sẵn sàng việc dung hợp tế bào mơi trường có bổ sung 10% FBS thích hợp mơi trường ni cấy tiến hành thay thường xuyên ngày lần Hình 4.1 hình ảnh tế bào Myeloma phục hồi thời gian khác Tế bào Myeloma phục hồi Tế bào Myeloma sau 24h phục hồi Tế bào Myeloma sau 72h phục hồi Hình 4.1 Tế bào Myeloma phục hồi thời gian khác Tế bào Myeloma lúc đầu phục hồi độ phủ bám đĩa chưa nhiều, sau 72h tế bào sinh sản phát triển nhanh, độ phủ bám đĩa gần kín hết mặt đĩa Sau tiến hành dung hợp hai loại tế bào trên, nuôi cấy môi trường chọn lọc HAT HT, chúng tơi tiến hành kiểm tra tồn số giếng kính 47 hiển vi soi ngược với độ phóng đại 10 x 20 đánh dấu giếng có tế bào lai Hình 4.2 hình ảnh tế bào lai hybridoma thu thời điểm nuôi cấy khác Tế bào lai ngày tuổi Tế bào lai ngày tuổi Tế bào lai 10 ngày tuổi Tế bào lai 13 ngày tuổi (sau thay môi trường HAT mơi trường HT) Hình 4.2 Tế bào lai hybridoma thu thời điểm nuôi cấy khác Tế bào lai nuôi dưỡng môi trường HAT, lúc ngày tuổi tập trung thành đám nhỏ, sau 10 ngày tuổi sinh sôi, phát triển nhanh chiếm diện tích 70 - 80% bề mặt đĩa Đến tế bào lai 13 ngày tuổi thay môi trường ni dưỡng HAT mơi trường HT soi kính hiển vi tế bào lai phân bố khắp mặt đĩa nuôi cấy, sinh sản phát triển nhanh Trong nghiên cứu tiến hành đợt thí nghiệm khác để sản xuất tế bào lai hybridoma tiết kháng thể đơn dòng Mỗi đợt thí nghiệm, sau 48 lai (fusion) tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào Lympho B mẫn cảm kháng nguyên, tiến hành nuôi cấy tế bào đĩa nuôi cấy tế bào 96 giếng kết trình bày bảng 4.3 kết lai tế bào Myeloma Sp 2/0 tế bào Lympho B chuột BAL b/c gây miễn dịch với kháng nguyên Progesterone - CMO Bảng 4.3 Kết lai (fusion) tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào lympho B chuột BAL b/c gây miễn dịch với kháng nguyên progesterone - CMO Số lượng tế bào dùng để Số đĩa lai nuôi cấy tế bào Tổng số giếng Tổng số giếng có giếng có tế bào dùng nuôi cấy tế bào lai/giếng (đĩa 96 tế bào lai nuôi cấy tế Lần lai (fusion) Tế bào Myeoloma Tế bào lympho B Tỷ lệ % số giếng) x 10 x 10 x 10 bào 8 768 740 96,35 8 768 696 90,63 8 768 728 94,79 x 10 x 10 x 10 Sử dụng tế bào Myeloma với số lượng x 107 lai với tế bào Lympho B x 108 với tổng số giếng nuôi cấy tế bào 768 giếng qua lần lai tạo Kết bảng 4.3 cho thấy tỷ lệ lai tạo thành công tế bào lai cao, tỷ lệ giếng ni cấy có tế bào lai giao động từ 90,63 - 96,35% với số đĩa nuôi cấy tế bào dùng đĩa đĩa 96 giếng Cụ thể: - Lần lai thứ có 740/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 96,35% - Lần lai thứ hai có 696/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 90,63% - Lần lai thứ ba có 728/768 giếng ni cấy tế bào có tế bào lai, đạt 94,79% Ở lần lai thứ cho kết cao với 740/768 giếng có tế bào lai, đạt 96,35% Kết lai tế bào Myeloma Sp2/0 tế bào Lympho B chuột BAL b/c gây miễn dịch với kháng nguyên progesterone - CMO cho thấy tỷ lệ % số giếng có tế bào lai số giếng ni cấy tế bào lần lai thứ có kết cao so với lần lai thứ hai lần lai thứ ba 49 4.3 KẾT QUẢ SÀNG LỌC KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG Ni cấy tế bào môi trường HT - ngày Tiến hành kiểm tra khả tiết kháng thể đơn dòng tế bào lai để sàng lọc tế bào dương tính Đọc kết máy ELISA bước sóng 630 ŋm Để sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng mong muốn, dịch nuôi cấy tế bào tất giếng có tế bào lai thu nhận dùng cho phản ứng ELISA Trong nghiên cứu kháng nguyên dùng để gây miễn dịch cho chuột dùng để gắn ELISA (200µg/giếng) Progesterone - CMO Điều có nghĩa có khả xảy tế bào lai sinh ra, bao gồm: (1) tế bào lai tạo khơng tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu (2) tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone – CMO (3) tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên gắn BSA Để sàng lọc thu nhận tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO, hai loại kháng nguyên kháng nguyên Progesterone - CMO kháng nguyên gắn BSA sử dụng cách riêng rẽ để gắn ELISA Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng phản ứng ELISA trình bày bảng 4.4 50 Bảng 4.4 Kết sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên phản ứng ELISA Kết phản ứng ELISA Số giếng cho kết Sử dụng kháng Lần lai (fusion) Tổng số nguyên gắn Progesterone - giếng kiểm CMO tra Số giếng dương Tỉ lệ % tính Sử dụng kháng nguyên gắn BSA Số giếng dương Tỉ lệ % dương tính với Progesterone - CMO mà khơng dương tính với kháng ngun BSA Số giếng dương Tỉ lệ tính % tính 740 0,64 0,64 0 696 14 2,01 14 2,01 0 728 22 3,02 20 2,74 (2E4, 2E7)* 0,27 *2E4, 2E7 ký hiệu tên hai dòng tế bào lai cho kết dương tính với kháng nguyên Progesterone - CMO mà khơng dương tính với kháng ngun BSA Kết trình bày bảng 4.4 cho thấy, có dịng tế bào lai có hiệu giá tốt đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO Ở lần lai thứ có 5/740 giếng (0,64%) cho kết ELISA dương tính sử dụng hai loại kháng nguyên gắn riêng rẽ kháng nguyên Progesterone - CMO kháng nguyên gắn BSA Lần lai thứ có 14/696 giếng (2,01%) cho kết ELISA dương tính sử dụng hai loại kháng nguyên gắn riêng rẽ kháng nguyên Progesterone CMO kháng nguyên gắn BSA Đối với lần lai thứ có 22/728 giếng (3,02%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên Progesterone - CMO, có 20/728 giếng (2,74%) cho kết ELISA dương tính với kháng nguyên gắn BSA, điều có nghĩa số 22 giếng cho kết ELISA dương tính 20/22 (90,91%) giếng có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO có 2/22 (9,09%) giếng có kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO mà không bắt cặp chéo với kháng nguyên BSA 51 Như sau lần lai lai tạo thành công giếng (2E4, 2E7) hybridoma tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu Những giếng có hiệu giá kháng thể cao cho giá trị cao Từ kết chọn giếng có hiệu giá cao để đánh giá tiếp Bảng 4.5 Kết kiểm tra phương pháp ELISA giếng dương tính (Sàng lọc lần 22 giếng) STT Tên Giếng Progesterone - CMO BSA 1C3 1.163 0.332 1D8 1.045 0.320 1F12 1.352 0.619 2E4 1.09 0.042 2E7 1.234 0.058 2F8 1.125 0.493 2G10 1.273 0.512 3A6 1.235 0.482 3C9 1.008 0.544 10 3C10 1.128 0.698 11 4B12 1.013 0.480 12 4D6 1.115 0.723 13 5E6 1.122 0.452 14 5F11 1.281 0.842 15 5H11 1.212 0.523 16 6C4 1.104 0.711 17 6D9 1.105 0.802 18 6D11 1.005 0.347 19 7B2 1.03 0.712 20 7G5 1.106 0.623 21 8H1 1.117 0.442 22 8H3 1.028 0.527 23 ĐC (-) 0.053 0.051 Sau sàng lọc lần đầu khoảng 24h, tiến hành sàng lọc kháng thể đơn dòng với BSA phương pháp ELISA tương tự sàng lọc lần Ở lần sàng lọc chọn giếng có tế bào lai có kết tốt lần Tuy nhiên bố trí thí nghiệm gắn kháng nguyên song song kháng nguyên Progesterone - CMO kháng nguyên BSA 52 Pha loãng kháng nguyên Progeaterone - CMO tới nồng độ 2µg/ml dung dịch Bicarbonate BSA đạt nồng độ 2µg/ml PBS 1x Vortex mạnh để có dung dịch đồng Dùng pipet đa kênh cho 100 µl kháng nguyên Progesterone - CMO BSA pha loãng vào giếng đĩa ELISA trình bày bảng 4.6 sau: Bảng 4.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm để sàng lọc kháng thể đơn dòng A CMO BSA CMO BSA CMO BSA B CMO BSA CMO BSA CMO BSA Giếng A1 (CMO), giếng A2 (BSA), giếng A3 (CMO), giếng A4 (BSA), giếng A5 (CMO), giếng A6 (BSA)… Giếng B1 (CMO), giếng B2 (BSA), giếng B3 (CMO), giếng B4 (BSA), giếng B5 (CMO), giếng B6 (BSA)… Đọc kết máy ELISA bước sóng 630 ŋm Kết sàng lọc kháng thể đơn dịng trình bày bảng 4.7 Bảng 4.7 cho thấy, giếng cho kết tốt giếng cho hiệu giá kháng thể cao với kháng nguyên Progesterone - CMO không đặc hiệu với BSA - Tên giếng đặt theo vị trí đĩa nuôi cấy chứa chúng - Giếng 2E4 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO (1,104) không đặc hiệu với BSA (0,052) - Giếng 2E7 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO (1,204) khơng đặc hiệu với BSA (0,051) - 20 giếng cịn lại tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO BSA Như có giếng tế bào giếng 2E4 giếng 2E7 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO không đặc hiệu với BSA Do giếng có nhiều nhóm tế bào khác nhau, có nhóm tiết kháng thể đơn dịng, có nhóm khơng tiết nên chúng tơi tiếp tục tiến hành tách dòng tế bào lai để thu dòng tế bào tốt 53 Bảng 4.7 Kết sàng lọc lần (Giá trị OD) STT Tên Giếng 1C3 Progesterone 3-CMO 1.109 BSA 0.435 1D8 1.135 0.389 1F12 1.352 0.639 2E4 1.104 0.052 2E7 1.204 0.051 2F8 1.159 0.593 2G10 1.093 0.622 3A6 1.105 0.432 3C9 1.114 0.584 10 3C10 1.138 0.598 11 4B12 1.009 0.439 12 4D6 1.102 0.923 13 5E6 1.139 0.482 14 5F11 1.109 0.942 15 5H11 1.125 0.523 16 6C4 1.024 0.621 17 6D9 1.098 0.302 18 6D11 1.108 0.547 19 7B2 1.132 0.612 20 7G5 1.159 0.823 21 8H1 1.017 0.482 22 8H3 1.134 0.526 23 ĐC (-) 0.053 0.051 4.4 KẾT QUẢ KIỂM TRA HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG SAU KHI TÁCH DÒNG Khi xác định giếng chứa tế bào tiết kháng thể đơn dịng đặc hiệu, chúng tơi tiến hành tách dòng tế bào Trong giếng tế bào, có nhóm tế bào tiết kháng thể đơn dòng sinh trưởng đồng thời với nhóm tế bào khơng tiết kháng thể đơn dịng Do vậy, việc tách dòng tế bào giúp hiệu giá kháng thể cao Sau - ngày tách dịng, quan sát rõ nhóm tế bào giếng ni cấy Chọn lọc giếng có nhóm tế bào để đánh giá hiệu giá phương pháp ELISA (sử dụng kháng nguyên Progesterone CMO BSA) 54 Chọn lọc dịng tế bào sinh kháng thể có tính đặc hiệu độ nhạy cao Để khẳng định tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng kháng progesterone dòng tế bào thu trên, tiến hành kiểm tra phương pháp ELISA Bảng 4.8 Kết dịng tế bào lai có hiệu giá tốt đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO Tên Dòng Progesterone - CMO BSA 2E4C5 2E4F6 1.109 1.135 0.054 0.049 2E4G8 2E7D2 1.352 1.104 0.056 0.052 2E7H6 1.204 0.051 ĐC (-) 0.050 0.052 Bảng 4.8 cho thấy, dòng tế bào lai (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có hiệu giá tốt đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone CMO Từ dòng tế bào này, tiến hành nhân giống với số lượng lớn để bảo quản Kiểm tra tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng sinh kiểm tra khả kết hợp kháng thể đơn dòng với kháng nguyên chất khác có cấu trúc phân tử tương tự progesterone có huyết hormone steroid progesterone, estradiol, pregnenolon Ngoài progesterone máu động vật cịn có hormone steroid có cấu tạo hóa học gần giống progesterone Chúng dùng kháng thể đơn dòng thu thử nghiệm với đại diện nhóm kháng nguyên có cấu tạo hóa học gần giống progesterone nói thu kết qua bảng 4.9 sau: Bảng 4.9 Tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng dòng tế bào tạo STT Kháng nguyên Dòng tế bào Progesterone Estradiol Pregnenolon 2E4C5 + - - 2E4F6 + + - 2E4G8 2E7D2 + + - + + 2E7H6 + + - (+) dương tính; (-) âm tính 55 Kết bảng 4.9 cho thấy: - Các dòng tế bào 2E4G8 2E7D2 cho kết dương tính với loại kháng nguyên progesterone, pregnenolon - Dòng tế bào 2E4F6, 2E7H6 cho kết dương tính với loại kháng ngun progesterone, estradiol - Dịng tế bào 2E4C5 cho kết dương tính với progesterone âm tính với Estradiol, pregnenolon Kháng thể dịng tế bào sinh có tính đặc hiệu cao, chúng phân biệt loại hormone gần giống với progesterone kháng đặc hiệu với progesterone - Kháng thể dòng (2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) tế bào sinh có tính đặc hiệu khơng cao, khơng phân biệt loại hormone gần giống với progesterone với dạng hormone gần giống với chúng - Kháng thể đơn dịng kháng thể có khả kết hợp đặc hiệu với loại kháng nguyên mà không kết hợp với loại kháng nguyên khác cho dù chúng có cấu tạo hóa học gần giống với kháng ngun Một dịng tế bào có chất lượng cao ngồi khả sinh kháng thể có tính đặc hiệu cao cần phải có sức sống tốt, khả sinh kháng thể nhiều, từ đảm bảo tạo lượng lớn kháng thể quy mô công nghiệp, đủ để phục vụ nhu cầu sản xuất thực tế Dựa vào kết kiểm tra tính đặc hiệu khả phát triển dòng tế bào, chúng tơi chọn dịng 2E4C5 có tính đặc hiệu cao, tiếp tục nhân nuôi thu dịch nổi, lưu giữ tế bào Ni tơ lỏng gây báng cho chuột nhằm thu lượng kháng thể cao 4.5 NHÂN GIỐNG TẾ BÀO Từ giếng chứa dòng tế bào tách dịng, chúng tơi tiếp tục nhân lên số lượng lớn để tiến hành cất giống tế bào tạo dịch báng xoang bụng chuột Để bảo quản tế bào thời gian dài, tiến hành cất giống tế bào bảo quản Ni tơ lỏng Khi quan sát kính hiển vi thấy tế bào bám 80 - 90% diện tích bề mặt đáy chai ni cấy tiến hành cất giống tế bào 56 Tế bào lai chuyển đĩa, Tế bào lai sau 36h nuôi cấy chai nuôi Tế bào lai sau 72h ni cấy Hình 4.3 Tế bào lai nhân giống qua thời điểm khác Nhân giống tế bào trình bày phần phương pháp Từ đĩa 24 giếng có 1ml môi trường DMEM 10% hỗn dịch tế bào nuôi tủ ấm có bổ sung CO2 Sau đến ngày lượng tế bào giếng đĩa 24 giếng nhân lên số lượng đạt 90 đến 100% bề mặt đĩa 57 Tiến hành cấy chuyển tiếp sang đĩa giếng có sẵn 3ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào nuôi cấy tủ ấm có bổ sung CO Sau đến ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T25 có sẵn 4ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào ni cấy tủ ấm có bổ sung CO Sau đến ngày, cấy chuyển tiếp sang chai T75 có sẵn 4ml mơi trường DMEM 10% FBS, hỗn dịch tế bào nuôi cấy tủ ấm có bổ sung CO2 Hình 4.3 tế bào lai nhân giống qua thời điểm khác ta thấy: Lúc tế bào lai chuyển qua đĩa, chai ni cấy tế bào lai nằm rải rác chiếm diện tích 5% bề mặt đáy chai nuôi cấy, sau 36h nuôi cấy, tế bào lai ni dưỡng, sinh sản, phát triển nhanh chóng chiếm diện tích 40 - 50 % bề mặt đáy chai ni cấy, sau 72h nuôi cấy tế bào lai bám 80 - 90% diện tích bề mặt đáy chai ni cấy, lúc sử dụng cho thí nghiệm tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột 4.6 GÂY BÁNG CHO CHUỘT Kháng thể đơn dịng thu nhận từ dịch chai nuôi tế bào lai Theo Karsten Rudloph, 1985 ta thu nhận kháng thể cao từ 100 đến 1000 lần tiêm tế bào lai vào xoang bụng chuột, tiêm pristane Sau khoảng - 12 ngày thu dịch báng Trong thí nghiệm này, thực tiêm tế bào lai 2E4C5 vào xoang bụng chuột trình bày phần phương pháp, sau 10 ngày bụng chuột có báng to lên ta thu dịch báng Đã gây báng thành công chuột (chuột AA1, chuột AA6, chuột AA8 tổng số 10 chuột) Kết thu sau lần lấy dịch báng chuột 6ml/con/lần, từ - lần/con 58 PHẦN KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu rút số kết luận sau: - Sử dụng kháng nguyên Progesterone - CMO gây miễn dịch cho chuột Với nồng độ 200µg/ml Progesterone - CMO cho kết đáp ứng miễn dịch tốt Đáp ứng miễn dịch thể phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên gây miễn dịch mà phụ thuộc vào cá thể động vật - Tạo dòng tế bào dòng 2E4 dòng 2E7 tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho kháng nguyên Progesterone - CMO không đặc hiệu với BSA - Sau dung hợp tách dòng lai tạo thành cơng dịng tế bào (2E4C5, 2E4F6, 2E4G8, 2E7D2, 2E7H6) có khả sinh kháng thể đơn dịng kháng progesterone - Trong dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng chọn lọc dòng tế bào 2E4C5 có khả sinh sản tốt, kháng thể có tính đặc hiệu hiệu giá kháng thể cao nhân nuôi gây báng cho chuột bảo quản nitơ lỏng - Đã gây báng thành công chuột (chuột AA1, chuột AA6, chuột AA8 tổng số 10 chuột) lượng báng thu trung bình 6ml/con/lần 5.2 KIẾN NGHỊ Quy trình sản xuất kháng thể đơn dịng gồm nhiều giai đoạn khác nhau, việc sử dụng phương pháp ELISA để sàng lọc, kiểm tra, đánh giá kháng thể đơn dòng cần thiết thực đem lại hiệu Tuy nhiên để hoàn thành bước quy trình có kháng thể đơn dòng chất lượng cao đáp ứng việc tạo Kit định lượng progesterone cần phải nghiên cứu sâu Đề tài có kết bước đầu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone suất cao, chất lượng tốt Với kết mong muốn tiếp tục nghiên cứu với cấu trúc kháng ngun khác tối ưu hóa qui trình tạo kháng thể đơn dòng 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt: Chung Anh Dũng cs (2001) Ứng dụng kỹ thuật RIA để định lượng progesterone huyết bò Đỗ Phương Liên (1999) Miễn dịch học sở NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội, Hà Nội Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng Lê Trần Bình (2008) Tạo dịng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 6(2) tr 203-208 Đỗ Kim Tuyên (1995) Nghiên cứu gây siêu nỗn bị sử dụng FSH Prostaglandin F2α Luận án phó Tiến sĩ khoa học Nơng nghiệp Lê Văn Thọ Lê Xuân Cương (1979) Kích dục tố ứng dụng chăn nuôi NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Bá Mùi Đinh Văn Bình (2006) Khả sinh sản số giống dê nhập nội Tạp chí khoa học kỹ thuật nơng nghiệp Trường đại học nông nghiệp I, Hà Nội tr.126-130 Nguyễn Đỗ Quyên (2004) Một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình sản xuất kháng thể đơn dịng Luận án Tiến sĩ khoa học y dược Nguyễn Như Thanh (1997) Miễn dịch học Thú y NXB Nông Nghiệp, Hà Nội tr 7-10, 40-45 Nguyễn Xuân Tịnh, Tiết Hồng Ngân, Nguyễn Bá Mùi Lê Mộng Loan (1996) Sinh lý học gia súc NXB Nông nghiệp, Hà Nội 10 Nguyễn Đăng Tường cs (1982) Sinh lý học tập II, NXB Học viện Quân Y 11 Phan Văn Kiểm Nguyễn Bá Mùi (2005) Định lượng progesteron máu, góp phần đánh giá tình trạng sinh sản đàn bị sữa Tạp chí khoa học kỹ thuật nơng nghiệp Trường đại học nông nghiệp I, Hà Nội tr 130-134 12 Phan Văn Kiểm, Trịnh Quang Phong, Nguyễn Quý Quỳnh Hoa Tăng Xuân Lưu (2003) Ứng dụng kết nghiên cứu hàm lượng progesteron để chẩn đoán điều trị rối loạn sinh sản bò sữa Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, Hà Nội tr.708-711 60 13 Trần Tiến Dũng, Dương Đình Long Nguyễn Văn Thanh (2002) Sinh sản gia súc NXB Nông Nghiệp, Hà Nội 14 Trịnh Hữu Hằng Đỗ Công Huỳnh (2006) Sinh lý học người động vật, tập II NXB Đại học quốc gia Hà Nội, Hà Nội Tài liệu Tiếng nước ngoài: 15 Baruselli P.S., E.L.Reis, M.O.Marques, L.F.Nasser and G.A Bób (2004) The use of hormonal treatments to improve reproductive performance of anestrous beef cattle in tropical climates, Animal Reproduction Science pp.479-486 16 John H Kirk et al., (1999) Review of Reproductive Hormones For Dairy Cows, Veterinary Medicine Extension, University of California, Davis 17 Köhler G and C Milstein (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity Nature 256 (5517) pp.495 18 Maurice J Sauner, John A Foulkes and Alan D Cookson (1981) Direct enzyme immunoassay of progesteron in bovine milk Steroids, volume 38, number UK pp.45-52 19 Nakao T, A Sugihashi, N Saga, N Tsunda and K Kawata (1983) An improved Enzyme immunoassay of progesterone applied to bovine milk Br veterinary japan pp.109-117 20 Sauerwein H., B.H.Breier, B.W Gallaher et al., (2000) Growth hormone treatment of breeding bulls used for artificial insemination improves fertilization rates Domestic Animal Endocrinology, v.18 pp.145-158 21 Schwaber J and E.P Cohen (1973) Human x mouse somatic cell hybrid clone secreting immunoglobulins of both parental types Nature 244 (5416) pp.444-447 22 Van De Weil D.F.M and W Koops (1986) Development and validation of an Enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma Annimal Reproduction Sience pp.201-203 23 Wu L.S, I.C Guo and J.H Lin (1997) Pregnancy diagnosis on sows by using an on farm blood progesterone test Asia- Australasian journal of Animal Science pp.603-608 61 ... văn: ? ?Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng Progesterone? ?? Ngành: Chăn nuôi Mã số: 60 62 01 05 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Mục đích nghiên cứu Tạo kháng thể đơn dịng kháng progesterone. .. thuật ELISA, tiến hành đề tài ? ?Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone? ?? 1.2 MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI Tạo kháng thể đơn dịng kháng progesterone ứng dụng vào việc tạo kít hay que thử nhanh chẩn... tính đặc hiệu lực KN - KT cao Kháng thể dòng tế bào tạo gọi kháng thể đơn dòng (KTĐD) Sản xuất kháng thể đơn dòng theo công nghệ Hybridoma Nguyên lý sản xuất kháng thể đơn dịng theo cơng nghệ hybridoma