Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng alpha fetoprotein người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ PHAN NGỌC TIẾN NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN NGƯỜI LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC TP Hồ Chí Minh – Năm 2009 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ Y TẾ PHAN NGỌC TIẾN NGHIÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG ALPHA-FETOPROTEIN NGƯỜI Chuyên ngành: Sinh lý học Mã số: 62 72 04 05 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS PHẠM ĐÌNH LỰU TP Hồ Chí Minh – Năm 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa công bố công trình khác PHAN NGỌC TIẾN MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Lời camđđoan Mục lục Danh mục kí hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khaùng theå 1.2 Kháng thể đơn dòng 15 1.3 Đại cương Alpha-fetoprotein 28 Chương 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha-fetoprotein người 40 2.2 Đánh giá kháng thể đơn dòng kháng AFP người sản xuất từ chuột Lou 53 2.3 Ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng AFP người tạo định lượng nồng độ AFP huyết 57 Chương 3: KẾT QUẢ 65 3.1 Kết tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng Alphafetoprotein 65 3.2 Đánh giá kháng thể đơn dòng kháng AFP người sản xuất từ chuột Lou 79 3.3 Kết ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng AFP người tạo định lượng nồng độ AFP huyết 85 Chương 4: BÀN LUẬN 101 KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ 119 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 121 TÀI LIỆU THAM KHẢO 122 PHUÏ LUÏC 135 PHUÏ LUÏC 138 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ab: Antibody Ag: Antigen AFP: Alpha-fetoprotein AFP-L: hệ thống định lượng AFP sử dụng kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột LOU FTi3-1-A8: lần thực kỹ thuật hoà hợp tế bào lần thứ 3, đóa nuôi cấy thứ 3, vị trí giếng A8 FTi3-3-B4-H6: lần thực kỹ thuật hoà hợp tế bào lần thứ 3, đóa nuôi cấy thứ 3, vị trí giếng A8, vị trí giếng H6 có tế bào sau pha loãng giới hạn Ig: Immunoglobulin KN: Kháng nguyên KT: Kháng thể MARG1: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma1 chuột cống MARG2a: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2a chuột cống MARG2b: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2b chuột cống MARG2c: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nặng gamma 2c chuột cống MARL: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ lamda chuột cống MARK: kháng thể chuột nhắt kháng chuỗi nhẹ kappa chuột cống DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Các đặc tính lớp kháng thể 13 Bảng 1.2: Các đặc tính lớp kháng thể chuột cống LOU 16 Bảng 1.3: Các dòng tế bào ung thư để tạo tế bào lai 21 Bảng 1.4: Các giá trị nồng độ AFP huyết xác định kỹ thuật MEIA đối tượng bệnh lý người bình thường 37 Bảng 1.5: Tương quan mức tăng AFP máu mẹ với nguy thai bị dị tật 38 Bảng 2.6: Sơ đồ nồng độ AFP chuẩn từ 0-500ng/ml 55 Bảng 2.7: Sơ đồ nồng độ thấp từ 0-5ng/ml AFP chuẩn 56 Bảng 2.8: Sơ đồ thứ tự mẫu huyết định lượng AFP AFP-L 60 Bảng 2.9: Sơ đồ thứ tự mẫu huyết định lượng AFP hệ thống định lượng AFP hãng MaximBiotech 62 Bảng 3.10: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy 67 Bảng 3.11: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy 68 Bảng 3.12: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy 69 Bảng 3.13: Kết mật độ quang đóa nuôi cấy 70 Bảng 3.14: Kết định isotype kháng thể giếng có tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng AFP, sử dụng kháng nguyên AFP Viện Pasteur Tp.HCM 72 Baûng 3.15: Kết đơn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng AFP 73 Bảng 3.16: Kết phản ứng kháng thể đơn dòng với AFP hãng Calbiochem 79 Bảng 3.17: Kết mật độ quang (DO) tương ứng với nồng độ AFP AFP-L 80 Bảng 3.18: Kết mật độ quang (DO) tương ứng với giá trị thấp nồng độ AFP, cuûa AFP-L 83 Bảng 3.19: Kết nồng độ AFP mẫu huyết định lượng hệ thống định lượng AFP-L 85 Bảng 3.20: Giá trị trung bình nồng độ AFP mẫu huyết hệ thống định lượng AFP dựa kháng thể đơn dòng kháng AFP chuột Lou 86 Bảng 3.21: Kết DO tương ứng với nồng độ AFP chuẩn hãng Maxim Biotech 87 Bảng 3.22: Kết nồng độ AFP mẫu huyết định lượng hệ thống định lượng AFP cuả hãng Maxim Biotech 88 Bảng 3.23: Giá trị trung bình nồng độ nồng độ AFP mẫu huyết định lượng hệ thống định lượng AFP cuả hãng Maxim Biotech 89 Bảng 3.24: Kết nồng độ AFP mẫu huyết định lượng hệ thống định lượng AFP hãng Abbott 90 Bảng 3.25: Giá trị trung bình nồng độ AFP mẫu huyết định lượng hệ thống định lượng AFP hãng Abbott 91 Bảng 3.26 a: Bảng kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết hai hệ thống định lượng AFP-L vaø Maxim Biotech 92 Bảng 3.26 b: Bảng so sánh kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết hai hệ thống định lượng AFP-L Maxim Biotech 93 Bảng 3.27: Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết u gan hai hệ thống định lượng AFP-L Maxim Biotech 94 Bảng 3.28: Bảng so sánh nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết hai hệ thống định lượng AFP-L vaø Abbott 95 Bảng 3.29 a: Bảng kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết u gan hai hệ thống định lượng AFP-L Abbott 97 Bảng 3.29 b: Bảng so sánh kết nồng độ AFP (ng/ml) mẫu huyết u gan hai hệ thống định lượng AFP-L Abbott 97 Bảng 4.30: Các dòng tế bào ung thư để tạo tế bào lai 101 Bảng 4.31: Chuột LOU/C allotype chuỗi nhẹ kappa 106 Bảng 4.32: So sánh với hệ thống định lượng AFP 111 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Sự di chuyển lớp kháng thể điện di protein Hình 1.2: Cấu trúc lónh vực chuỗi nặng chuỗi nhẹ Hình 1.3: Cấu trúc phân tử kháng thể Hình 1.4: Cấu trúc phân tử AFP người 29 Hình 1.5: Cấu trúc phân tử AFP Albumin người 29 Hình 3.6: Tạo khối u tế bào lai ổ bụng chuột 74 Hình 3.7: Tạo dịch báng ổ bụng chuột 74 Hình 3.8: Điện di protein dịch báng ổ bụng chuột lần 75 Hình 3.9: Điện di protein dịch báng ổ bụng chuột lần 75 Hình 3.10: Điện di protein dịch báng ổ bụng chuột lần 76 Hình 3.11: Máy sắc ký 77 Hình 3.12: Kháng thể đơn dòng kháng AFP bảo quản 78 Biểu đồ 3.1: Đường biểu diễn kết sắc ký 77 Biểu đồ 3.2: Giá trị trung bình nồng độ AFP hai hệ thống định lượng AFP-L Maxim Biotech nhóm người bình thường 98 Biểu đồ 3.3: Giá trị trung bình nồng độ AFP hai hệ thống định lượng AFP-L Maxim Biotech nhóm người có HBsAg (+) 99 Biểu đồ 3.4: Giá trị trung bình nồng độ AFP ba hệ thống định lượng AFP-L, Maxim Biotech Abbott ởû nhóm người viêm gan siêu vi B cấp 100 Bieåu đồ 4.5: Kết sắc ký lực dùng kháng thể đơn dòng kháng kháng thể đơn dòng chuột cống 108 Sơ đồ1.1: Sản xuất kháng thể đơn dòng 15 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 126 33 Aitken D.A., Wallace E.M., Crossley J.A., (1996), “Dimeric inhibin-A as a marker for Down’s syndrome in early pregnancy”, New England of Journal Medicine, pp 1231-1236 34 Aitken D.A., McCaw G., Crossley J.A (1993), “First-trimester biochemical screening for fetal chromosome abnormalities and neural tube defects”, Prenatal Diagnosis, (13), pp 681–689 35 Annual report of International Agency for Research on Cancer (1969), Lyon 36 Alpert E., Hershberg R., Schur P.H (1971), Alpha-fetoprotein in human hepatoma, Improved detection in serum and quatitative studies using a new sensitive techniques, USA 37 Audibert F., Dommergues M., Benattar C., Taieb J., Thalabard J.C., Frydman R (2001), “Screening for Down’s syndrome using firsttrimester ultrasound and second-trimester maternal serum markers in a low-risk population: a prospective longitudinal study”, Ultrasound Obstetric Gynecology, pp 26–31 38 Ball O., Rose E., Alpert E (1990), “Biological variation of Alphafetoprotein levels in normal adults”, Gastrenterology, 98, pp 273 39 Bazin H (1990), Rat hybridomas and rat monoclonal antobodies, CRC press, pp 6-191 40 Benn P.A., Clive J.M., Collins R (1997), “Medians for second-trimester maternal serum alpha-fetoprotein, human chorionic gonadotropin, and unconjugated estriol; differences between races or ethnic groups”, Clinical Chemistry, pp 333–337 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 127 41 Bogart M., Pandian M.R., Jones O.W (1987), “Abnormal maternal serum chorionic gonadotropin levels in pregnancies with fetal chromosome abnormalities”, Prenatal Diagnosis, pp 623-630 42 Canick J., Knight G.J., Palomaki G.E., (1998), “Low second trimester maternal serum unconjugated estriol in pregnancies with Down’s syndrome”, British Journal of Obstetric Gynaecology, pp 330-333 43 Chao A S., Chung C L., Wu C D., Chang S D., Cheng P J C., Lin Y T., Soong Y K (1999), “Second trimestermaternal serum screening using alpha fetoprotein, free beta human chorionic gonadotropin and maternal age specific risk: Result of chromosomal abnormalities detected in screen positive for Down syndrome in an Asian population”, Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica’, pp 393397 44 Christiansen M., Oxvig C., Wagner J.M (1999), “The proform of eosinophil major basic protein: a new maternal serum marker for Down syndrome”, Prenatal Diagnosis, pp 905–910 45 Cuckle H.S., Holding S., Jones R (1996), “Combining inhibin A with existing second trimester markers in maternal serum screening for Down’s syndrome”, Prenatal Diagnosis, pp 1095-1100 46 Cuckle H (1995), “Improved parameters for risk estimation in Down’s syndrome screening”, Prenatal Diagnosis, pp 1057–1065 47 Gillepsie J R., Uversky V N (2000), “Structure and function of αfetoprotein: a biophysical overview”, Biochimica et Biophysica Acta, Elsevier, 1480, 41-56 48 Harrison T.R (1993), Principles of internal medicine, 12th Edition, Vol 2, pp.1381-1383 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 128 49 Herman A., Weinraub Z., Dreazen E (2000), “Combined firsttrimester nuchal translucency and second-trimester biochemical screening tests among normal pregnancies”, Prenatal Diagnosis, pp 781–784 50 Hook E.A., Mutton D.E., Ide R., Alberman E., Bobron M (1995), “The natural history of Down’s syndrome conceptuses diagnosed prenatally that are not electively terminated”, American Journal of Human Genetics, pp 875–881 51 Hsieh T.T., Hsu J.J., Chen C.P (1995), “Down’s syndrome screening with AFP and free b hCG: an analysis of the influence of Chinese ethnic origin on screening parameter”, American Journal of Human Genetics, p 1632 52 Hsu J.J., Hsieh T.T., Hsieh F.J (1996), “Down syndrome screening in an Asian population using alpha-fetoprotein and free bhCG: a report of the Taiwan Down Syndrome Screening Group”, Obstetric Gynecology, pp 943–947 53 Hsu J.J., Hsieh T.T., Soong Y.K., Spencer K (1997), “Comparison of Down’s syndrome screening strategies in Asians combining serum free beta-hCG and alpha-fetoprotein with maternal age”, Prenatal Diagnosis, pp.707–716 54 Johnson A.M., Palomaki G.E., Haddow J.E (1990), “Maternal serum afetoprotein levels in pregnancies among black and white women with fetal open spina bifida: a United States collaborative study”, American Journal of Obstetric Gynecololy, pp 328–331 55 Kemeny D.M (1991), A practiceal guide to Elisa, Department of Allergy Guy’s Hospital, London Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 129 56 Ko T.M., Tseng L.H., Hwa H.L (1996), “Cytogenetic analysis of amniotic fluid cells in 10,000 samples” Journal of Obstetrics and Gynecology Republic of China, pp 153–158 57 Kohler G (1984), “Derivation and diversification of monoclonal antibodies”, Nobel lecture, pp 228 -231 58 Kuppermann M., Feeny D., Gates E., Posner S.F., Blumberg B., Washington A.E (1999), “Preferences for women facing a prenatal diagnostic choice: long-term outcomes matter most”, Prenatal Diagnosis, pp 711–716 59 Lambert-Messerlian G.M., Canick J.A., Palomaki G.E (1996), “Second trimester levels of maternal serum inhibin-A, total inhibin, inhibin precursor and activin in Down’s syndrome pregnancies”, Journal of Medicine Screen, pp.58- 62 60 Masseyeff R.F., Albert W H., Staines N.A (1993), Method of Immunological Analysis, Volume Sample and Agent, VCH 61 Maxim Biotech (2004), “Alpha-fetoprotein Enzyme Immunoassay test kit”, Catalog number: DP-1001, LA, USA 62 Merkatz I.R., Nitowsky H.M., Macri J.N (1984), “An association between low maternal serum alpha-fetoprotein and fetal chromosome abnormalities”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 886894 63 Michailidis G.D., Spencer K., Economides D.L (2001), “The use of nuchal translucency measurement and second trimester biochemical markers in screening for Down’s syndrome”, British Journal of Obstetric Gynaecology, pp 1047–1052 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 130 64 Mizejewski G.J (2001), “Alpha-fetoprotein Structure and Function: Relevance to Isoforms, Epitopes, and Conformational Variants”, Experimental Biology and Medicine, pp 307-408 65 Norgaard-Pedersen B., Alfthan H., Arends J (1994), “A new simple and rapid dual assay for AFP and free beta hCG in screening for Down’s syndrome”, Clinical Genetics, pp 1–4 66 Ochshorn Y., Kupferminc M.J., Wolman I., Orr-Urtreger A., Jaffa A.J., Yaron Y (2001), “First trimester PAPP-A in the detection of nonDown’s syndrome aneuploidy”, Prenatal Diagnosis, pp 547–549 67 O’Brien J.E., Dvorin E., Drugna A., Johnson M.P., Yaron Y., Evans M.I (1997), ”Race-ethnicity specific variation inmultiplemarker biochemical screening: alpha-fetoprotein, hCG and estriol” Obstetric Gynecololy, pp 355–358 68 Onda T., Kitagawa M., Takeda O (1996), “Triple marker screening in native Japanese women” Prenatal Diagnosis, pp 713–717 69 Organon Teknika (1991), “Microelisa principles, Miroelisa trouble shooting manual, Germany 70 Palomaki G.E., Knight G.J., McCarthy J.E (1997), “Maternal serum screening for Down syndrome in the United States: a 1995 survey”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 1046-1051 71 Palomaki G.E., Haddow J.E., Knight G.J (1995), “Risk-based prenatal screening for trisomy 18 using alpha-fetoprotein, unconjugated oestriol and human chorionic gonadotropin”, Prenatal Diagnosis, pp 713–723 72 Pettersson K., Alfthan H., Stenman U.H (1993), “Simultaneous dual-label assay of alpha-fetoprotein and free beta subunit of human chorionic Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 131 gonadotropin by time resolved detection of fluorescent europium and samarium chelates”, Clinical Chemistry, (39) pp 2084–2089 73 Qin Q.P., Christiansen M , Nguyen T.H., Sørensen S., Larsen S.O., Nørgaard-Pedersen B (1997), “Schwangerschaftsp protein (SP1) as maternal serum marker for Down’s syndrome in first and second trimester”, Prenatal Diagnosis, pp 101–108 74 Roger N Taylor, Vincent A Przybyszewski, Edith Gary (1983), “Proficiency Testing Survey for Serum Alpha-Fetoprotein”, Journal of clinical microbiology, vol 17 (1), pp 100-105 75 Salonen R., Turpeinen U., Kurki L (1997), ”Maternal serum screening for Down’s syndrome on a population basis”, Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica, pp 817–821 76 Schuchter K., Hafner E., Stangl G., Ogris E., Philipp K (2001), “Sequential screening for trisomy 21 by nuchal translucency measurement in the first trimester and maternal serum biochemistry in the second trimester in a low-risk population”, Ultrasound Obstetric Gynecology, pp 23–25 77 Sell S (1985), Alpha-fetoprotein in cancer marker Sell S (ed): Diagnotic and developmental significance, Clifton, New Jersey, pp.249-293 78 Snijders R.J.M., Noble P., Sebire N., Souka A., Nicolaides K.H (1998), “UK multicentre project on assessment of risk of trisomy 21 by maternal age and fetal nuchal-translucency thickness at 10–14 weeks of gestation”, Lancet, pp 343–346 79 Sokal R.R., Rohlf F.J (1995), Biometry: the principles and practice of statistics in biological research 3rd edition, W H Freeman, New York , p 887 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 132 80 Spencer K., Spencer C.E., Power M., Moakes A., Nicolaides K.H (2000), “One stop clinic for assessment of risk for fetal anomalies: a report of the first year of prospective screening for chromosomal anomaliesin the first trimester”, Journal of Obstetric Gynaecology, pp 1271– 1275 81 Spencer K., Carpenter P (1993), “Prospective study of prenatal screening for Down’s syndrome with free beta human chorionic gonadotrophin”, BMJ, pp 764-769 82 Spong C.Y., Ghidini A., Sherer D.M., Pezzullo J.P., Eglinton G.S (1997), “Angiogenin: a marker for preterm delivery in midtrimester amniotic fluid”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 415-418 83 Szklo M., Nieto J F (2000), “Reliability studies”, Epidemiology Beyond the Basics, An aspen publication Asoen Publisher, Gaidersburg, Maryland, pp.358-398 84 Taketa K (1990), “Alpha-fetoprotein revaluation in hepatology”, Hepatology, pp.1420-1432 85 Tararrinov Y.S (1964), Detection of embryo specific -globulin in blood serum of a patient with primary liver cancer, Voprosy Meditsinskoi Khim, Moskva, pp.10-90 86 Tijssen P (1985), Practice and Theory of enzyme immunoassa, University of Leiden, Elsevier, Amsterdam 87 Tul N., Spencer K., Noble P., Chan C., Nicolaides K.H (1999),”Screening for trisomy 18 by fetal nuchal translucency and maternal serum free beta-hCG and PAPP-A at 10–14 weeks of gestation”, Prenatal Diagnosis, pp 1035–1042 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 133 88 Van Lith J.M.M., Pratt J.J., Beehuis J.R (1992), “Second trimester maternal serum immunoreactive inhibin as a marker for fetal Down’s syndrome”, Prenatal Diagnosis, pp.801-806 89 Wald N.J., Rodeck C., Hackshaw A.K., (2003), “First and second trimester antenatal screening for Down’s syndrome: the results of the Serum, Urine and Ultrasound Screening Study (SURUSS)”, Journal of Medicine Screen, pp 56-104 90 Wald N.J., Cuckle H.S., Densem J.W (1988), “Maternal serum unconjugated oestriol as an antenatal screening test for Down’s syndrome”, British Journal of Obstetric Gynaecology, pp 334-341 91 Wald N.J., Cuckle H.S., Densem J.W., (1988), “Maternal serum screening for Down’s syndrome in early pregnancy”, British Medicine Journal, pp 883-887 92 Wald N.J., Cuckle H., Brock J.H (1977), “Maternal serum-alphafetoprotein measurement in antenatal screening for anencephaly and spina bifida in early pregnancy”, Lancet, pp 1323–1332 93 Wald N.J., George L., Smith D., Densem J.W., Pettersson K (1996), “Serum screening for Down’s syndrome between and 14 weeks of pregnancy”, British Journal of Obstetric Gynaecology, p 407 94 Waller D.K., Lustig L.S., Cunningham G.C., Golbus M.S., Hook E.B (1991), “Second trimester maternal serum alpha-fetoprotein levels and the risk of subsequent fetal death”, New England of Journal Medicine, pp 6-10 95 Weizel H.K (1979), Alpha-fetoprotein in Clinical Medicine in International workshop Stuttgant, pp 106-110 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Hannover, Georg Thieme Publishers Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 134 96 Wenstrom KD, Owen J, Davis RO, Brumfield C.G (1996), “Prognostic significance of unexplained elevated amniotic fluid alpha fetoprotein”, Obstetric Gynecology, pp 213-216 97 Williams M.A., Hickok D.E., Zingheim R.W., Luthy D.A., Kimelman J., Nyberg D.A (1992), “Elevated maternal serum alpha-fetoprotein levels and midtrimester placental abnormalities in relation to subsequent adverse pregnancy outcomes”, American Journal of Obstetric Gynecology, pp 1032-1037 98 Zola H (1988), Monoclonal antibodies: A manual of techniques, CRC Press, pp 23-70 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 135 PHUÏ LỤC DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI CHO HUYẾT THANH STT Họ tên Tuổi VÕ NGỌC T 51 NGUYỄN VĂN L 44 VƯƠNG KIM L 40 NGUYỄN THỊ KIM L 45 NGUYỄN HOÀNG S 58 NGUYỄN VĂN N 66 TRẦN THỊ T 54 LÊ C 41 PHAN VĂN T 53 10 NGUYỄN THỊ HOÀNG E 42 11 NGUYỄN VĂN T 54 12 ĐINH VIỆT H 50 13 NGUYỄN THANH H 57 14 HUỲNH VĂN N 57 15 LÊ VĂN T 49 16 PHAN THỊ T 50 17 NGUYỄN VĂN L 48 18 NGUYỄN VĂN T 47 19 KON V 50 20 NGUYỄN VĂN C 50 21 NGUYỄN T 61 22 PHAN X 71 23 NGUYỄN VĂN G 42 24 MAI NGỌC D 65 25 TRẦN VĂN S 48 26 NGUYỄN THỊ THU H 20 27 HUỲNH VĂN K 38 28 HỒ XUÂN L 69 29 CAO THỊ MINH T 30 30 NGUYỄN ĐINH C 30 Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Giới tính NAM NAM NỮ NỮ NAM NAM NỮ NAM NAM NỮ NAM NAM NAM NAM NAM NỮ NAM NAM NAM NAM NAM NAM NAM NAM NAM NỮ NAM NAM NỮ NAM Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 136 31 NGUYEÃN MINH L 32 HUỲNH THỊ L 33 HỒ VĂN T 34 LÊ HỮU D 35 TRẦN THỊ XUÂN L 36 ĐINH CHÂU T 37 VƯƠNG KHẮC L 38 NGUYỄN THỊ B 39 LE THÒ N 40 PHAN THÒ C 41 PHAN THANH T 42 NGUYỄN THỊ B 43 TRƯƠNG DUY T 44 TỐNG THÀNH Đ 45 HỒ S 46 VÕ VĂN N 47 TRƯƠNG THỊ C 48 TRẦN THỊ G 49 PHAN BÁ T 50 NGUYỄN VĂN T 51 PHAN P 52 NGUYỄN THỊ TƯỜNG V 53 LÊ ĐÌNH P 54 TRƯƠNG ĐỨC H 55 TRẦN BÌNG H 56 CAO ĐỨC TRÙNG D 57 LƯU THỊ THANH L 58 PHAN NGỌC T 59 NGUYỄN YẾN P 60 TRẦN ĐÌNH P 61 PHẠM HÀ TÚ N 62 NGUYỄN THANH H 63 NGUYỄN THỊ ANH P 64 PHAN BÍCH H 65 TRƯƠNG GIA T 66 NGUYỄN THỊ THU T Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 58 39 63 32 29 50 36 50 30 59 42 47 50 20 57 27 31 39 18 32 52 29 19 35 41 25 24 42 25 25 24 28 24 25 25 19 NAM NỮ NAM NAM NỮ NAM NAM NỮ NỮ NỮ NAM NỮ NAM NAM NAM NAM NỮ NỮ NAM NAM NAM NỮ NAM NAM NAM NỮ NỮ NAM NỮ NAM NỮ NAM NỮ NỮ NAM NỮ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 137 67 PHAN THANH H 68 NHAN THỊ T 69 NGUYỄN NGỌC K 70 PHAN ĐĂNG L 71 LÂM VĂN L 72 PHẠM HOÀNG T 73 ĐINH THANH T 74 NGUYỄN NGỌC H 75 LÂM THANH M 76 BÙI CÔNG T 77 PHẠM THANH T 78 PHẠM HOÀNG H 79 NGUYỄN CÔNG NHƯ T 80 LÊ THỊ NGỌC T 81 NGÔ TRƯƠNG MỸ V 82 TRẦN QUỲNH V 83 NGUYỄN XUÂN H 84 NGUYỄN THANH H 85 TRẦN THỊ T 86 NGUYỄN NGỌC D 87 CAO THỊ XUÂN M 88 PHẠM THÚY H 89 BÙI NGỌC Q 90 NGUYỄN THANH L 25 20 23 25 27 21 25 23 24 25 24 28 19 28 25 24 23 24 19 22 20 22 24 25 Xác nhận Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn NỮ NỮ NỮ NAM NAM NAM NỮ NỮ NAM NAM NỮ NAM NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ NỮ Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 138 PHUÏ LUÏC DMEM: 500ml (GIBCO) 5ml Sodium pyruvat 100 MM (GIBCO) 5ml L-Glutamine 200 mM (GIBCO) 5ml NEAA (axit amin không thiết yeáu) (GIBCO) 0,5ml Gentamycine 50mg/ml (GIBCO) 0,5ml 2Mercapto chloro 20ml huyết bào thai bê khử bổ thể (GIBCO) 20ml huyết bào ngựa khử bổ thể (GIBCO) Cho vào chai 180 ml EMEM: 500ml môi trường REGA (GIBCO) 0,5ml Gentamycine 50mg/ml (GIBCO) 5ml Hepes (GIBCO) HAT: 100ml môi trường DMEM 2ml (2%) HT 1ml (1%) Aminopterin Dung dịch đệm citrate-phosphate pH= 0,15 M Dung dòch acide citric C 6H8O7, H2O 21g/l (MERCK) Dung dòch Na2HPO4, H2O 35,6g/l (MERCK) Trộn lẫn 49ml dung dịch acid citric 51ml dung dịch Na2HPO4 Dung dịch đệm carbonate-bicarbonate pH=9,6 0,05 M Na2CO3 1,59 g/l (MERCK) NaHCO3 2,93 g/l (MERCK) Dung dịch đệm PBS pH=7,2 0,15 M Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 139 NaCl 8g/l (MERCK) KCl 0,20g/l (MERCK) Na2HP04 , 2H2O 1,42g/l (MERCK) KH2P04 0,20g/l (MERCK) NaN3 1g/l (MERCK) Dung dịch đệm PBS + NaCl 2,5 M 300ml dung dịch đệm PBS 45g NaCl (MERCK) Dung dịch đệm Glycine/HCl pH=2,8 4l nước khử ion 30,028g Glycine H2N CH2 COOH (MERCK) 34,04g NaCl (MERCK) điều chỉnh pH=2,8 HCl Dung dịch đệm PBS+NaCl 1l PBS 146,1g NaCl (MERCK) Dung dịch đệm Tris/HCl 4l nước khử ion 145,368g Tris C4H11N03 (MERCK) Điều chỉnh pH=8 HCl 37 % HAT: Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine 10ml HT, 50 X (GIBCO) 5ml Aminopterin, 100 X (GIBCO) OPD: Orthophenylene diamine dihydrochloride OPD 4mg/ml Nước oxy già H2O2 30 % 10 ml Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.HCM 140 PEG: polyethylenelycol 0,5g PEG 4000 (MERCK) 0,7ml dung dịch EMEM 50µl dung dịch dimethyl sulfoxide DMSO C2H20S (MERCK) 15 phút tủ sấy ướt + 1200C Sau để nguội Tn thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn ... TIÊU NGHIÊN CỨU: Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha- fetoprotein người Đánh giá chất lượng kháng thể đơn dòng kháng Alpha- fetoprotein người tạo Ứng dụng bước đầu kháng thể đơn dòng kháng Alpha- fetoprotein. .. tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng Alphafetoprotein 65 3.2 Đánh giá kháng thể đơn dòng kháng AFP người sản xuất từ chuột Lou 79 3.3 Kết ứng dụng bước đầu kháng thể đơn. .. 1.1 Kháng thể 1.2 Kháng thể đơn dòng 15 1.3 Đại cương Alpha- fetoprotein 28 Chương 2: ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Tạo kháng thể đơn dòng kháng Alpha- fetoprotein