BCTT ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULICNGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULICNGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULICNGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULICNGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG

ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN

XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC

Mã số: B2013-TN03-01

Chủ nhiệm đề tài: TS Dương Văn Cường

Thái Nguyên, tháng 10 năm 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

BÁO CÁO TÓM TẮT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG

ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN

XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT

VANILLIN TỪ AXIT FERULIC

Mã số: B2013-TN03-01 Chủ nhiệm: TS Dương Văn Cường

DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

STT

Họ và tên Đơn vị công tác Nội dung nghiên cứu được

giao

1 TS Dương Văn Cường

Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Chủ nhiệm đề tài

- Thiết kế các vector biểu hiện

men

tự 3 gene gltA, fcs và ech

4 ThS Lương Thị Thu

Hường

- Phân tích định tính và định lượng sản phẩm vanillin tạo thành bằng HPLC

tối ưu

6 KS Ma Thị Trang

Viện Khoa học sự sống, Đại học Thái Nguyên

- Cảm ứng biểu hiện các gene đích

- So sánh các hệ vector/vật chủ để tìm ra hệ thống cho sản lượng cao nhất

7 KS Vũ Hoài Nam

- Biến nạp các vector biểu hiện chứa các gene đích vào

tế bào chủ

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT viii

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ix

INFORMATION ON RESEARCH RESULTS xii

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

PHẦN 3: MỤC TIÊU, ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, CÁCH TIẾP CẬN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3

3.1 Mục tiêu nghiên cứu 3

3.2 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 3

3.2.1 Các chủng vi sinh vật 3

3.2.2 Các vector tách dòng và biểu hiện 3

3.2.3 Mồi khuếch đại các gen gltA, fcs và ech 3

3.2.4 Hóa chất, thiết bị 4

3.3 Phạm vi nghiên cứu 4

3.4 Cách tiếp cận 4

3.5 Nội dung nghiên cứu 4

3.6 Phương pháp nghiên cứu 5

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 6

4.1 Tách dòng và giải trình tự các gene mã hóa các enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic 6

4.1.1 Tách dòng gene gltA từ E coli DH5α 6

4.1.2 Tách dòng gene ech từ P fluorescens VTCC-B-668 6

4.1.3 Tách dòng gene fcs từ Amycolatopsis sp HR104 6

4.2 và 4.3 Thiết kế hai vector biểu hiện chứa 3 gen gltA, ech, fcs 6

4.4 Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E coli tái tổ hợp làm tế bào chủ 7

4.4.1 Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng E coli 7

4.4.2 Xác định axit ferulic tồn dư và vanillin được tổng hợp bởi hệ thống pET22 7

4.5 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên năng suất sinh tổng hợp vanillin 8

4.5.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 8

4.5.2 So sánh các môi trường LB, M9 và 2YT 9

4.5.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng IPTG 9

4.6 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai hệ vector pET22 và pRSET 10

4.7 Lên men E coli sinh tổng hợp vanillin và thu hồi sản phẩm 11

4.7.1 So sánh hai quy trình lên men 11

4.7.2 Thu hồi sản phẩm vanillin 11

4.8 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin của hệ thống pET22-GEF với các nghiên cứu tương đồng trên thế giới 12

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 14

5.1 Kết luận 14

5.2 Kiến nghị 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Trình tự mồi khuếch đại gen 3 Bảng 4.1 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin của nghiên cứu này với các nghiên cứu tương đồng trên thế giới 13

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ acid ferulic 2 Hình 4.1 Cấu trúc hai vector tái tổ hợp 6 Hình 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ axit ferulic ban đầu với sinh trưởng của E coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF 7 Hình 4.3: Phân tích HPLC động học sự chuyển hóa axit ferulic thành vanillin ở chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pET22-GEF 7 Hình 4.4: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của chủng E coli tái tổ hợp 8 Hình 4.5: So sánh khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp vanillin của E coli tái tổ hợp trên các môi trường LB, M9 và 2YT 9 Hình 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp vanillin 10 Hình 4.7 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic sử dụng các chủng

E coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF và pRSET-GEF 10 Hình 4.8 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin giữa hai phương pháp lên men 11 Hình 4.9 Tinh thể vanillin thu nhận được sau khi chiết xuất 11

CoA : Coenzyme Acetoacetyl

ĐHQGH : Đại học quốc gia Hà Nội

DNA : Deoxyribonucleic acid

DNA-PK : DNA protein kinase

DNA-PK : DNA protein kinase

dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate

E coli : Escherichia coli

EDTA : Etilenduamin tetraacetic acid

HCLC : 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase

IPTG : Isopropy Thyogalactoside

NCBI : NationCenter for Biotechnology Information

PCR : Polymerase Chain Reaction

SDS : Sodium doecyl sulfat

TAE : Tris acetate EDTA

TCA : Tricarboxylic acid

VAO : Vanillyl alcohol oxidase

X-gal : 5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-galactoside

Mẫu 21 Thông tin kết quả nghiên cứu đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1 Thông tin chung:

- Tên đề tài: Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli có khả năng sản xuất vanillin

từ axit ferulic

- Mã số: B2013-TN03-01

- Chủ nhiệm đề tài: TS Dương Văn Cường

- Tổ chức chủ trì: Đại học Thái Nguyên

- Thời gian thực hiện: Từ 01/2013 đến 06/2016

2 Mục tiêu:

Sử dụng các công cụ kỹ thuật di truyển để cải biến E coli tự nhiên BL21(DE3) tạo

ra chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp vanillin từ cơ chất axit ferulic

3 Tính mới và sáng tạo:

Đề tài là nghiên cứu đầu tiên trong nước tạo ra được chủng vi khuẩn E coli tái tổ

hợp mang ba gen mã hóa cho ba enzyme xúc tác con đường sinh tổng hợp axit ferulic thành vanillin

4 Kết quả nghiên cứu:

- Đã tách dòng và giải trình tự thành công ba gen mã hóa con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic, bao gồm:

o Gen gltA mã hóa enzyme citrate synthase từ E coli DH5α chịu trách nhiệm

chuyển hoá acetyl-CoA thành CoA

o Gen fcs mã hóa enzyme feruloyl-CoA synthase từ Amycolatopsis sp HR104

(DSM 9991) chịu trách nhiệm chuyển hóa axit ferulic thành feruloyl-CoA

o Gen ech mã hóa enzyme enoyl-CoA hydratase/aldolase từ P fluorescens

VTCC-B-668 chịu trách nhiệm chuyển hóa feruloyl-CoA thành vanillin

- Đã thiết kế thành công hai vector biểu hiện mang operon đa cistron (multicistronic operon) chứa 3 gene gltA-ech-fcs:

o Vector pRSET-GEF

o Vector pET22-GEF

- Đã biến nạp các vector biểu hiện vào E coli BL21(DE3) và cảm ứng biểu hiện

các gen đích mã hóa các enzyme chuyển hóa được axit ferulic thành vanillin

- Đã phân tích được hiệu suất sinh tổng hợp vanillin của E coli tái tổ hợp bằng

phương pháp HPLC Hệ thống pET22-GEF và pRSET-GEF đạt hiệu suất lần lượt là 1.44 g/L và 1.17 g/L

- Đã xác định được các điều kiện thích hợp cho sinh tổng hợp vanillin:

o Nồng độ axit ferulic: 3 g/L

o Thời gian nuôi cấy: 36 h

o Môi trường nuôi cấy: LB

o Nồng độ chất cảm ứng IPTG: 0.5 mM

- Đã thiết lập được quy trình lên men E coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

có hiệu suất đạt 1.42 ± 0.13 (sử dụng bình tam giác) và 1.53 ± 0.06 (sử dụng hệ thống Labfors)

- Đã thu hồi được 100 gram vanillin từ dịch lên men E coli

5 Sản phẩm:

5.1 Sản phẩm đào tạo:

Đào tạo sau đại học: 01 luận văn thạc sỹ ngành Sinh học thực nghiệm

- Học viên Ma Thị Trang Tên luận văn: “Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli

có khả năng sản xuất vanillin từ axit ferulic”

Đào tạo đại học: 03 khóa luận tốt nghiệp đại học ngành Công nghệ Sinh học

- Sinh viên Lê Thị Quỳnh Hoa Tên khóa luận: “Thiết kế vector biểu hiện các gen

mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin trong E coli”

- Sinh viên Nguyễn Thị Thu Hường Tên khóa luận: “Tách dòng và xác định trình

tự gene gltA mã hóa cho enzyme citrate synthase từ vi khuẩn E coli”

- Sinh viên Hoàng Thị Thúy Quỳnh Tên khóa luận: “Tách dòng và giải trình tự gene mã hóa enzyme feruloyl-coa synthase từ chủng Amycolatopsis sp HR104”

5.2 Sản phẩm khoa học: 02 bài báo khoa học

- Ma Thị Trang, Lương Thị Thu Hường, Lê Thị Quỳnh Hoa, Dương Văn Cường (2015), “Tách dòng, giải trình tự và thiết kế vector biểu hiện các gien mã hóa các enzym

tổng hợp vanillin từ axit ferulic”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tập 11, Tr

274-283

- Dương Văn Cường, Lê Thị Quỳnh Hoa (2016), “Sinh tổng hợp vanillin từ axit

ferulic sử dụng E coli tái tổ hợp”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tập 94,

Tr 68-75

5.3 Sản phẩm ứng dụng:

- 01 quy trình tạo chủng vi khuẩn E coli tái tổ hợp mang vector biểu hiện chứa

các gene gltA, fcs và ech

- 02 chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp vanillin từ

axit ferulic mang các vector pRSET-GEF và pET22-GEF

- 01 quy trình lên men E coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic

- 100 gram vanillin

6 Phương thức chuyển giao, địa chỉ ứng dụng, tác động và lợi ích mang lại của kết quả nghiên cứu:

Đề tài tạo ra một phương pháp sản xuất vanillin chủ động từ cơ chất axit ferulic

bằng vi khuẩn E coli tái tổ hợp Sản phẩm của đề tài có thể áp dụng ở những đơn vị có

những trang thiết bị cơ bản gồm tủ lạnh âm sâu (để duy trì chủng giống), hệ thống lên men

và một số thiết bị, hóa chất để chiết xuất vanillin

Mẫu 22 Thông tin kết quả nghiên cứu đề tài khoa học và công nghệ cấp bộ bằng tiếng Anh

MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING

THAI NGUYEN UNIVERSITY INFORMATION ON RESEARCH RESULTS

1 General information:

- Project title: Construction of recombinant E coli strain for biosynthesis of

vanillin from ferulic acid

- Code number: B2013-TN03-01

- Coordinator: Duong Van Cuong, PhD

- Implementing institution: Thai Nguyen University

- Duration: From Jan 2013 to June 2016

2 Objective(s):

Metabolic engineering of a recombinant E coli strain which is capable of

biosynthesis of vanillin from ferulic acid substrate

3 Creativeness and innovativeness:

In Vietnam, this is the first study aimed to and succeeded in introducing three genes encoding for vanillin biosynthesis pathway into E coli BL21(DE3) The recombinant strain could be used as a cell factory to convert ferulic acid to vanillin

4 Research results:

- Three genes encoding for three enzymes, which are responsible for the biosynthesis pathway from ferulic acid to vanillin, were cloned and sequenced, including:

o gltA gene was cloned from E coli DH5α This gene encodes citrate synthase

enzyme that catalyze the reaction converting acetyl-CoA to CoA

o fcs gene was cloned from Amycolatopsis sp HR104 (DSM 9991) This gene encodes feruloyl-CoA synthase enzyme that catalyze the reaction converting ferulic acid to

feruloyl-CoA

o ech gene was cloned from P fluorescens VTCC-B-668 This gene encodes

enoyl-CoA hydratase/aldolase enzyme that catalyze the reaction converting feruloyl-CoA

to vanillin

- Constructed two expression vectors harboring the multicistronic operon of the above mentioned three genes gltA-ech-fcs:

o pRSET-GEF vector

o pET22-GEF vector

- Recombinant vectors were transformed into E coli BL21(DE3) The vanillin

biosynthesis operon was induced to express above mentioned three enzymes The expressed enzymes converted ferulic acid to vanillin

- The level of vanillin produced by recombinant E coli cell factory was quantified

by HPLC pET22-GEF and pRSET-GEF systems produced 1.44 g/L and 1.17 g/L, respectively

- Determined optimal conditions for vanillin production by recombinant E coli, including:

o Ferulic acid oncentration: 3 g/L

o Cultivation time: 36 hours

o Cultivation media: LB

o IPTG inducer concentration: 0.5 mM

- Estimated fermentation procedure of the recombinant E coli strain for vanillin

biosynthesis The production of vanillin was 1.42 ± 0.13 (using flask) and 1.53 ± 0.06 (using Labfors fermenter)

- 100 gram of vanillin was recovered from cultivation media of recombinant E

coli

5 Products:

5.1 Education support:

Graduate level: Supported one student in the field of Applied Biology

- Student’s name: Ma Thi Trang Title of thesis: “Construction of recombinant E coli strain for biosynthesis of vanillin from ferulic acid”

Undergraduate level: Supported three students in the field of Biotechnology

- Student’s name: Le T Quynh Hoa Title of thesis “Construction of expression vector harboring genes encoding for biosynthesis of vanillin in E coli”

- Student’s name: Nguyen T Thu Huong Title of thesis “Molecular cloning and sequencing of gltA gene encoding citrate synthase from E coli”

- Student’s name: Hoang T Thuy Quynh Title of thesis “Cloning and sequencing

of fcs gene encoding feruloyl-coa synthase from Amycolatopsis sp HR104”

5.2 Academic publications: Two peer-review papers have been published

- Ma Thi Trang, Luong Thi Thu Huong, Le Quynh Hoa, Duong Van Cuong (2015), “Cloning, sequencing, and constructing the expression vector containing genes

encoding enzymes responsible for biosynthesis of vanillin from ferulic acid”, Vietnam

Journal of Agriculture and Rural Development, vol 11, tr 274-283

- Duong Van Cuong, Le Thi Quynh Hoa (2016), “Biosynfthesis of vanillin from

ferulic acid using recombinant E coli”, Vietnam Journal of Agriculture and Rural

Development, vol 294, tr 68-75

5.3 Applied products:

- One procedure for metabolic engineering recombinant E coli strain harboring

expression vector containing policistronic operon of gltA, fcs and ech genes

- Two recombinant E coli BL21(DE3) strains harboring vector

pRSET-GEF/pET22-GEF capable of biosynthesis of vanillin from ferulic acid

- One procedure of biosynthesis and extraction of vanillin from ferulic acid

- 100 gram vanillin was recovered from fermentation media

6 Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results:

This project has estimated an active method to produce natural vanillin from the

cheap and available substrate ferulic acid The results, including recombinant E coli cell

factory and procedure of vanillin production, can be transferred to apply in institutions or companies where basic equipments, including deep freezer, shaking incubator/fermenter, were equipped

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) là một chất thơm quan trọng được sử dụng phổ biến trên thế giới trong công nghiệp thực phẩm, đồ uống, nước hoa, dược phẩm dinh dưỡng [4] Mức độ tiêu thụ vanillin hàng năm trên thế giới vào khoảng hơn 12000

tấn Vanillin được sản xuất chủ yếu từ nguồn tách chiết vỏ quả loài lan Vanilla planifolia

và tổng hợp nhân tạo từ eugenol, lignin… Trong đó, vanillin được tách chiết từ thực vật chỉ đáp ứng 1% nhu cầu thị trường, còn lại là tổng hợp hóa học Giá trị kinh tế của vanillin

tự nhiên từ Vanilla planifolia có giá lên tới 4000 đôla một kilogam, trái lại vanillin nhân

tạo chỉ vào khoảng 15 đôla trên một kilogam [5] Sự khác biệt lớn giữa giá trị của vanillin

tự nhiên với vanillin tổng hợp đã kích thích mối quan tâm của ngành công nghiệp hương liệu để sản xuất ra vanillin tự nhiên

Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy acid ferulic để tạo ra vanillin Điểu yếu của các sinh vật tự nhiên là sau khi tổng hợp vanillin lại bị phân hủy thành các hợp chất khác và quá trình lên men một số xạ khuẩn thườnggặp khó khăn bởi dịch nuôi cấy có độ

nhớt cao do sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và bào tử E coli không gặp phải các nhược

điểm này Trong các nguồn cơ chất có thể sử dụng để sinh tổng hợp vanillin, acid ferulic được quan tâm vì chất này có nhiều trong thành tế bào của thực vật hai lá mầm nên có thể thu từ các phế phụ phẩm nông nghiệp

Từ các luận điểm trên, đề tài này được thiết kế nhằm tạo chủng E coli tái tổ hợp

chứa các gene của con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic có khả năng sản xuất ra vanillin tự nhiên từ axit ferulic