Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)Nghiên cứu tạo chủng Escherichia Coli có khả năng sản xuất Vanillin từ axit ferulic (LV thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Thái Nguyên - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Dương Văn Cường Thái Nguyên - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn công trình nghiên cứu hướng dẫn TS Dương Văn Cường môn Sinh học phân tử công nghệ gen, Viện Khoa học sống, Đại học Thái Nguyên Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố công trình Mọi thông tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Thái Nguyên, ngày 14 tháng năm 2016 Tác giả luận văn Ma Thị Trang ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Dương Văn Cường hướng dẫn bảo tận tình suốt trình nghiên cứu, thực hoàn thành đề tài luận văn thạc sĩ Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Khoa học sống, thầy cô môn Sinh học phân tử công nghệ gen tạo điều kiện giúp đỡ tốt để hoàn thành luận văn Tôi xin cảm ơn thầy cô giáo khoa Khoa học sống, trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thời gian học tập hoàn thành khóa học Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình, đồng nghiệp bạn bè động viên, khích lệ, chia sẻ khó khan suốt trình học tập nghiên cứu hoàn thiện luận văn Thái nguyên, ngày 14 tháng 10 năm 2016 Tác giả luận văn Ma Thị Trang iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu vanillin 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.2 Cấu trúc, đặc điểm lí hóa 1.1.3 Đặc tính sinh học 1.1.4 Vai trò vanillin công nghiệp đời sống 1.2 Các đường sinh tổng hợp vanillin 10 1.2.1 Con đường sinh tổng hợp vanillin thực vật 10 1.2.2 Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic vi sinh vật 10 1.3 Các phương pháp sản xuất vanillin 15 1.3.1 Phương pháp tách chiết vanillin từ thực vật 15 1.3.2 Sản xuất vanillin tổng hợp hoá học 16 1.3.3 Sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ sinh học 18 1.4 Tiềm ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp sản xuất vanillin 21 1.4.1 Các gene mã hóa enzyme sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic 21 iv 1.4.2.Vi khuẩn E coli khả sử dụng làm vật chủ sản xuất vanillin 23 1.5 Tình hình nghiên cứu sản xuất vanillin ứng dụng công nghệ ADN tái tổ hợp nước nước 26 1.5.1 Tình hình nghiên cứu giới 26 1.5.2 Các nghiên cứu nước 29 Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 Vật liệu nghiên cứu 30 2.1.1 Các chủng vi sinh vật 30 2.1.2 Các vector tách dòng biểu tảng 30 2.1.3 Mồi khuếch đại gene gltA, fcs ech 35 2.1.4 Hóa chất 36 2.1.5 Thiết bị 37 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 37 2.3 Nội dung nghiên cứu 38 2.4 Phương pháp nghiên cứu 38 2.4.1 Quy trình tách dòng gene thiết kế vector biểu 38 2.4.2 Nhân gene đích PCR 41 2.4.3 Điện di gel agarose 42 2.4.4 Tách chiết ADN plasmid 43 2.4.5 Lập đồ giới hạn 44 2.4.6 Thu nhận ADN từ gel agarose 45 2.4.7 Nối ADN ADN ligase 46 2.4.8 Chuẩn bị tế bào khả biến 46 2.4.9 Biến nạp ADN vào E coli khả biến 47 2.4.10 Xác định trình tự nucleotide 47 2.4.11 Phân tích trình tự gene tách dòng 48 2.4.12 Nuôi E coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic 48 2.4.13 Lên men sinh tổng hợp vanillin từ chất axit ferulic 49 2.4.14.Phân tích vanillin axit ferulic HPLC 50 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Tách dòng giải trình tự gene mã hóa enzyme xúc tác đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic 51 v 3.1.1 Tách dòng giải trình tự gene gltA từ E coli DH5α 51 3.1.2 Tách dòng giải trình tự gene ech từ Pseudomonas fluorescens VTCC-B-668 55 3.1.3 Tách dòng giải trình tự gene fcs từ từ Amycolatopsis sp HR104 60 3.2 Thiết kế vector biểu chứa gene gltA, ech, fcs tảng vector pET22b+ 65 3.2.1 Chuyển gene gltA từ pTZ-gltA sang pET22b+ tạo vector tái tổ hợp pET22-G 65 3.2.2 Chuyển gene ech từ pTZ-ech sang pET22-G tạo vector tái tổ hợp pET22-GE 68 3.2.3 Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang pET22-GE tạo vector tái tổ hợp pET22-GEF 71 3.3.1 Chuyển gene fcs từ pTZ-fcs sang vector pRSET tạo vector pRSET-F 72 3.3.2 Chuyển cụm hai gene gltA ech từ pET22-GE sang pRSET-F tạo vector tái tổ hợp pRSET-GEF 73 3.4 Sinh tổng hợp vanillin từ axit fefulic sử dụng E coli tái tổ hợp làm tế bào chủ 75 3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ axit ferulic đến sinh trưởng E coli 75 3.4.2 Xác định axit ferulic tồn dư vanillin tổng hợp hệ thống pET22 76 3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên suất sinh tổng hợp vanillin 77 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 77 3.5.2 So sánh môi trường LB, M9 2YT 78 3.5.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG 79 3.6 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin hai hệ vector pET22 pRSET 80 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 4.1 Kết luận 82 4.2 Kiến nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 vi DANH MỤC CÁC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT 4-CL : 4-hydroxycinnamate-CoA ligase ATP : Adenosine triphosphate Bp : Base pair CCl4 : Carbon tetrachloride CoA : Coenzyme Acetoacetyl ĐHQGHN : Đại học quốc gia Hà Nội ADN : Deoxyribonucleic acid ADN-PK : ADN protein kinase ADN-PK : ADN protein kinase dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate E coli : Escherichia coli EDTA : Etilenduamin tetraacetic acid HCLC : 4-hydroxycinnamate CoA-hydratase/lyase IPTG : Isopropy Thyogalactoside Kb : Kilo base LB : Lauria Broth NCBI : NationCenter for Biotechnology Information PCR : Polymerase Chain Reaction SDS : Sodium doecyl sulfat TAE : Tris acetate EDTA TCA : Tricarboxylic acid VAO : Vanillyl alcohol oxidase X-gal : 5-bromo-4chloro-3indoly-β-D-galactoside vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các đặc tính hóa lí vanillin Bảng 2.2: Mức độ sử dụng vanillin hạng mục thực phẩm Bảng 2.3: Hàm lượng vanillin có mặt hàng thực phẩm mỹ phẩm Bảng 2.4: Các chủng vi sinh vật với khả sản xuất vanillin 20 Bảng 3.1: Các thành phần vector pTZ57R/T 32 Bảng 3.2: Các thành phần vector pRSET – A 33 Bảng 3.3: Các thành phần vector pET22b (+) 34 Bảng 3.4: Trình tự mồi khuếch đại gene 35 Bảng 3.5: Danh mục thiết bị 37 Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR 41 Bảng 3.7: Thành phần phản ứng cắt enzyme 45 Bảng 3.8: Thành phần phản ứng nối 46 Bảng 3.9: Chương trình chạy HPLC phân tích axit ferulic vanillin 50 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ phân bố vanilla giới Hình 1.2: Công thức cấu tạo vanillin vanillin dạng bột Hình 1.3: Con đường Non-β-oxidative deacetylation (CoA dependent) 11 Hình 1.4: Con đường β-oxidative deacetylation (CoA-dependent) 12 Hình 1.5: Con đường Non-oxidation decarboxylataion 13 Hình 1.6: Con đường CoA-Independent Deacetylation 14 Hình 1.7: Con đường Side-Chain Reductive 15 Hình 1.8: Thứ tự phản ứng tổng hợp vanillin từ guaiacol (Kirk & Othmer, 1983) 17 Hình 1.9: Con đường phân hủy axit ferulic Pseudomonas fluorescens BF13 (Calisti et al., 2008) 23 Hình 1.10: Con đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic (Yoon et al., 2005) 24 Hình 1.11: Sơ đồ đường tái sử dụng CoA từ acety-CoA (Lee et al., 2009) 25 Hình 2.1: Cấu trúc vector tách dòng pTZ57R/T 30 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc vector pRSET-A 32 Hình 2.3: Cấu trúc vector biểu pET22b(+) 33 Hình 2.4: Sơ đồ quy trình tách dòng gene gltA, ech, fcs từ E.coli DH5 , 39 Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thiết kế vector biểu chứa gene 40 Hình 2.6: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene ech 41 Hình 2.7: Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gene fcs 42 Hình 3.1: Sản phẩm PCR gene gltA (A), sản phẩm PCR sau tinh (B) ADN plasmid dòng khuẩn lạc màu trắng 51 Hình 3.2: Plasmid tái tổ hợp có khả mang gene gltA cắt enzyme NcoI 53 Hình 3.3: Kết xác định trình tự gene gltA 54 Hình 3.4: Kết PCR khuếch đại gene ech 55 Hình 3.5: Kết sàng lọc dòng mang vector pTZ-ech 56 Hình 3.6: (A) Thiết kế in silico vector pTZ-ech; (B) Kết cắt kiểm tra vector tái tổ hợp đồng thời SacI EcoRI 57 77 Tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá số điều kiện hệ thống sinh tổng hợp vanillin nhằm tìm điều kiện tối ưu 3.5 Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên suất sinh tổng hợp vanillin Các điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng đến hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic Chúng thử nghiệm số điều kiện bao gồm loại môi trường nuôi cấy, nồng độ chất cảm ứng thời gian nuôi cấy 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy Trong số nghiên cứu trước [43], [84] tác giả tìm thời gian nuôi cấy tối ưu cho sinh tổng hợp vanillin E coli tái tổ hợp 36 tiếng Tuy nhiên, hệ vector sử dụng nghiên cứu dựa pBAD pBluescript khác với hệ thống pRSET pET đề tài này, tiến hành đánh giá lại thời gian nuôi cấy tối ưu Hình 3.24: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới khả sinh trưởng sinh tổng hợp vanillin chủng E coli tái tổ hợp Axit ferulic (3 g/L) IPTG (1 mM) bổ sung vào dịch nuôi cấy thời điểm 4h OD600nm đạt khoảng 0.4 78 Kết hình 3.24 cho thấy mốc 12h sinh trưởng tế bào đạt mức cao nhiên lượng vanillin tạo thành thấp Từ 12h trở sinh trưởng tế bào giảm dần Tại thời điểm 36h sinh trưởng tế bào mức thấp hàm lượng vanillin tạo thành tích tụ đạt mức tối đa Nuôi thêm lên mốc thời gian 42h hàm lượng vanillin giảm mối tương quan lượng vanillin sinh tổng hợp với lượng vanillin bị phân hủy trở nên bất lợi sinh trưởng tế bào đạt mức thấp Kết đồng thuận với nghiên cứu trước [43] [84] Điều cho thấy yếu tố thời gian nuôi cấy không chịu chi phối hệ vector khác mà chất sinh học tế bào vật chủ, E coli, chất hóa học vanillin Thời gian nuôi 36h lựa chọn cho bước 3.5.2 So sánh môi trường LB, M9 2YT Các nghiên cứu trước cho thấy thành phần môi trường có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp vanillin Trong nghiên cứu thử nghiệm loại môi trường bao gồm môi trường tiêu chuẩn LB, môi trường tối thiểu nghèo carbon M9 môi trường giàu dinh dưỡng 2YT Hình 3.25: So sánh khả sinh trưởng sinh tổng hợp vanillin E coli tái tổ hợp môi trường LB, M9 2YT 79 Hình 3.25 cho thấy sinh trưởng E Coli thấp môi trường tối thiểu M9 đồng thời tỉ lệ thuận với lượng vanillin tạo thành Tuy nhiên, môi trường giàu dinh dưỡng 2YT, sinh trưởng tế bào tốt hai môi trường LB M9 lượng vanillin tạo thành lại không LB Kết cho thấy môi trường cân dinh dưỡng LB phù hợp việc nuôi cấy E coli tái tổ hợp để sinh tổng hợp vanillin Môi trường LB lựa chọn cho thí nghiệm 3.5.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng IPTG Ở thí nghiệm trước sử dụng nồng độ IPTG mM theo đề xuất nhà cung cấp vector Trong thí nghiệm bố trí dãy nồng độ IPTG nhằm tìm nồng độ tối thiểu đáp ứng nhiệm vụ cảm ứng biểu gene đích gltA, ech fcs xúc tác sinh tổng hợp vanillin Hình 3.26: Ảnh hưởng nồng độ IPTG đến sinh tổng hợp vanillin 80 Kết hình 3.26 cho thấy lượng vanillin tạo thành cao đạt 1.6 g/L cảm ứng nồng độ IPTG mM Tuy nhiên, nồng độ IPTG 0.5 mM tạo thành lượng vanillin lên tới 1.52 g/L, vượt trội hoàn toàn so với mức 0.7 g/L nồng độ IPTG 0.2 mM Mức chênh lệch lượng vanillin sản phẩm cảm ứng nồng độ IPTG 0.5 mM mM không thật lớn, lượng IPTG cần dùng chênh lần Vì vậy, sử dụng nồng độ IPTG 0.5 mM cho bước 3.6 So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin hai hệ vector pET22 pRSET Dựa phân tích chuyển hóa chủng E coli BL21(DE3)/pET-GEF, tiến hành phân tích tương tự với chủng E coli BL21(DE3) tái tổ hợp mang vector pRSET-GEF Hiệu chuyển hóa axit ferulic thành vanillin hai hệ thống vector so sánh hình 3.27 Hình 3.27: So sánh hiệu suất sinh tổng hợp vanillin từ chất axit ferulic sử dụng chủng E coli tái tổ hợp mang vector pET22-GEF pRSET-GEF 81 Hình 3.27 cho thấy hệ thống biểu tảng vector pET22b(+) có hiệu suất sinh tổng hợp vanillin đạt 1.44 g/L cao so với mức 1.17 g/L vector pRSET-A Một sở lý giải tượng hệ thống pET22b(+) protein tái tổ hợp dung hợp với trình tự tín hiệu pelB định vị khoang chu chất, nhờ giảm tác dụng phân hủy protease nội bào tăng khả tiết môi trường Mặt khác, vector pRSET-A với điểm khởi đầu chép pUC xếp vào nhóm vector có số lượng lớn (khoảng 500 sao/tế bào) pET22b(+) với điểm khởi đầu chép pBR322 thuộc nhóm số lượng thấp (khoảng 15 đến 20 sao/tế bào) Kết so sánh hệ vector cho thấy số lượng vector có ảnh hưởng đến mức độ sinh tổng hợp vanillin Công bố trước Jones cộng [34] kết luận số lượng plasmid không ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chất đích Tuy nhiên, liệu đồng thuận với công bố Barghini cộng [12] vanillin tổng hợp mạnh sử dụng plasmid số lượng thấp promoter hiệu suất thấp Hiệu suất sinh tổng hợp vanillin nghiên cứu cao mức 580 mg/L theo Yoon cộng (2005) [84] gene gltA chưa sử dụng Dữ liệu góp phần khẳng định vai trò gene gltA sinh tổng hợp vanillin E coli tái tổ hợp gene giúp tái sử dụng acetyl-CoA theo chu trình [43] 82 Chương KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Tách dòng thành công gene mã hóa đường sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic, bao gồm: gltA, ech fcs Thiết kế thành công vector biểu mang gene gltA, ech fcs là: pRSET-GEF pET22-GEF Đã cảm ứng biểu gen đích để sản xuất vanillin từ axit ferulic sử dụng vật chủ E coli BL21(DE3) Phân tích lđược hiệu suất sinh tổng hợp vanillin tạo thành E coli tái tổ hợp phương pháp HPLC Hệ thống pET22-GEF pRSET-GEF đạt hiệu suất 1.44 g/L 1.17 g/L 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu quy trình lên men E.coli sinh tổng hợp vanillin từ axit ferulic để thu hồi vanillin thành phẩm Tiếp tục nghiên cứu tăng cường suất sinh tổng hợp vanillin theo hướng sau: - Bất hoạt đường trao đổi chất cạnh tranh để dồn nguồn lượng vật chất cho đường sinh tổng hợp vanillin - Giảm độc cho tế bào vật chủ cách (1) sử dụng chất hấp phụ; (2) chọn lọc chủng đột biến kháng vanillin/axit ferulic - Thiết lập quy trình lên men hiệu lên men đáp ứng bề mặt lên men liên tục 83 TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tiếng Việt Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Bích Thuỷ, Đào Văn Tường (1991) Tổng hợp vanillin từ eugeneol Tạp chí Hóa học 29 (4): 21-27 Đinh Thị Ngọ, Nguyễn Thị Bích Thuỷ, Đào Văn Tường (1992) Nghiên cứu oxy hóa lignin thành vanillin, Tạp chí Hóa học Đinh Thị Ngọ (1996) Tổng hợp vanillin từ tinh dầu quế Tạp chí Khoa học & công nghệ Phùng Thu Nguyệt, Nguyễn Hồng Thanh, Jan-Christer Janson, Trương Nam Hải (2009) Nghiên cứu lên men lượng lớn chủng Escherichia coli BL21 tái tổ hợp mang gene mã hóa lipase Bacillus subtilis FS2 Tạp chí Khoa học Công nghệ, Tập 47, số 2, Tr109-116 II Tiếng Anh Abraham, D J., Mehanna, A S., Wireko, F C., Whitney, J., Thomas, R P., & Orringer, E P (1991) Vanillin, a potential agenet for the treatment of sickle cell anemia Blood, 77(6), 1334-1341 Achterholt, S., Priefert, H., & Steinbuchel, A (2000) Identification of amycolatopsis sp Strain hr167 genes, involved in the bioconversion of axit ferulic to vanillin Appl Microbiol Biotechnol, 54(6), 799-807 Akagi, K., Hirose, M., Hoshiya, T., Mizoguchi, Y., Ito, N., & Shirai, T (1995) Modulating effects of ellagic acid, vanillin and quercetin in a rat medium term multi-organ carcinogenesis model Cancer Lett, 94(1), 113-121 Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F (2011a) Candida galli strain pgo6: A novel isolated yeast strain capable of transformation of isoeugeneol into vanillin and vanillic acid Curr Microbiol, 62(3), 990-998 doi:10.1007/s00284-010-9815-y Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F (2011b) Pseudomonas resinovorans spr1, a newly isolated strain with potential of transforming eugeneol to vanillin and vanillic acid N Biotechnol, 28(6), 656664 doi:10.1016/j.nbt.2011.06.009 84 10 Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F (2011c) Use of growing cells of pseudomonas aeruginosa for synthesis of the natural vanillin via conversion of isoeugeneol Iran J Pharm Res, 10(4), 749-757 11 Ashengroph, M., Nahvi, I., Zarkesh-Esfahani, H., & Momenbeik, F (2012) Conversion of isoeugeneol to vanillin by psychrobacter sp Strain csw4 Applied Biochemistry and Biotechnology, 166(1), 1-12 doi:10.1007/s12010011-9397-6 12 Barghini, P., Di Gioia, D., Fava, F., & Ruzzi, M (2007) Vanillin production using metabolically engineered escherichia coli under non-growing conditions Microb Cell Fact, 6, 13 doi:10.1186/1475-2859-6-13 13 Barthelmebs, L., Divies, C., & Cavin, J.-F (2000) Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from lactobacillus plantarum reveals the existence of two other inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism Applied and Environmental Microbiology, 66(8), 3368-3375 doi:10.1128/aem.66.8.3368-3375.2000 14 Berza, I., Dishlers, A., Petrovskis, I., Tars, K., & Kazaks, A (2013) Plasmid dimerization increases the production of hepatitis b core particles in e Coli Biotechnology and Bioprocess Engineering, 18(5), 850-857 doi:10.1007/s12257-013-0188-5 15 Bjørsvik, H.-R., & Liguori, L (2002) Organic processes to pharmaceutical chemicals based on fine chemicals from lignosulfonates Organic Process Research & Development, 6(3), 279-290 doi:10.1021/op010087o 16 Boonchird, C., & Flegel, T W (1982) In vitro antifungal activity of eugeneol and vanillin against candida albicans and cryptococcus neoformans Can J Microbiol, 28(11), 1235-1241 17 Calisti, C., Ficca, A G., Barghini, P., & Ruzzi, M (2008) Regulation of ferulic catabolic genes in pseudomonas fluorescens bf13: Involvement of a marr family regulator Applied Microbiology and Biotechnology, 80(3), 475-483 doi:10.1007/s00253-008-1557-4 18 Converti, A., Aliakbarian, B., Dominguez, J M., Bustos Vazquez, G., & Perego, P (2010) Microbial production of biovanillin Braz J Microbiol, 41(3), 519530 doi:10.1590/s1517-83822010000300001 85 19 Di Gioia, D., Luziatelli, F., Negroni, A., Ficca, A G., Fava, F., & Ruzzi, M (2010) Metabolic engineering of pseudomonas fluorescens for the production of vanillin from axit ferulic J Biotechnol, 156(4), 309-316 doi:10.1016/j.jbiotec.2011.08.014 20 Dignum, M J W., Kerler, J., & Verpoorte, R (2001) Vanilla production: Technological, chemical, and biosynthetic aspects Food Reviews International, 17(2), 119-120 doi:10.1081/FRI-100000269 21 Durant, S., & Karran, P (2003) Vanillins a novel family of ADN-pk inhibitors Nucleic Acids Res, 31(19), 5501-5512 22 Edlin, D A N., Narbad, A., Gasson, M J., Dickinson, J R., & Lloyd, D (1998) Purification and characterization of hydroxycinnamate decarboxylase from brettanomyces anomalus Enzyme and Microbial Technology, 22(4), 232-239 doi:http://dx.doi.org/10.1016/S0141-0229(97)00169-5 23 Fitzgerald, D J., Stratford, M., Gasson, M J., & Narbad, A (2005) Structurefunction analysis of the vanillin molecule and its antifungal properties J Agric Food Chem, 53(5), 1769-1775 doi:10.1021/jf048575t 24 Furia, T E., & Bellanca, N (1975) Fenaroli's handbook of flavor ingredients: C R C Press LLC 25 Gasson, M J., Kitamura, Y., McLauchlan, W R., Narbad, A., Parr, A J., Parsons, E L., Walton, N J (1998) Metabolism of axit ferulic to vanillin A bacterial gene of the enoyl-scoa hydratase/isomerase superfamily encodes an enzyme for the hydration and cleavage of a hydroxycinnamic acid scoa thioester J Biol Chem, 273(7), 4163-4170 26 Gupta, J., Hamp, S., Buswell, J., & Eriksson, K.-E (1981) Metabolism of transaxit ferulic by the white-rot fungus sporotrichum pulverulentum Archives of Microbiology, 128(4), 349-354 doi:10.1007/BF00405911 27 Gustafson, D L., Franz, H R., Ueno, A M., Smith, C J., Doolittle, D J., & Waldren, C A (2000) Vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde) inhibits mutation induced by hydrogene peroxide, n-methyl-n-nitrosoguanidine and mitomycin c but not 137cs γ-radiation at the cd59 locus in human–hamster hybrid al cells Mutagenesis, 15(3), 207-213 doi:10.1093/mutage/15.3.207 28 Havkin-Frenkel, D., & Belanger, F (2007) Application of metabolic engineering to vanillin biosynthetic pathways in vanilla planifolia In R Verpoorte, A W 86 Alfermann, & T S Johnson (Eds.), Applications of plant metabolic engineering (pp 175-196): Springer Netherlands 29 Havkin-Frenkel, D., & Belanger, F (2010) Handbook of vanilla science and technology: Wiley 30 Havkin-Frenkel, D., Podstolski, A., & Knorr, D (1996) Effect of light on vanillin precursors formation by in vitro cultures of vanilla planifolia Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 45(2), 133-136 doi:10.1007/BF00048756 31 Hopp, R., & Rabenhorst, J (2000) Process for the preparation of vanillin and microorganisms suitable therefor: Google Patents 32 Huang, Z., Dostal, L., & Rosazza, J P (1993a) Mechanisms of axit ferulic conversions to vanillic acid and guaiacol by rhodotorula rubra J Biol Chem, 268(32), 23954-23958 33 Huang, Z., Dostal, L., & Rosazza, J P (1993b) Microbial transformations of axit ferulic by saccharomyces cerevisiae and pseudomonas fluorescens Appl Environ Microbiol, 59(7), 2244-2250 34 Jones, K L., Kim, S W., & Keasling, J D (2000) Low-copy plasmids can perform as well as or better than high-copy plasmids for metabolic engineering of bacteria Metab Eng, 2(4), 328-338 doi:10.1006/mben.2000.0161 35 Kamat, J., Ghosh, A., & Devasagayam, T A (2000) Vanillin as an antioxidant in rat liver mitochondria: Inhibition of protein oxidation and lipid peroxidation induced by photosensitization Molecular and Cellular Biochemistry, 209(12), 47-53 doi:10.1023/A:1007048313556 36 Kamoda, S., Habu, N., Samejima, M., & Yoshimoto, T (1989) Purification and some properties of lignostilbene-?,?-dioxygenease responsible for the c?-c? Cleavage of a diarylpropane type lignin model compound from pseudomonas sp Tmy1009 Agricultural and biological chemistry, 53(10), 2757-2761 37 Kanski, J., Aksenova, M., Stoyanova, A., & Butterfield, D A (2002) Axit ferulic antioxidant protection against hydroxyl and peroxyl radical oxidation in synaptosomal and neuronal cell culture systems in vitro: Structure-activity studies The Journal of nutritional biochemistry, 13(5), 273-281 38 Keen, H., Glynne, A., Pickup, J C., Viberti, G C., Bilous, R W., Jarrett, R J., & Marsden, R (1980) Human insulin produced by recombinant ADN 87 technology: Safety and hypoglycaemic potency in healthy men Lancet, 2(8191), 398-401 39 Kirk, R E., & Othmer, D F (1983) Kirk-othmer encyclopedia of chemical technology: Sulfonation and sulfation to thorium and thorium compounds: Wiley 40 Knuth, M E., & Sahai, O P (1991) Flavor composition and method: Google Patents 41 Krueger DA, K H (1985) Detection of fraudulent vanillin labeled with 13c in the carbonyl carbon J Agric Food Chem, 33, 323-325 42 Kumar, R., Sharma, P K., & Mishra, P S (2012) Cheminform abstract: Vanillin derivatives showing various biological activities ChemInform, 43(28), no-no doi:10.1002/chin.201228263 43 Lee, E G., Yoon, S H., Das, A., Lee, S H., Li, C., Kim, J Y., Kim, S W (2009) Directing vanillin production from axit ferulic by increased acetyl-coa consumption in recombinant escherichia coli Biotechnol Bioeng, 102(1), 200208 doi:10.1002/bit.22040 44 Lomascolo, A., Stentelaire, C., Asther, M., & Lesage-Meessen, L (1999) Basidiomycetes as new biotechnological tools to generate natural aromatic flavours for the food industry Trends in biotechnology, 17(7), 282-289 45 López-Malo, A., Alzamora, S M., & Argaiz, A (1995) Effect of natural vanillin on germination time and radial growth of moulds in fruit-based agar systems Food Microbiology, 12(0), 213-219 doi:http://dx.doi.org/10.1016/S07400020(95)80100-6 46 Luziatelli, F., & Ruzzi, M Genetic engineering of escherichia coli to enhance biological production of vanillin from axit ferulic 47 Makni, M., Chtourou, Y., Barkallah, M., & Fetoui, H (2012) Protective effect of vanillin against carbon tetrachloride (ccl4)-induced oxidative brain injury in rats Toxicology and Industrial Health, 28(7), 655-662 doi:10.1177/0748233711420472 48 Markus, P H., Peters, A L., & Roos, R (1994) Process for the preparation of phenylaldehydes: Google Patents 49 Martínez-Cuesta, M d C., Payne, J., Hanniffy, S B., Gasson, M J., & Narbad, A (2005) Functional analysis of the vanillin pathway in a vdh-negative mutant strain of pseudomonas fluorescens an103 Enzyme and Microbial Technology, 37(1), 131-138 doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.enzmictec.2005.02.004 88 50 Mathew, S., & Abraham, T E (2006) Bioconversions of axit ferulic, an hydroxycinnamic acid Crit Rev Microbiol, 32(3), 115-125 doi:10.1080/10408410600709628 51 Muheim, A., & Lerch, K (1999) Towards a high-yield bioconversion of axit ferulic to vanillin Applied Microbiology and Biotechnology, 51(4), 456-461 doi:10.1007/s002530051416 52 Muheim, A., MÜLLER, B., Münch, T., & Wetli, M (2012) Process for the production of vanillin: Google Patents 53 Narbad, A., & Gasson, M J (1998) Metabolism of axit ferulic via vanillin using a novel coa-dependent pathway in a newly-isolated strain of pseudomonas fluorescens Microbiology, 144 ( Pt 5), 1397-1405 54 Nausch, H., Huckauf, J., Koslowski, R., Meyer, U., Broer, I., & Mikschofsky, H (2013) Recombinant production of human interleukin in escherichia coli PLoS One, 8(1), e54933 doi:10.1371/journal.pone.0054933 55 Ner, S S., Bhayana, V., Bell, A W., Giles, I G., Duckworth, H W., & Bloxham, D P (1983) Complete sequence of the glta gene encoding citrate synthase in escherichia coli Biochemistry, 22(23), 5243-5249 doi:10.1021/bi00292a001 56 Ngarmsak, M., Delaquis, P., Toivonen, P., Ngarmsak, T., Ooraikul, B., & Mazza, G (2006) Antimicrobial activity of vanillin against spoilage microorganisms in stored fresh-cut mangoes J Food Prot, 69(7), 1724-1727 57 Odoux, E., Escoute, J., Verdeil, J L., & Brillouet, J M (2003) Localization of beta-d-glucosidase activity and glucovanillin in vanilla bean (vanilla planifolia andrews) Ann Bot, 92(3), 437-444 doi:10.1093/aob/mcg150 58 Ou, S., & Kwok, K.-C (2004) Axit ferulic: Pharmaceutical functions, preparation and applications in foods Journal of the science of food and agriculture, 84(11), 1261-1269 doi:10.1002/jsfa.1873 59 Overhage, J., Priefert, H., & Steinbuchel, A (1999) Biochemical and genetic analyses of axit ferulic catabolism in pseudomonas sp Strain hr199 Appl Environ Microbiol, 65(11), 4837-4847 60 Overhage, J., Steinbuchel, A., & Priefert, H (2003) Highly efficient biotransformation of eugeneol to axit ferulic and further conversion to vanillin in recombinant strains of escherichia coli Appl Environ Microbiol, 69(11), 6569-6576 89 61 Plaggeneborg, R., Overhage, J., Loos, A., Archer, J C., Lessard, P., Sinskey, A., Priefert, H (2006) Potential of rhodococcus strains for biotechnological vanillin production from axit ferulic and eugeneol Applied Microbiology and Biotechnology, 72(4), 745-755 doi:10.1007/s00253-005-0302-5 62 Plaggeneborg, R., Overhage, J., Steinbüchel, A., & Priefert, H (2003) Functional analyses of genes involved in the metabolism of axit ferulic in pseudomonas putida kt2440 Applied Microbiology and Biotechnology, 61(5-6), 528-535 doi:10.1007/s00253-003-1260-4 63 Plaggeneborg, R., Steinbuchel, A., & Priefert, H (2001) The coenzyme adependent, non-beta-oxidation pathway and not direct deacetylation is the major route for axit ferulic degradation in delftia acidovorans FEMS Microbiol Lett, 205(1), 9-16 64 Rabenhorst, J D., & Hopp, R D (1997) Verfahren zur herstellung von vanillin und dafür geeignete mikroorganismen: Google Patents 65 Ramachandra Rao, S., & Ravishankar, G A (2000) Vanilla flavour: Production by conventional and biotechnological routes Journal of the science of food and agriculture, 80(3), 289-304 66 Ranadive, A S (1994) Vanilla cultivation, curing, chemistry, technology and commercial products Developments in food science., 34, 517-577 67 Ravendra, K., Sharma, P K., & Prem Shanker, M (2012) Cheminform abstract: Vanillin derivatives showing various biological activities ChemInform, 43(28) doi:10.1002/chin.201228263 68 Rezaei, M., & Zarkesh-Esfahani, S H (2012) Optimization of production of recombinant human growth hormone in escherichia coli 69 Rosazza, J P N., Huang, Z., Dostal, L., Volm, T., & Rousseau, B (1995) Review: Biocatalytic transformations of axit ferulic: An abundant aromatic natural product Journal of Industrial Microbiology, 15(6), 457-471 doi:10.1007/BF01570016 70 Shimoni, E., Ravid, U., & Shoham, Y (2000) Isolation of a bacillus sp Capable of transforming isoeugeneol to vanillin J Biotechnol, 78(1), 1-9 71 Sinha, A K., Sharma, U K., & Sharma, N (2008) A comprehensive review on vanilla flavor: Extraction, isolation and quantification of vanillin and others 90 constituents Int J Food Sci Nutr, 59(4), 299-326 doi:10.1080/09687630701539350 72 Srinivasan, M R., & Chandrasekhara, N (1992) Comparative influence of vanillin & capsaicin on liver & blood lipids in the rat Indian J Med Res, 96, 133-135 73 Sutherland, J B., Crawford, D L., & Pometto, A L., 3rd (1983) Metabolism of cinnamic, p-coumaric, and axit ferulics by streptomyces setonii Can J Microbiol, 29(10), 1253-1257 74 Tawatsin, A., Wratten, S D., Scott, R R., Thavara, U., & Techadamrongsin, Y (2001) Repellency of volatile oils from plants against three mosquito vectors J Vector Ecol, 26(1), 76-82 75 Torre, P., De Faveri, D., Perego, P., Ruzzi, M., Barghini, P., Gandolfi, R., & Converti, A (2004) Bioconversion of ferulate into vanillin by escherichia coli strain jm109/pbb1 in an immobilized-cell reactor Annals of microbiology, 54(4), 517-527 76 Vaghasiya, Y K., Nair, R., Soni, M., Baluja, S., & Shanda, S (2004) Synthesis, structural determination and antibacterial activity of compounds derived from vanillin and 4-aminoantipyrine Journal of the Serbian Chemical Society, 69(12), 991-998 77 van den Heuvel, R H., Fraaije, M W., Laane, C., & van Berkel, W J (2001) Enzymatic synthesis of vanillin J Agric Food Chem, 49(6), 2954-2958 78 Venturi, V., Zennaro, F., Degrassi, G., Okeke, B C., & Bruschi, C V (1998) Genetics of axit ferulic bioconversion to protocatechuic acid in plant-growthpromoting pseudomonas putida wcs358 Microbiology, 144(4), 965-973 doi:10.1099/00221287-144-4-965 79 Walton, N J., Mayer, M J., & Narbad, A (2003) Vanillin Phytochemistry, 63(5), 505-515 80 Westcott, R J., Cheetham, P S J., & Barraclough, A J (1993) Use of organized viable vanilla plant aerial roots for the production of natural vanillin Phytochemistry, 35(1), 135-138 doi:http://dx.doi.org/10.1016/S00319422(00)90521-1 81 Xu, P., Hua, D., & Ma, C (2007) Microbial transformation of propenylbenzenes for natural flavour production Trends Biotechnol, 25(12), 571-576 doi:10.1016/j.tibtech.2007.08.011 91 82 Yamada, M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa, T (2007) Biotransformation of isoeugeneol to vanillin by pseudomonas putida ie27 cells Applied Microbiology and Biotechnology, 73(5), 1025-1030 doi:10.1007/s00253-006-0569-1 83 Yamada, M., Okada, Y., Yoshida, T., & Nagasawa, T (2008) Vanillin production using escherichia coli cells over-expressing isoeugeneol monooxygenease of pseudomonas putida Biotechnol Lett, 30(4), 665-670 doi:10.1007/s10529-007-9602-4 84 Yoon, S.-H., Li, C., Lee, Y.-M., Lee, S.-H., Kim, S.-H., Choi, M.-S., Kim, S.W (2005) Production of vanillin from axit ferulic using recombinant strains ofescherichia coli Biotechnology and Bioprocess Engineering, 10(4), 378384 doi:10.1007/BF02931859 85 Yoon, S H., Lee, E G., Das, A., Lee, S H., Li, C., Ryu, H K., Kim, S W (2007) Enhanced vanillin production from recombinant e Coli using ntg mutagenesis and adsorbent resin Biotechnol Prog, 23(5), 1143-1148 doi:10.1021/bp070153r 86 Yoon, S H., Li, C., Kim, J E., Lee, S H., Yoon, J Y., Choi, M S., Kim, S W (2005) Production of vanillin by metabolically engineered escherichia coli Biotechnol Lett, 27(22), 1829-1832 doi:10.1007/s10529-005-3561-4 87 Zamzuri, N A., & Abd-Aziz, S (2013) Biovanillin from agro wastes as an alternative food flavour J Sci Food Agric, 93(3), 429-438 doi:10.1002/jsfa.5962 88 Zenk, M H., Ulbrich, B., Busse, J., & Stockigt, J (1980) Procedure for the enzymatic synthesis and isolation of cinnamoyl-coa thiolesters using a bacterial system Anal Biochem, 101(1), 182-187 89 Zhang, C., Li, X., Lian, L., Chen, Q., Abdulmalik, O., Vassilev, V., Asakura, T (2004) Anti-sickling effect of mx-1520, a prodrug of vanillin: An in vivo study using rodents Br J Haematol, 125(6), 788-795 doi:10.1111/j.13652141.2004.04892.x 90 Zhang, Y., Xu, P., Han, S., Yan, H., & Ma, C (2006) Metabolism of isoeugeneol via isoeugeneol-diol by a newly isolated strain of bacillus subtilis hs8 Applied Microbiology and Biotechnology, 73(4), 771-779 doi:10.1007/s00253-006-0544-x ... tích sản phẩm vanillin tạo thành Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu đề tài tạo chủng E .coli có khả sản xuất vanillin từ axit ferulic tảng để thực nhiều nghiên cứu. .. ferulic Chủng E coli có khả sản xuất vanillin tự nhiên từ axit ferulic Mục tiêu đề tài Tạo chủng Escherichia coli tái tổ hợp mang gen mã hóa cho enzyme sinh tổng hợp axit ferulic thành vanillin. .. HỌC KHOA HỌC MA THỊ TRANG NGHIÊN CỨU TẠO CHỦNG ESCHERICHIA COLI CÓ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT VANILLIN TỪ AXIT FERULIC Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG