Phân lập, định danh và xác định đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG NGUYÊN PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN KỊ KHÍ, ƯA NHIỆT, SINH CELLULASE CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ NGÀNH: 60 42 30 HDKH: TS. HOÀNG QUỐC KHÁNH TP. HỒ CHÍ MINH, 06/2011 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Xin được tỏ lòng cảm ơn chân thành đến: Thầy tiến sỹ Hoàng Quốc Khánh, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam người đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành tốt khóa luận. Anh Ngô Đức Duy, anh Nguyễn Duy Long, chị Đào Thị Thu Hiền cùng toàn bộ các anh chị phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã hướng dẫn trực tiếp hoàn thành khóa luận. Thầy cô và các anh chị ở Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã chỉ bảo trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Thầy cô bộ môn sinh hóa, cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh học Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh cũng như các thầy cô trước đây đã tận tâm dạy dỗ và truyền đạt nhiều kiến thức quí báu trong suốt nhiều năm học qua. Các bạn lớp cao học khóa 18 đã quan tâm, giúp đỡ và chia sẻ niềm vui nỗi buồn trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng con xin cảm ơn ba mẹ đã nuôi nấng, chăm sóc, luôn dạy con điều hay lẽ phải và cho con ăn học thành người có ích cho xã hội. Em cũng xin cảm ơn các anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc, khích lệ em trong những lúc khó khăn nhất để em có thể vững bước trên đường đời. TP Hồ Chí Minh, 06/2011 Hoàng Nguyên MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose 1 1.1.1. Cấu trúc của cellulose 1 1.1.2. Thành phần của sinh khối thực vật 2 1.2. Các chủng sinh vật sinh cellulase 3 1.2.1. Nấm mốc 3 1.2.2. Vi khuẩn sản xuất cellulase 5 1.3. Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 7 1.3.1. Đặc điểm chung 7 1.3.1.1. Cơ chất ưu tiên 7 1.3.1.2. Sự hình thành phức hợp cellulose-enzyme-microbe 7 1.3.1.3. Sự hấp thu và biến dưỡng sản phẩm thủy phân cellulose 8 1.3.1.4. Sự biến dưỡng lên men và sản phẩm sau cùng 10 1.3.2. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 10 1.4. Hệ thống enzym cellulase 12 1.4.1. Thành phần của cellulase 12 1.4.2. Cơ chế thủy giải cellulose 13 1.4.3. Ứng dụng enzyme cellulase 14 1.4.4. Hệ thống cellulase không phức hợp 15 1.4.5. Cellulosome - Hệ thống cellulase phức hợp 16 1.4.5.1. Đặc điểm chung 16 1.4.5.2. Cấu trúc cellulosome 18 1.4.5.3. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 20 1.4.5.4. Sự sắp xếp của cellulosome 22 1.4.5.5. Sự điều hòa nguồn carbon 24 1.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase 25 1.6. Phương pháp định danh sinh học phân tử 26 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1. Vật liệu 29 2.1.1. Nguồn phân lập 29 2.1.2. Thiết bị dụng cụ 29 2.1.2.1. Thiết bị thông dụng 29 2.1.2.2. Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí 29 2.1.2.3. Môi trường 30 2.1.2.4. Hóa chất 31 2.1.2.5. Chủng vi khuẩn đối chứng 35 2.2. Phương pháp thực hiện 35 2.1.1. Phương pháp tạo môi trường kị khí 35 2.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase 36 2.2.2. Đặc tính sinh lí hình thái vi khuẩn 37 2.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc 37 2.2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram 37 2.2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử 38 2.2.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS 39 2.2.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 41 2.2.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 41 2.2.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào 42 2.2.3.4. Định lượng hoạt tính cellulase tổng số 43 2.2.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase 44 2.2.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide 45 2.2.3.6.1. Lượng protein tối ưu thủy phân CMC 47 2.2.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein A và protein B 47 2.2.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của các chủng 47 2.2.3.7. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 48 2.2.3.8. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase 48 2.2.3.8.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 48 2.2.3.8.2. Ảnh hưởng pH lên hoạt tính cellulase 48 2.2.4. Định danh vi khuẩn 49 2.2.4.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium 50 2.2.4.2. Phản ứng PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại loài 51 3. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 52 3.1. Phân lập các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 52 3.2. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt, sinh cellulase 54 3.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc 54 3.2.2. Nhuộm Gram 55 3.2.3. Nhuộm bào tử 56 3.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS 57 3.3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 57 3.3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 58 3.3.3. Xác định hàm lượng protein ngoại bào 59 3.3.4. Xác định hoạt tính cellulase tổng số 60 3.3.5. Bán định lượng hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC 62 3.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác định In-situ trên gel polyacrylamide 64 3.3.6.1. Nồng độ protein tối ưu cho khả năng thủy phân CMC 64 3.3.6.2. Sự khác biệt giữa dung dịch protein B và protein A 65 3.3.6.3. Khả năng thủy phân CMC của 6 chủng khảo sát 68 3.4. Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 71 3.5. Tối ưu hóa hoạt tính cellulase 73 3.5.1. Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính cellulase 73 3.5.2. Ảnh hưởnng pH lên hoạt tính cellulase 74 3.6. Định danh vi khuẩn 75 3.6.1. Định danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc trưng cho vi khuẩn Clostridium 76 3.6.2. PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại 77 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81 4.1. Kết luận 81 4.2. Kiến nghị 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 PHỤ LỤC 3 PHỤ LỤC 4 PHỤ LỤC 5 PHỤ LỤC 6 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1. Khả năng sử dụng giấy lọc 57 Biểu đồ 3.2. Khả năng sử dụng rơm rạ 58 Biểu đồ 3.3. Nồng độ protein ngoại bào của các chủng 59 Biểu đồ 3.4. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng 61 Biểu đồ 3.5. Sự tương quan giữa lg(trọng lượng phân tử) protein thang chuẩn với Rf 67 Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh cellulase 72 Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính celluase 73 Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính celluase 85 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc cellulose trong vách tế bào thực vật 3 Hình 1.2. Sự hấp thu carbohydrate và phosphoryl hóa bởi C.thermocellum 9 Hình 1.3. Một vài loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase điển hình 11 Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của hệ enzym cellulase của Trichoderma reesei 13 Hình 1.5. Cấu trúc cellulosome của C. thermocellum 18 Hình 1.6. Sự gắn kết cellulosome vào bề mặt tế bào 21 Hình 1.7. Cấu trúc của phức hợp Coh-XDoc loại II của loài C. thermocellum 23 Hình 2.1. Quy trình thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi universal 52 Hình 3.1. Vòng phân giải cellulose của mẫu DR5 và DM7 53 Hình 3.2. Khuẩn lạc chủng DR5-1 54 Hình 3.3. Kết quả nhuộm Gram chủng TQ1-2 55 Hình 3.4. Kết quả nhuộm bào tử chủng DR5-1 56 Hình 3.5. Vòng phân CMC của dung dịch protein B và protein A của TQ1-2 62 Hình 3.6. Vạch phân giải CMC trên gel với lượng protein khác nhau của dung dịch Protein B chủng TQ1-2 64 Hình 3.7a. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 66 Hình 3.7b. Kết quả điện di SDS-PAGE các chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2 66 Hình 3.8a. Vạch phân giải CMC của dung dịch Protein B và protein A chủng DM5-1, DM7-1, DR5-1 69 Hình 3.8b. Vạch phân giải CMC của dung dịch ProteinB và protein A chủng DM8-1, DT2-1, TQ1-2 69 Hình 3.9. Sản phẩm PCR cặp mồi S-G-Clos-0586-S-21 và S-G-Clos-1205-A-21 . 76 Hình 3.10. Sản phẩm PCR cặp mồi universal 77 Hình 3.11. Cây phân loại loài của các chủng khảo sát 80 1 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số vi khuẩn thủy giải cellulose 5 Bảng 1.2. Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome 17 Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc 54 Bảng 3.2. Nhuộm Gram và khảo sát các đặc điểm hình thái tế bào 55 Bảng 3.3. Hoạt tính cellulase tổng số của các chủng 61 Bảng 3.4. Hoạt tính endoglucanase trên đĩa thạch CMC 62 Bảng 3.5. Trọng lượng phân tử của các vạch protein trên SDS-PAGE 68 Bảng 3.6. Trọng lượng phân tử của các vạch protein phân giải CMC trên gel 70 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên 1 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Cấu trúc và thành phần của sinh khối cellulose 1.1.1. Cấu trúc của cellulose Cellulose là polimer được cấu thành từ các đơn phân glucose được liên kết bởi β-1,4 glycoside, là vật liệu chủ yếu của vách tế bào thực vật và là nguồn carbohydrate phong phú nhất trong tự nhiên. Mức độ polimer hóa thường từ 100 đến 20.000. Các chuỗi cellulose gần nhau được liên kết với nhau tạo thành các tấm cellulose qua liên kết hydrogen và liên kết Vander Waal tạo thành cấu trúc tinh thể, phân tử dạng sợi, bền vững [43]. Khoảng 30 phân tử cellulose riêng lẻ được sắp xếp thành đơn vị lớn hơn gọi là sợi cơ bản, sau đó được bó thành sợi lớn hơn gọi là vi sợi và được cấu trúc thành những sợi cellulose. Sợi cellulose bền vững bởi các liên kết nội phân tử cũng như liên kết hydrogen nội phân tử. Sự xắp xếp các chuỗi riêng lẻ bên trong những sợi cơ bản đã được tìm hiểu từ sự phân tích tán xạ tia X [23]. Cấu trúc cellulose tinh thể bao gồm những cấu trúc cố định trong những vị trí riêng biệt có quan hệ chặt chẽ với những vị trí khác. Chúng có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhập không chỉ enzym mà thậm chí những phân tử nhỏ như nước. Bên cạnh cellulose cấu trúc tinh thể, những sai sót trong cấu trúc tinh thể đã dẫn đến hình thành một nhóm sợi cellulose có cấu trúc vô định hình. Sợi cellulose còn có những cấu trúc bất quy tắc khác như: những chỗ xoắn trong vi sợi, những lỗ trống trên bề mặt, những lỗ, hốc nhỏ và một số mạch nhỏ. Tổng diện tích tiếp xúc của sợi cellulose lớn hơn bề mặt tinh thể trong cấu trúc cùng kích thước. Sự không đồng nhất trong cấu trúc làm cho sợi bị hydrate bởi nước khi nhúng vào môi trường lỏng và cho phép sự xâm nhập bởi các phân tử lớn bao gồm các enzym thủy phân cellulose [23]. Phân tử cellulose rất bền vững, với thời gian bán rã là 5-8 triệu năm cho sự phân cắt liên kết β-1,4 glycoside tại 25 o C. Trong khi, quá trình phân hủy sinh học thường nhanh hơn và cung cấp dòng carbon cho khí quyển [43]. [...]... hợp Các nhóm vi khuẩn kị khí và hiếu khí có sự khác nhau trong cơ chế thủy giải cellulose Hầu hết các vi khuẩn kị khí phân hủy cellulose thông qua hệ thống cellulase phức hợp được tổ chức tốt như polycellulosome của Clostridium thermocellum [33] Mặc dù, các vi khuẩn kị khí tùy ý phân bố rộng rãi, giống Cellulomonas là giống vi khuẩn kị khí tùy ý duy nhất có hoạt tính phân hủy cellulase Các vi khuẩn. .. xác mức độ kị khí của vi khuẩn Thế oxy hóa khử có thể là một chỉ số kị khí chính xác hơn và cung cấp mức độ liên tục mối quan hệ với oxy của vi khuẩn [17] Mức độ oxy hóa hoặc khử của các chất hóa học có thể được định nghĩa bằng thế oxy hóa khử Vi khuẩn hiếu khí có nhiều hệ thống làm giảm thế oxy hóa khử và không bị ảnh hưởng nhiều trong môi trường có thế oxy hóa- khử cao Trong khi đó, vi khuẩn kị khí bị... là các enzym không được tổ chức cellulosome [11] 24 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên 1.5 Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase Theo truyền thống, mối quan hệ vi khuẩn với oxy được phân loại theo nhiều cấp độ: hiếu khí, hiếu khí tùy ý, kị khí tùy ý, kị khí (kị khí trung bình, kị khí giới hạn và kị khí tuyệt đối) Tuy nhiên, sự phân loại theo cách này chưa phân loại chính xác. .. năng cho sử dụng sinh khối thực vật cho sản xuất nhiên liệu sinh học [41] 1.4 Hệ thống enzym cellulase 1.4.1 Thành phần của cellulase Phân tích sinh hóa của hệ thống cellulase từ vi khuẩn kị khí, hiếu khí và từ nấm đã cho những kiến thức tổng quan về hệ thống enzym này Hệ thống cellulase được phân loại dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc của chúng Ba loại hoạt tính enzym cellulase cơ bản... biết vi khuẩn sinh cellulase ngay trên môi trường nuôi cấy Vì thế, môi trường nuôi cấy có chứa cellulose tinh thể được sử dụng cho phân lập Trong môi trường này, vi khuẩn sinh cellulase có khả năng tạo vòng phân giải cellulose tinh thể sau một khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp Các chủng vi khuẩn ưa nhiệt, kị khí sinh cellulase thường có khoảng nhiệt độ sống tương đối rộng 40-85oC Vi c phân lập các chủng. .. Actinomycetales hiếu khí và Clostridiales kị khí Dựa vào các đặc điểm sinh lí, vi khuẩn thủy giải cellulose có thể thấy bao gồm những nhóm sinh lí sau [23]: o Vi khuẩn kị khí, gram dương (Clostridium, Ruminococcus, và Caldicellulosiruptor) o Vi khuẩn gram dương hiếu khí (Cellulomonas và Thermobifida) o Vi khuẩn nhầy hiếu (Cytophaga, và Sporocytophaga) Thông thường, chỉ một vài loài trong những giống... Chủng vi khuẩn ưa nhiệt thủy giải cellulose Brevibacillus sp JXL có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất như cellulose tinh thể, CMC, xylan, cellobiose, glucose và xylose Enzym của Brevibacillus sp JXL có khả năng bền nhiệt rất cao, vẫn giữ được 50% sau khi xử lý tại 100°C trong một giờ 1.3 Đặc điểm vi khuẩn kị khí, ưa nhiệt sinh cellulase 1.3.1 Đặc điểm chung 1.3.1.1 Cơ chất ưu tiên Những loài vi khuẩn. .. năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là: “tài liệu của lịch sử tiến hóa, là thước đo tiến hóa , để là một thước đo tiến hóa, phân tử được chọn phải có các đặc điểm sau [1]: o Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát o Phân tử không được di truyền qua lại giữa các loài o Trình tự của sinh vật này có độ bảo tồn và biến động thích hợp o Phân tử phải có kích... cellulose [23]: 7 Luận Văn Thạc Sĩ Khóa 18 Hoàng Nguyên o Vi khuẩn hiếu khí và nấm: enzyme cellulase thường không gắn hay gắn yếu vào cellulose, sản xuất cellulase ngoại bào và oxy hóa sản phẩm thủy phân thành CO2 và nước o Vi khuẩn và nấm kị khí cho thấy khuynh hướng gắn enzyme cellulase vào cellulose, sản xuất ra phức hợp cellulase được tổ chức thành các cellulosome và tạo ra nhiều sản phẩm lên men... các chủng ưa nhiệt được nuôi cấy ở nhiệt độ 60oC Trong ống roll tube, các chủng phát triển và tạo vòng phân giải cellulose tinh thể sau khoảng 7 -10 ngày nuôi cấy tại nhiệt độ 600C Các khuẩn lạc thường có màu trắng và có kích thước tương đối nhỏ 1.6 Phương pháp định danh sinh học phân tử Phương pháp định danh vi sinh vật dựa vào đặc điểm di truyền là một phương pháp hiện đại cho kết quả chính xác trong . Đ I HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG Đ I HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HOÀNG NGUYÊN PHÂN LẬP, Đ NH DANH VÀ XÁC Đ NH Đ C ĐIỂM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG. Xác đ nh hàm lượng protein ngoại bào 42 2.2.3.4. Đ nh lượng hoạt tính cellulase tổng số 43 2.2.3.5. Bán đ nh lượng hoạt tính endoglucanase 44 2.2.3.6. Hoạt tính endoglucanase xác đ nh. 74 3.6. Đ nh danh vi khuẩn 75 3.6.1. Đ nh danh nhanh bằng phản ứng PCR với cặp mồi đ c trưng cho vi khuẩn Clostridium 76 3.6.2. PCR với cặp mồi universal và xây dựng cây phân loại