2.1.Vật liệu
2.1.1. Nguồn phân lập
Nguồn mẫu phân lập: đất mùn, đất ruộng, đất thịt, phân trùng quế thu nhận ở nhiều địa điểm khác nhau Kiên Giang, An Giang, Đồng Tháp, Tiền Giang, Long An, Tây Ninh, Đồng Nai, Thành Phố Hồ Chí Minh (phụ lục 1).
2.1.2. Thiết bị dụng cụ
2.1.2.1. Thiết bị thông dụng
Bể ổn nhiệt Cole Parmer BT-15 Máy Votex Scientific Industries Bộ điện di Protein Biorad Máy li tâm Hettich EBA 20 Bộ điện di DNA Cole Pamer Máy li tâm Hettich Mikro 20
Bếp Microwave Máy nước cất Aquatron
Cân phân tích A&D HR-200 Máy đo OD Cole Parmer 1100 RS Spectrophotometer
Đèn soi UV UVitec Máy PCR Thermocycler
Kính hiển vi Nikon eclipse 80i Máy khuấy từ Cole Palmer Nồi hấp vô trùng Hirayama HVA-85 Máy đo pH
Tủ ấm Sanyo Incubator MIR-162 Tủ sấy Tủ cấy vô trùng Sanyo MCV-710 ATS
Pipepman, đầu tip, eppendorf, cốc thủy tinh, đèn cồn, quả bóp cao su, que tạo giếng thạch.
2.1.2.2. Thiết bị phân lập vi khuẩn kị khí
Ống nghiệm kị khí Hungate, parafin lỏng, cysteine hydrochloride, chất chỉ thị thế oxy hóa-khử resazurin
Bộ thiết bị kị khí: bình khí hydrogen, bình hỗn hợp khí 80% N2 và 20% CO2, bộ điều khiển luồng khí Sanshin GR-8, thiết bị quay roll tube, bộ đầu kim thổi khí
2.1.2.3. Môi trường
Môi trường phân lập CT (DSMZ 122)
(NH4)2SO4 1.3g MgCl2.6H2O 2.6g KH2PO4 1.43g CaCl2.2H2O 0.13g NaCO3 5g FeSO4.7H2O 1.1mg Cysteine hydrochloride 1.5g Yeast extract 4.5g Resazurin 0.1% 1ml Cellulose tinh thể 10g Nước cất 1000ml pH 7.0 - 7.2
Môi trường được chuẩn bị dưới điều kiện thổi khí N2 và CO2. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút.
Môi trường CT agar cải biên
(NH4)2SO4 1.3g MgCl2.6H2O 2.6g KH2PO4 1.43g CaCl2.2H2O 0.13g NaCO3 5g FeSO4.7H2O 1.1mg Cysteine hydrochloride 1.5g Yeast extract 4.5g Resazurin 0.1% 1ml Glucose 10g Nước cất 1000ml pH 7.0 - 7.2
Môi trường được chuẩn bị dưới điều kiện thổi khí N2 và CO2. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút.
Môi trường khảo sát hoạt tính cellulase PCS
Trypton 5g
Yeast extract 1g
NaCl 5g
CaCO3 5g
Giấy lọc 1x6mm (50mg) 20 miếng
Rơm rạ xay nhuyễn 10g
Cysteine hydrochloride 1.5g
Resazurin 0.1% 1ml
Nước cất 1000ml
pH 7.0 - 7.2
Môi trường được chuẩn bị dưới điều kiện thổi khí N2 và CO2. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút [42]. CMC agar 1% CMC 1g Agar 17g Nước cất 1000ml Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. 2.1.2.4. Dung Dịch Hóa Chất
Dung dịch ly giải cellulosome (cellulosome lysis buffer): đệm Natri
acetate 50 mM (pH 5.0), DTT 10 mM, EDTA 10 mM và SDS 0.2% [11]
Dung dịch đệm PBS buffer: NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO4 1.44g,
KH2PO4 0.24g hòa tan trong khoảng 800ml nước cất, điều chỉnh pH 7.4 với HCl và NaOH, thêm nước cho tới 1 lít
Thuốc nhuộm congo red 0.1%: congo red 1g, pH 7.6±0.2, nước cất
1lít
o Dung dịch crystal violet: 2g tím kết tinh hòa tan trong 20ml ethanol 95%, 0,8g ammon oxalat hòa tan trong 80ml nước cất. Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối [8].
o Dung dịch iod: Hoà tan 1g iod trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI
khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối [8].
o Dung dịch safranin: nghiền 0.25g safranin trong cối sứ với 10ml
ethanol 95%, rửa bằng nước cất và thu gộp nước rửa vào ống đong. Bổ sung nước cất cho đủ 100ml [8].
Thuốc nhuộm bào tử
o Dung dịch lục malachite bão hoà 7,6% [8]
o Dung dịch safranin 0,5% [8]
Thuốc thử Bradford
o Thuốc thử coomassie blue G250: 5mg coomassie, 22.5g ethanol,
43.5g H3PO4, 500 ml nước cất [3], [4]
o Dung dịch albumin gốc: 10mg/ml, pha dãy nồng độ albumin chuẩn
từ dung dịch gốc với nồng độ từ 10-90 µg/ml [3], [4]
Hóa chất xác định hoạt tính cellulase tổng số
o Thuốc thử DNS: hòa tan 10.6g DNS và 9.8g NaOH trong 1416ml
nước cất. Sau khi hòa tan hoàn toàn, thêm 306g sodium potassium tartrate, 7.6ml phenol (500C), và 8.3g sodium metabisulfite, trộn đều [44].
o Đệm citrate 1M, pH 4.5: hòa tan 210g citric acid monohydrate trong
750ml nước cất, thêm 10-60g NaOH cho đến pH 4.3. Hòa tan hỗn hợp đến gần 1000ml và kiểm tra pH cuối, dùng NaOH điều chính pH đến 4.5 [44].
o Đệm citrate 50mM, pH 5: hòa tan đệm citrate 1M pH 4.5 bằng 19 lần
nước cất [44].
o Giấy lọc: 50mg/miếng, 1x6mm [44]
o Dung dịch glucose chuẩn: 10g/l [44]
Hóa chất điện di SDS – PAGE
Hóa chất điện di
o Tris-HCl 1M, pH 6.8: Tris 12.1g, thêm 50ml nước cất, thêm HCl đậm đặc chính pH về 6.8 sau đó thêm nước cho đủ 100ml [3], [4], [36], [10]
o Ammonium persulfate 10%: ammonium persulfate 1g, nước cất 10ml
[3], [4], [36], [10]
o Electrophoresis buffer: Tris 3g, glycine 14.4g, SDS 1g, thêm nước
cất cho tới 1 lít [3], [4], [36], [10]
o Separating gel 9%: acrylamide stock 30% 3ml, Tris-HCl 2M pH 8.8
2.5ml, TEMED 5µl, nước khử ion 4.945ml, ammonium persulfalt 10% 50µl [3], [4], [36], [10]
o Stacking gel 5%: acrylamide stock 30% 0.67ml, Tris-HCl 1M pH 6.8
1ml, TEMED 4µl, nước khử ion 2.3ml, ammonium persulfalt 10% 20µl [3], [4], [36], [10]
Hóa chất nạp mẫu protein
o 5x sample buffer: Tris-HCl 1M 0.6 ml, glycerol 50% 5ml, SDS 10%
2ml, 2-mercaptoethanol 0.5ml, bromophenol blue 1% 1ml, nước cất 0.9ml [3], [4], [36], [10]
Hóa chất nhuộm và giải nhộm protein
o Thuốc nhuộm coomassie blue: coomassie blue R-250 1g, methanol
450ml, glacial acetic acid 100ml, nước cất 450ml [3], [4], [36], [10]
o Thuốc giải nhuộm gel coomassie blue: methanol 100ml, glacial
acetic acid 100ml, nước cất 800ml [3], [4], [36], [10]
Hóa chất hồi tính và nhộm CMC
o Hóa chất hồi tính protein sau khi điện di SDS-PAGE: Tris-HCl
buffer 0.0625 M pH 6.8, sodium acetate buffer pH 4.8 [36]
o CMC ( 1 % ): CMC 1g, 100ml đệm sodium acetate, pH 5 [36]
Thang chuẩn protein (161-0304, Low range Biorad)
Protein Trọng lượng phân tử (Daltons)
Phosphorylase b 97.400
Serum albumin 66.200
Carbonic anhydrase 31.000
Trypsin inhibitor 21.500
Lysozyme 14.000
Dung dịch đệm Citrate buffer (pH 3-6.2)
o Dung dịch Citric acid 0.1M: 21.01g, nước cất 1 lít [2]
o Dung dịch Trinatri Citrate 0.1M: 29.41g, nước cất 1 lít [2]
Giá trị pH 4 5 6
Dung dịch Citric acid 0.1M (ml) 33 20.5 9.5
Dung dịch Citrate trinatri 0.1M (ml) 17 29.5 40.5
Dung dịch đệm Tris-HCl (pH 7-9)
o Dung dịch Tris 0.2M: 24.24g, nước cất 1 lít [2]
o Dung dịch HCl 0.2M: 16.8ml HCl 37%, nước cất 1 lít [2]
Giá trị pH 7 8 9
Dung dịch Tris 0.2M (ml) 50 50 50
Dung dịch HCl 0.2M (ml) 44.2 26.8 5
Hóa chất phản ứng PCR
o Thành phần phản ứng PCR: DNA khuôn mẫu, dNTP 2.5mM, mồi
xuôi 10mM, mồi ngược 10mM, MgCl2 50mM, 10X amonium buffer, Tag polymerase, nước khử ion
o Hóa chất tách DNA trực tiếp: DNAzol® Direct
o Trình tự mồi được sử dụng: [20], [32]
Primer Trình tự Vị trí Chuyên biệt 27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ 8-27 16S rDNA 1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ 1492-1533 16S rDNA Primer Trình tự (5’-3’) Vị trí Chuyên biệt S-G-Clos-0586-S-21 CTCAACTTGGGTGCTGCATTT 586 - 607 Clostridium
Hóa chất điện di DNA
o Agarose Sigma
o Ethidium Bromide: 10mg/ml
o TAE buffer 50X: tris 242g. acetic acid 57.1ml, EDTA 0.5M pH 8,
100ml, thêm nước cất cho đủ 1000ml. Từ dung dịch mẹ pha loãng thành TAE buffer 1X
o 10X loading buffer: 0.25% bromophenol blue, 40% glycerol trong
TAE buffer 1X
o Thang chuẩn D0428 Sigma (Kb): 10, 8, 6, 5 ,4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1, 0.5
Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR
The illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit: cột GFX, Capture buffer, Washing buffer, và colection buffer (Tris-HCl và nước cất).
2.1.2.5. Chủng vi khuẩn đối chứng
o E. coli DH5α
o C. saccharobutylicum
2.2.Phương pháp thực hiện
2.1.1. Phương pháp tạo môi trường kị khí
Mục đích
Loại bỏ oxy chuẩn bị môi truờng cho nuôi cấy vi khuẩn kị khí. Môi trường được đun nóng và sục hỗn hợp khí N2 và CO2 đẩy oxy ra khỏi môi trường cho đến khi chất chỉ thị resazurin chuyển từ màu hồng sang không màu.
Trong môi trường nuôi cấy, tác nhân khử (cysteine hydrochloride hoặc L- glutathione) được thêm vào để làm giảm thế oxy hoá-khử của môi trường. pH của môi trường khi thanh trùng vào khoảng 7.0±0.2. Để giữ pH mong muốn ổn định khi thanh trùng nên chỉnh pH cao hơn 0.1-0.2 đơn vị trên pH mong muốn. Những ống môi trường nào có màu hồng sau khi thanh trùng đều bị loại bỏ.
o Hoà tan thành phần môi trường vào erlen nước cất sao cho thể tích môi trường gần bằng với thể tích erlen
o Chỉnh pH môi trường về giá trị mong muốn
o Đậy kín bình erlen bằng giấy bạc và cho ống sục khí N2 và CO2 qua miếng giấy bạc
o Tiến hành vừa sục khí vừa khuấy bằng máy khuấy từ tại nhiệt độ 60oC cho đến khi môi trường chuyển dần từ màu hồng sang không màu
o Làm lạnh môi trường đến khoảng nhiệt độ phòng và thêm tác nhân khử được vào môi trường
o Tiếp tục sục khí và khuấy bằng máy khuấy từ tại nhiệt độ 60oC cho đến khi môi trường chuyển dần từ màu hồng sang không màu
o Phân phối môi trường vào ống nghiệm Hungate trong khi vẫn sục khí vào ống nghiệm để tạo môi trường kị khí
o Nhẹ nhàng đậy kín nắp ống Hungate và đem hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút
o Môi trường được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng và sử dụng trước khi resazurin chuyển sang màu hồng
Kết quả
Môi trường trong ống nghiệm kị khí không màu
2.1.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí sinh cellulase
Mục đích
Sử dụng phương pháp ống roll tube (1950, Hungate) và môi trường phân lập có cellulase tinh thể (CT agar) cho nuôi cấy vi khuẩn kị khí, sinh cellulase. Trong ống roll tube, môi trường hình thành một lớp màng mỏng môi trường trên thành ống Hungate. Sau khi ủ với thời gian thích hợp sẽ hình thành vòng phân giải cellulose tinh thể trong ống roll tube. Tiến hành thu nhận các khuẩn lạc và làm thuần trên môi trường thạch nghiêng CT agar cải biên.
Cách thực hiện
o Cấy 0.5ml dịch pha loãng vào ống nghiệm Hungate có 7.5ml môi trường CT agar đã được làm tan chảy và để nguội ở nhiệt độ khoảng 60- 70oC
o Xoay tròn ống nghiệm trên dụng cụ xoay tròn với tốc độ 60 vòng/phút trong nước lạnh cho đến khi agar đông
o Nuôi cấy trong thời gian 7-10 ngày tại nhiệt độ 60oC
o Quan sát khả năng tạo vòng phân giải cellulase tinh thể trong ống roll tube và cấy truyền sang môi trường thạch nghiêng
Kết quả
Thu nhận khuẩn lạc trong ống roll tube có vòng phân giải cellulase tinh thể
2.2.2. Đặc điểm sinh lí hình thái vi khuẩn
2.2.2.1. Đặc điểm khuẩn lạc
Mục đích
Ghi nhận sự hình thành, màu sắc, kích thước khuẩn lạc sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch nghiêng CT agar cải biên.
Cách tiến hành
o Cấy ria chủng vi khuẩn phân giải cellulose tinh thể trên môi trường
CT agar cải biên
o Nuôi cấy ở nhiệt độ 60oC trong 10 ngày
o Quan sát khả năng hình thành khuẩn lạc trong 7-10 ngày
Kết quả
Ghi nhận sự hình thành, màu sắc, kích thước khuẩn lạc
2.2.2.2. Phương pháp nhuộm Gram
Mục đích
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp Hucker cải tiến [8].
Nhuộm Gram là một phương pháp nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm: Gram dương và Gram âm, dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Vi
này có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể iod. Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài [8].
Nhuộm Gram dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và lugol. Dựa vào phản ứng này vi khuẩn Gram dương bắt màu tím và vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng [8].
Ngoài ra nhuộm Gram còn giúp ta quan sát rõ và phân biệt về hình dáng, cấu tạo, cách phân bố của các vi khuẩn khác nhau [8].
Cách thực hiện
o Nuôi cấy chủng vi khuẩn trong môi trường CT cải biên lỏng trong 10 ngày
o Hút 0.1ml môi trường và cố định tế bào trên lam kính sạch
o Nhuộm tế bào vi khuẩn bằng crystal violet trong 20 giây, dùng nước cất vô trùng rửa vết nhuộm
o Nhuộm lại bằng dung dịch iodine trong 1 phút. Đổ thuốc nhuộm iodine, và tẩy màu với alcohol 95% trong 10-20 giây. Ngừng rửa khi vết nhuộm đã bị mất màu, rửa bằng nước sạch trong 5 giây.
o Nhuộm dung dịch safranin trong 2-3 phút, dùng nước cất vô trùng rửa trong vài giây, thấm nước với giấy thấm và để khô tự nhiên
o Xem mẫu vật dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X
Kết quả
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu hồng
2.2.2.3. Phương pháp nhuộm bào tử
Mục đích
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp Schaeffer-Fulton [8].
Nội bào tử được tạo ra bởi nhiều loài vi khuẩn, trong đó đáng chú ý là hai giống Clostridium và Bacillus. Những cấu trúc bảo vệ này được hình thành để đáp ứng với điều kiện khắc nghiệt của môi trường như: nhiệt độ, khan nước, chất hóa học, sự thay đổi pH và thiếu chất dinh dưỡng. Khi tồn tại ở hình thức bào tử, vi
động. Khi điều kiện môi trường trở nên thích hợp, nội bào tử sẽ “nảy mầm” và trở lại hình thức hoạt động của vi khuẩn.
Những kĩ thuật nhuộm thông thường như nhuộm Gram, không nhuộm được những cấu trúc cứng và bền. Để nhuộm bào tử, malachite green được dùng để nhuộm bào tử ở nhiệt độ cao. Phương pháp Schaeffer-Fulton dùng malachite green nhuộm bào tử và safranin nhuộm phần sinh dưỡng của tế bào [8].
Cách thực hiện
o Vi khuẩn kị khí sinh cellulase được nuôi trong môi trường CT cải biên lỏng trong 30 ngày
o Dùng pipepman đưa 100µl dịch nuôi cấy lên lam kính
o Phủ lên trên một mảnh giấy thấm nhỏ và thấm ướt với malachite green. Xông hơi trên nước sôi trong khoảng 5-10 phút cho đến khi vết nhuộm malachite khô.
o Sau khi miếng lam đã được làm nguội loại bỏ giấy thấm và rửa sạch với nước trong 30 giây
o Nhuộm với safranin khoảng 20 giây, rửa sạch nhanh với nước cất để loại bỏ safranin
o Làm khô vết trải với giấy thấm và kiểm tra khả năng tạo bào tử dưới kinh hiển vi
Kết quả
Nội bào tử sẽ có màu xanh và tế bào sinh dưỡng sẽ có màu hồng
2.2.3. Khảo sát khả năng sinh cellulase trên môi trường PCS
Mục đích
Điều kiện phát triển ảnh hưởng rõ rệt đến hoạt tính thủy giải cellulose của vi khuẩn. Để vi sinh vật tổng hợp cellulase thì trong môi trường nuôi cấy phải có cellulose vừa là nguồn carbon vừa là chất cảm ứng. C. thermocellum điều hòa sản xuất cellulase phụ thuộc vào nguồn carbon và nguồn năng lượng có sẵn. Mức độ sản xuất enzyme c a o khi nguồn carbon và năng lượng có sẵn bị giới hạn và có sự hiện diện cellulose tinh thể. Các nguồn carbon thường dùng trong nuôi cấy
rơm rạ, bã mía…
Nhiều loài vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase có phạm vi rộng trong việc sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau: cellulose tinh thể, hemicellulose, pectin, tinh bột, lignin. Trong môi trường nuôi cấy có những nguồn cơ chất giới hạn chúng sẽ biểu hiện những enzym mà có khả năng sử dụng các nguồn carbon duy nhất này. Thử nghiệm này nhằm xác định khả năng sinh trưởng của vi khuẩn trên môi trường chỉ có rơm rạ và giấy lọc là nguồn carbon duy nhất.
Sơ đồ thí nghiệm:
Cách tiến hành
Các chủng được nuôi cấy trong môi trường PCS và quan sát khả năng sử dụng giấy lọc và rơm rạ trong quá trình nuôi cấy.
Sau 20 ngày, dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc. Phần dịch được ly tâm 5000 vòng/ phút trong 2 phút, loại bỏ tủa thu dịch lỏng. Dịch lỏng được tủa với cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:3, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút thu nhận tủa và hòa tan trong 5ml đệm PBS buffer (Dung dịch protein A).
Sau 20 ngày, dịch nuôi cấy được xử lý dung dịch cellulosome lysis buffer Cân, xác định trọng lượng Lọc qua giấy lọc
Dịch nuôi cấy sau 20 ngày
Lọc qua giấy lọc
Xử lý Cellulosome lysis buffer
Tủa protein
Dịch tủa protein (A)
Dịch lọc
Bã rơm rạ và giấy lọc
Dịch tủa protein (B)
5000 vòng/ phút trong 2 phút loại bỏ tủa, thu dịch lỏng. Phần dịch được tủa với cồn tuyệt đối theo tỷ lệ 1:3, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút thu nhận tủa và hòa tan trong 5ml đệm PBS buffer (Dung dịch protein B).