1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.6.Phương pháp định danh sinh học phân tử
Phương pháp định danh vi sinh vật dựa vào đặc điểm di truyền là một phương pháp hiện đại cho kết quả chính xác trong thời gian ngắn, thao tác đơn giản. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền và được ứng dụng trên một số kỹ thuật như [1]:
Sử dụng mẫu dò (nucleic acid probes): mẫu dò là một trình tự nucleic acid
được sử dụng để xác định sự hiện diện một trình tự nucleotide đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã được biết tới. Mẫu dò có thể là một mạch đơn của nucleic acid, thông thường là DNA, được gắn với một nhân tố nhận biết (có thể là phóng xạ). Tuy nhiên, trong một vài trường hợp kỹ thuật này cho độ nhạy không cao. Một số vi sinh vật có thể sử dụng kỹ thuật mẫu dò như: Campylobacter sp.,
Khuếch đại một trình tự DNA đặc hiệu nhờ PCR: kỹ thuật PCR được sử dụng để khuếch đại một trình tự đặc hiệu ở bất kỳ môi trường nào (đất, nước, thực phẩm, cơ thể sinh vật). Kỹ thuật này cho phép định danh được các vi sinh vật không thể nuôi cấy hiện diện rất ít ở trong mẫu. Kỹ thuật này rất được ưa chuộng vì đơn giản, thời gian phát hiện ngắn. Tuy nhiên, kỹ thuật này cần thiết phải có thông tin đầy đủ về trình tự DNA của các loài vi sinh vật, nhằm thiết lập cặp mồi đặc hiệu cho từng loài hay từng giống vi khuẩn [1].
Giải trình tự gen mã hóa cho tiểu phần RNA 16S của ribosome: từ năm
1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là: “tài liệu của lịch sử tiến hóa, là thước đo tiến hóa”, để là một thước đo tiến hóa, phân tử được chọn phải có các đặc điểm sau [1]:
o Phân tử phải có mặt ở tất cả các sinh vật khảo sát
o Phân tử không được di truyền qua lại giữa các loài
o Trình tự của sinh vật này có độ bảo tồn và biến động thích hợp
o Phân tử phải có kích thước đủ lớn để chứa nhiều thông tin.
Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong sinh tổng hợp protein và ba loại phân tử rRNA (5S, 16S và 23S). Bởi vì rRNA đóng vai trò quan trọng đảm nhận một chức năng duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và đặc trưng cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được xem là một thước đo tiến hóa ở sinh vật và cũng chính là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không chỉ dựa vào rRNA mà dựa vào trình tự rDNA (trình tự mã hóa rRNA), vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Trong các loại trình tự rRNA thì phân tử rRNA 16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước vừa phải của chúng (khoảng 1500 ribonucleotide). Trong khi đó, phân tử 5S (khoảng 120 ribonucleotide) chứa quá ít thông tin và phân tử 23S (khoảng 3000 ribonucleotide) lại quá dài gây khó khăn cho việc giải trình tự [1].
Khi một trình tự rDNA 16S được giải mã hoàn toàn ta có thể định danh loài vi sinh vật mục tiêu nhờ so sánh với trình tự rDNA 16S của loài vi sinh vật đang
ngân hàng gen nhờ vào trình tự Blast, hay kết hợp sử dụng phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự. Từ những cơ sở dữ liệu này ta có thể vẽ cây phát sinh loài (phytogentic tree), thể hiện mối quan hệ tiến hóa giữa các loài cần định danh. Ngày nay, rDNA 16S ngày càng được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu về quá trình tiến hóa ở vi sinh vật hay định danh vi sinh vật [1].
Hệ thống phát sinh loài là một hệ thống nghiên cứu về các mối quan hệ tiến hóa. Phân tích hệ thống phát sinh loài tức là ước tính ra các mối quan hệ này. Lịch sử tiến hóa được suy ra từ phân tích hệ thống phát sinh loài, được mô tả bởi sơ đồ dạng cây, mô tả các mối quan hệ thừa hưởng các phân tử di truyền giữa các sinh vật. Nguyên tắc cơ bản của cây phát sinh loài là những thành viên của cùng một nhóm sẽ cùng bắt nguồn từ một tổ tiên chung và có mối quan hệ gần gũi với nhau hơn là những thành viên của các nhóm khác.