1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.4.5. Cellulosom e Hệ thống cellulase phức hợp
1.4.5.1. Đặc điểm chung
Những vi khuẩn kị khí thiếu khả năng xâm nhập vào bên trong vật liệu cellulose và do đó chúng phải tìm ra một cơ chế hữu hiệu cho sự phân hủy cellulose khi có sự hiện diện cạnh tranh của nhiều vi sinh vật khác và bị giới hạn bởi ATP cho sự tổng hợp cellulase. Điều này đã dẫn đến sự phát triển của “Hệ thống cellulase phức hợp”, gọi là cellulosome, thường được tìm thấy ở các loài
Clostridia và Ruminococcus [23].
Các cellulosome kết hợp với nhau tạo thành các polycellulosome và được gắn lên vách tế bào có đường kính 60-200 nm. Mỗi polycellulosome chứa đựng vài trăm cellulosome [7]. Cellulosome là phức hợp ngoại bào lớn và tương đối bền vững, trọng lượng phân tử từ 2-16 MDa đối với cellulosome và có thể đạt đến trọng lượng 100 MDa đối với polycellulosome [12], [33].
thấy những khối u trên bề mặt tế bào C. thermocellum và phức hợp này chứa protein không có hoạt tính xúc tác có chức năng gắn liên kết các tiểu đơn vị enzym. Cellulosome không chỉ phân hủy cellulose tinh thể, mà c òn p hâ n hủ y hemicellulose, chitin, thậm chí cả pectin [12].
Cellulosome có khả năng phối hợp hoạt tính các enzym trong không gian gần với vách tế bào vi khuẩn và có khả năng phối hợp hoạt tính giữa các cellulase hiện diện bên trong cellulosome. Cellulosome thường chứa 6 đến 13% carbohydrate, có vai trò bảo vệ khỏi hoạt tính của protease và cũng có thể có vai trò quan trọng trong sự nhận diện các cohensin [23]. Các sản phẩm thủy giải cellulose cũng được tế bào hấp thu tốt hơn do có sự tiếp xúc với vách tế bào [34]. Cellulosome gắn kết rất linh hoạt với cellulose tinh thể [12].
Cellulosome được tìm thấy ở nhiều loài vi khuẩn: C. cellulovoran, C.
cellulolyticum, C. josui, C. acetobutylicum, Acetovibrio cellulolyticus,
Bacteroides cellulosolvens, R. albus, R. flavefaciens, Vibrio sp. và nhóm nấm kị
khí Neocallimastix, Piromyces và Orpinomyces [11], [23].
Thành phần quan trọng của cellulosome là protein scaffoldin không có hoạt tính xúc tác, có chức năng tập hợp các tiểu đơn vị cellulase. Các tiểu đơn vị xúc tác chứa những vùng dockerin khác nhau có trách nhiệm gắn vào scaffoldin. Mối quan hệ này được thể hiện v ù n g cohesin trên scaffoldin, gắn kết với vùng, dockerin trên enzyme và CBD trên scaffoldin liên kết phức hợp với cellulose [11]. Có ít nhất tám gen scaffoldin từ vi khuẩn thủy giải cellulose đã được giải trình tự. Chúng bao gồm cipA của C. thermocellum, cbpA của C. cellulovoran, cipC của C.
cellulolyticum, cipA của C. josui, cipA của C. acetobutylicum , scaB của R.
flavefacien, cipBc của B. cellulosolven và cipV của A. cellulolyticus. Phức hợp
cellulosome của C. thermocellum tương tự như những loài vi khuẩn ưa nhiệt trung bình C. cellulovoran và C. cellulolyticum [11].
Bảng 1.2. Vi khuẩn sản xuất hệ thống cellulosome [12]
Chủng vi khuẩn Nhiệt độ tối ưu Nguồn phân lập
Acetivibrio cellulolyticus M Sewage
Bacteroides cellulosolvens M Sewage
Clostridium acetobutylicum M Soil
Clostridium cellulovorans M Wood fermenter
Clostridium cellobioparum M Rumen
Clostridium cellulolyticum M Compost
Clostridium josui M Compost
Clostridium papyrosolvens M Paper mill
Clostridium thermocellum T Sewage soil
Ruminococcus albus M Rumen
Ruminococcus flavefaciens M Rumen
Ruminococcus succinogenes M Rumen
M, mesophilic; T, thermophilic (trên 50°C)
Mặc dù, C. acetobutylicum không thủy phân cellulose, p h â n t í c h trình tự genome cho thấy có sự hiện diện của nhóm gen mã hóa cho cellulosome. Nhóm gen này bao gồm gen mã hóa protein scaffolding CipA, endocellulase Cel48A, vài endoglucanase nhóm 5 và 9, mannanase Man5G và protein kị nước, OrfXp. Tổ chức gen này tương đồng với của C. cellulolyticum [11], [6].
Scaffolding protein (scaffoldin)
Cellulosome bao gồm protein scaffolding, kết hợp với nhiều loại enzym trong cellulosome. Protein scaffolding, cũng được gọi là “scaffoldin”, đây là protein không có hoạt tính xúc tác gồm nhiều cohesin và vùng CBD, vùng ưa nước, vùng dockerin II, vùng có hoạt tính enzym và nhiều vùng chức năng chưa được xác định trên scaffoldin [6], [12].
Cohesin và Dockerin
Các cohesin hiện diện trong scaffoldin và có vị trí liên kết với vùng dockerin của enzym trên cellulosome. Tương tác cohesin-dockerin đóng vai trò quan trọng trong sự xắp xếp của cellulosome. Số lượng cohesin có trong scaffoldin khác nhau giữa các loài. Có sự tương đồng trong trình tự amino acid giữa cohesin từ những loài khác nhau. Tuy nhiên, các cohesin có sự chuyên biệt trong tương tác với các dockerin, cohesin của C. thermocellum
không tương tác với dockerin của C. cellulolyticum và ngược lại [6], [12].
Có hai loại cohesin: cohesin loại I gắn chuyên biệt với dockerin loại I trên tiểu đơn vị xúc tác, và cohesin loại II trên protein bề mặt tế bào gắn kết dockerin loại II của scaffoldin vào vách tế bào. Tất cả enzyme thuộc cellulosome chứa vùng dockerin. Nếu enzyme không chứa dockerin, chúng không phải là thành phần của cellulosome[11].
Ở loài C. thermocellum, trình tự genome cho thấy có ít nhất 72 protein chứa dockerin nhưng chỉ có chín cohesin trên phân tử scaffoldin. Cohesin có độ tương đồng cao và năm trong số đó có sự tương đồng hơn 90%. Cohesin của một chủng nhận biết gần như tất cả các dockerin của chủng đó [9]. CelD là endoglucanase hoạt động nhất, scaffoldin gia tăng hoạt tính của CelD ít nhất 10 lần trên avicel nhưng không có hoạt tính khi CelD thiếu dockerin [11].
Calcium là kim loại chính của cellulosome, tương tác giữa dockerin và cohesin yêu cầu Ca2+ ở nhiều loài như C. thermocellum và C. cellulolyticum. Do đó, cellulosome có thể bị phân rã bởi nồng độ EDTA trung bình. EDTA kìm hãm hoạt tính của cellulosome do chúng có khả năng gắn kết với Ca2+ [15].
cellulosome. Sự gấp cuộn của protein tạo thành dockerin phụ thuộc Ca2+, giải thích tại sao Ca2+ cần thiết cho tương tác cohesin-dockerin và khả năng bền vững của cellulosome [25].
Các thành phần của cellulosome bị phân rã khi xử lý với SDS-EDTA- DTT. Cellulosome bị phân rã dưới điều kiện không biến tính khi ủ tại nhiệt độ 60°C có sự diện của EDTA và cellulose tinh thể. Trong quá trình phân tách, scaffoldin vẫn gắn vào cellulose nhưng các tiểu đơn vị bị phóng thích [11].
Cellulosome cũng có thể bị phân rã mà không mất hoạt tính thủy giải cellulose tinh thể khi dùng đ ệ m 50 mM Na acetate (pH 5.0) chứa 10 mM DTT, 10 mM EDTA và 0.2% SDS tại 30°C trong 25 phút [9].
Cellulose-Binding Domain
Vùng liên kết carbohydrate (CBD) của scaffoldin liên kết chặt chẽ cellulosome với cơ chất cellulose. CBD liên kết cellulosome với cellulose tinh thể hiệu quả hơn đối với cellulose vô định hình [12].
Sự tương tác CelS, CelD và endoglucanase trên scaffoldin với cơ chất cellulose thông qua cấu trúc CBD. Các CBD khác nhau gắn trên những vị trí khác nhau trên cellulose tinh thể. S o s á n h g i ữ a CBD của CipA ở loài C.
thermocellum với hai loại ở T.reesei và một ở Cellulomonas fimi, CBD của CipA
có nhiều vị trí kết hợp với phân tử cellulose hơn [11].
CBD của CipA ở loài C. thermocellum đã được tạo dòng, biểu hiện trong
E. coli, và cấu trúc của chúng đã được xác định. CBD cũng gắn kết với Ca2+ mà
chức năng chưa được biết đến. Cấu trúc CBD của CipC ở loài C. cellulolyticum
cũng đã được xác định. Chúng bao gồm vị trí gắn kết bề mặt gắn kết cellulose và một rãnh cạn với chức năng chưa được biết đến [11].