1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.5. Phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase
Theo truyền thống, mối quan hệ vi khuẩn với oxy được phân loại theo nhiều cấp độ: hiếu khí, hiếu khí tùy ý, kị khí tùy ý, kị khí (kị khí trung bình, kị khí giới hạn và kị khí tuyệt đối). Tuy nhiên, sự phân loại theo cách này chưa phân loại chính xác mức độ kị khí của vi khuẩn. Thế oxy hóa khử có thể là một chỉ số kị khí chính xác hơn và cung cấp mức độ liên tục mối quan hệ với oxy của vi khuẩn [17]. Mức độ oxy hóa hoặc khử của các chất hóa học có thể được định nghĩa bằng thế oxy hóa khử. Vi khuẩn hiếu khí có nhiều hệ thống làm giảm thế oxy hóa khử và không bị ảnh hưởng nhiều trong môi trường có thế oxy hóa-khử cao. Trong khi đó, vi khuẩn kị khí bị tác động mạnh khi trong môi trường nuôi có thế oxy hóa- khử cao [17].
Trong tự nhiên oxy là một trong những chất có thế oxy hóa khử rất cao (O2/2O2- có thế oxy hóa – khử là +0.81V). Oxy có thể tác động tế bào vi khuẩn thông qua phản ứng hóa học với các thành phần của môi trường và tế bào. Do đó, oxy phân tử cần được loại bỏ trong môi trường nuôi cấy kị khí để tạo nên một thế khử thấp. Một số vi khuẩn kị khí giới hạn và kị khí tuyệt đối chỉ phát triển được trên môi trường có thế khử rất thấp (ví dụ: vi khuẩn kị khí sinh methane chỉ có thể phát triển trong môi trường khi có thế oxy hóa khử thấp hơn -0.33V). Thế oxy hóa- khử bền vững trong môi trường nuôi cấy được cân bằng bởi tác nhân khử và tác nhân oxy hóa: khi tác nhân oxy hóa được thêm vào thế oxy-khử sẽ tăng, ngược lại khi thêm tác nhân khử thế oxy-khử sẽ giảm [17].
Do đó, để nuôi cấy các vi khuẩn kị khí giới hạn, chúng ta sẽ gặp nhiều khó khăn khi thiết lập môi trường có thế khử thấp và giới hạn oxy. Để thực hiện điều này, môi trường trong quá trình chuẩn bị phải loại bỏ oxy và các tác nhân khử sẽ được thêm vào môi trường nuôi cấy. Các tác nhân khử nên được cho vào cuối cùng khi chuẩn bị môi trường và nồng độ của các chất khử phải được tính toán thích hợp để tránh gây độc cho vi khuẩn [17].
Phương pháp phân lập vi khuẩn trên đĩa petri truyền thống không phù hợp cho việc phân lập các vi khuẩn kị khí giới hạn. Nhiều phương pháp phân lập vi khuẩn kị khí đã được đưa ra nhưng việc phân lập các vi khuẩn kị khí đạt hiệu quả
1950). Trong ống roll tube môi trường agar được phân bố một lớp mỏng mặt trong của ống nghiệm trong điều kiện không có oxy. Kỹ thuật này đã có nhiều thay đổi và cải tiến khi bắt đầu xuất hiện [17].
Trong ống Hungate, môi trường nuôi cấy và vi khuẩn được đặt dưới điều kiện của khí không chứa oxy như: carbon dioxide, hydrogen, nitrogen hoặc những hỗn hợp các chất khí này. Carbon dioxide là chất khí thường được sử dụng bởi vì chúng nặng hơn không khí, rẻ tiền và có thể đóng vai trò là chất đệm [17].
Hơn nữa, việc phân lập vi khuẩn kị khí ưa nhiệt sinh cellulase còn đòi hỏi có thể nhận biết vi khuẩn sinh cellulase ngay trên môi trường nuôi cấy. Vì thế, môi trường nuôi cấy có chứa cellulose tinh thể được sử dụng cho phân lập. Trong môi trường này, vi khuẩn sinh cellulase có khả năng tạo vòng phân giải cellulose tinh thể sau một khoảng thời gian nuôi cấy thích hợp .
Các chủng vi khuẩn ưa nhiệt, kị khí sinh cellulase thường có khoảng nhiệt độ sống tương đối rộng 40-85oC. Việc phân lập các chủng ưa nhiệt được nuôi cấy ở nhiệt độ 60oC. Trong ống roll tube, các chủng phát triển và tạo vòng phân giải cellulose tinh thể sau khoảng 7 -10 ngày nuôi cấy tại nhiệt độ 600C. Các khuẩn lạc thường có màu trắng và có kích thước tương đối nhỏ.