TRUONG DAI HOC CAN THO
KHOA NONG NGHIEP & SINH HOC UNG DUNG BO MON THU Y
DINH VAN HAU
PHAN LAP, DINH DANH, KIEM TRA DOC
LUC CUA VI KHUAN ENTEROTOXINGENIC
ESCHERICHIA COLI TREN HEO CON TIEU CHAY TAI TINH VINH LONG
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: THÚ Y
_ 6)
Can Tho, 2013
Trang 2
TRUONG DAI HOC CAN THO
KHOA NONG NGHIEP & SINH HOC UNG DUNG BO MON THU Y
Luận văn tốt nghiệp
Ngành: THÚ Y
Tên đề tài:
PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH, KIÊM TRA DOC LUC CUA VI KHUAN ENTEROTOXINGENIC
ESCHERICHIA COLI TREN HEO CON
TIEU CHAY TAI TINH VINH LONG
Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
Trang 3TRUONG DAI HOC CAN THƠ
KHOA NONG NGHIEP & SINH HOC UNG DUNG
BO MON THU Y
Dé tài: “Phân lập, định danh, kiếm tra độc lực của vi khuẩn Enterotoxigenic Escherichia coli trén heo con tiéu chay tai tinh Vinh Long” do sinh vién
Dinh Van Hau, thực hiện tại phịng thí nghiệm vệ sinh thực phẩm, Bộ mơn
Thú Y, khoa Nơng nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ, từ
tháng 08/2013 đến tháng 11/2013
Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013 Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013
Duyệt Bộ Mơn Cán bộ hướng dẫn
Lý Thị Liên Khai
Cần Thơ, ngày thán 12 năm 2013
Trang 4LOI CAM ON
Trong thời gian thực hiện đề tài tơi đã nhận được sự giúp đỡ của nhiều người, tơi xin gửi lời chân thành cảm ơn đến những người đã quan tâm, lo lắng và
chia sẻ và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện đề tài
Con xin kính dâng lên cha, mẹ lịng biết ơn sâu sắc, người suốt cả cuộc đời hy sinh vì tương lai sự nghiệp của các con
Thành kính ghi ơn cơ Lý Thị Liên Khai, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tơi trong trong suốt thời gian thực hiện dé tai và hồn thành luận văn này
Trang 5MUC LUC Trang bia Trang tua Trang GUY Gt eceeccecesceceeeesecseeseesesesccsccsecsecseeaeeaeeaeeaeeesaeecsessetseeseeaeeeeeeeeees i iu ii 01 iii M1818 %““ vi Danh sách hình - ¿- ¿+ << 13 4 1E E111 1T TH TH Tàn HH nhiệt vi MP ),019/0nïơ 11 007887 vi 082 ix
CHUONG 1: DAT VAN DE ceesesssssssssssseeseseesssssnieeeseecessnsnnesesecessssnnneteeee 1 CHUONG 2: CO SO LY LUAN Li eescsssssessesssessssssneeeesessssnnneieeeseessssnnneeeeeenin 3
2.1 Tinh hình nghiên cứu trong và ngồi nước về vi khuân E coli gây
I090/8519)89/:) 0058:1201 1.7 3
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nưỚc .- + ++csx+exsx+xxeessers 3 2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nưỚC ¿5+ + Sx+£vestseessvrs 5
2.2 Đặc điểm sinh lí heo €Oï -2 2 SESE2EESEEEEEE2EESEEE111211211 21121127172 5
2.2.1 Chức năng thần kinh và điều tiết nhiệt - 2 5+ 5z 52 5
2.2.2 Bộ máy tiêu hĩĨa tàng HT HT HH HH 6
2.2.3 Vi sinh vật đường ruột của heo CON 6c Sex +xssxsrerssvre 7
2.3 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy heo con -2- 5¿csz+csz+rx 8
2.3.1 Tiêu chảy do vi KHUN eecceeccecccessseesseessessseessecssecssessseesseessesssecssecase 8
2.3.2 Tiêu chảy O VITUS cv ng ng 10
2.3.3 Tiêu chảy do ký sinh trùng - 2c sec 10
2.3.4 Tiêu chảy do thức ăn nhiễm nắm mốc 2- 2: ©z++++ I1
2.3.5 Tiêu cháy do ảnh hưởng của yếu tố mơi trường - 11
2.4 Vi khwdn Escherichia COli ceccccccccsscssssesssssssessssessessseessesssecssesssecssesssecssees 12 2.4.1 Lịch sử nghiÊn CỨU . << 1S 9k9 9t ng ng gi, 12 2A.2 PHAN Odd oo ằằẲ 12
2.4.3 Đặc điểm của vi khuẩn E coli -cccccvceeeeeeerrrrrrrrrrrrrer 13
Trang 62.4.4 Cầu trúc kháng nguyên -2-2+©+z+2E++tEEEEtEEkEtrrkerrrkerrres 14
2.4.5 Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E coli -5c©25cccscscscccsez 17 2.4.6 Sức đề kháng của vi khuẩn 2 ©+z+2+ecerxererrerrrkerrrex 22
2.4.7 Khả năng gây bệnh 6 + th St ng 22
2.5 Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli ở heo con -2- sec: 23
2.5.1 Điều kiện xuất hiện bệnh -2¿-©2+z+22cvrrstzrxrrrrrrerrrt 23 2.5.2 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy -2-22©2+z2EEcEEkEtzrkerrrkerrres 24
2.5.3 Triệu chứng và bệnh tích: .- 5+ ++++e*+s£+t£+teexeeresseseeeses 24
2.5.4 Chẩn đốn và chân đốn phân biệt . 2¿- 552 ©2522cszccse2 25
2.5.5 Điều trị và phịng bệnh - - - + tt hit 27
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP 2 -c:©c5s: 29 3.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu -¿-c5<©c5e¿ 29
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ¿5 s x+cxsEtzEzrerkerxereee 29
3.1.2 Đối tượng thí nghiệm ¿- 2£ ©©22++E£EE£2EEE£EEESEEErrkerrkerrkee 29
3.2 Phương tiện nghiên CỨU - ¿+ kg ri 29 3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiỆm -.- se s se csxseresxes 29
3.2.2 Hĩa chất, mơi trường ¿- ++++++2E+£+EEEtEEEEEEEerrrkrrrrrcrre 29 3.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm . 2- 22 2++z+£xe+rxecsez 30 3.3.1 Phương pháp lấy mẫu . 2-22 ++E£2EE££EE£2EEEtEEesrkerrkee 30
3.3.2 Phương pháp phân lập, định danh vi khuẩn E coli gây tiêu chảy tr6n NEO COM 30
3.3.3 Phương pháp định danh các chủng vi khuẩn E coii bang phan ứng huyết thanh hỌc - 2-22 +2+2E+2EEE2EEECEEEEEEEE2711 27111 er.e 32
3.3.4 Xác định độc tố của vi khuẩn ETEC gây tiêu chảy trên heo con
băng phương pháp PCT 65+ +1 3S SH vn net 33
3.3.5 Các chỉ tiêu theo dõi tk dep 36
3.4 Phương pháp xử lí số liệu 2- 2 2£+2EE£+EEE+tEEEEtrEkerrrkerrrrcrre 37
CHƯƠNG 4: KÉT QUÁ THẢO LUẬN -¿- 2 ©5c S£+E+EEeEE+Eerxerrxee 38
4.1 Khảo sát điều kiện tự nhiên và tình hình chăn mơi tại huyện Vũng
Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long . -2¿2¿©Z+2cze2z+z 38
Trang 74.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long . -2¿©52+525zz5z+2 39
4.3 Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ và sau
0o a 41 4.4 Kết quả tỷ lệ tiêu chảy do vi khuẩn E col trên phân heo con theo
địa điỂm ch 1E 1 1E115115118111111111111111111111111111 71111 11e1xcrxe, 43
4.5 Kết quả phân lập vi khuẩn E col theo lứa tuổi của heo 45
4.6 Kết quả định danh các chung E coli K88, K99, 987P tai cac dia
GIG LAY MAU cc eeccecccecscecssesssesssecssecssecssecssesssecssecsseessesssecssecssessseessessseesseessess 45
4.7 Két qua dinh danh cac chung vi khuan E coli K88, K99, 987P trén heo con theo mẹ Và SaU Cai SẴA - (6 2c 232312111 121111 1 1E rrxee 47 4.8 Kết quả xác định độc tố của vi khuan E coli trên heo con tại huyện 0-0; 1 48
4.9 Kết quả xác định độc tố của vi khuẩn ETEC theo các chung vi
Trang 8DANH SACH BANG
Bang Tén bang Trang
2.1 Mối liên quan giữa một vài kháng nguyên O của vi khuẩn E coli 17 và đối tượng gây bệnh của nĩ
2.2 Sự tương quan giữa kháng nguyên và khả năng sinh độc tố của vi 18 khuẩn E coli
2.3 Một số đặc tính của hai loại độc tố của vi khuan E coli 18
3.1 Các phản ứng sinh hĩa định danh vi khuân E coli 32 3.2 _ Trinh ty nucleotide và kích thước các cặp mơi dùng cho phản ứng 35
PCR xác định các yêu tơ độc lực của vi khuan E coli
3.3 Hỗn hợp master mix của phản ứng PCR xác định một số yếu tố 35 doc luc cua vi khuan E coli gay tiêu chảy trên heo con
3.4 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR xác định các yếu tố độc lực của 36
vi khuan E coli
4.1 Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại huyện Vũng 40 Liêm, Long Hồ và thành phơ Vĩnh Long
4.2 Kết quả khảo sát tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con theo mẹ và sau 41 cai sữa
4.3 Kết quả tỷ lệ tiêu chảy do vi khuẩn E coli trén phân theo địa điểm 43
4.4 _ Kết quả tỷ lệ tiêu chảy do vi khuẩn E coli theo lứa tuổi của heo 45 4.5 Kết quả định danh các chủng E coli K88, K99, 987P tai cac dia 46
diém lay mau
4.6 Két qua dinh danh cac ching vi khuan E coli K88, K99, 987P trên 47
heo con theo mẹ và sau cai sữa
47 Kết quả xác đinh độc tố của vi khuẩn E coli trên heo con theo mẹ 48
và sau cai sữa tại huyện Long Hồ
4.8 Két qua xác đinh độc tố của vi khuẩn ETEC theo các chủng E coli 50
K8S, K99, 987P
Trang 9
DANH SACH HINH
Hinh Tén hinh Trang
3.1 Quy trình nuơi cấy, phân lập và định danh vi khuân ETEC 31 3.2 _ Định danh vi khuẩn E coli bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến 33
kính
4.1 Bản đồ ranh giới hành chính tỉnh Vĩnh Long 38 4.2 Ưúm heo con 41
4.3, Heo con bị tiêu chảy 43
4.4 Khuan lac vi khuẩn E coii trên mơi trường MC 44
4.5 _ Sản phâm của phản ứng PCR với gene độc lực LT sau quá trình điện di 51 trén thach
4.6 Sản phẩm của phán ứng PCR với gene STb của vi khuẩn E coli K88, 52 K99, 987P sau qua trinh dién di
4.7 San pham cta phan ing PCR với gene STa của vi khuẩn E coli K88, 53
K99, 9§7P sau quá trình điện di
Trang 10
DANH SACH CHU VIET TAT
Chữ viết tắt Giải thích
AMP Adenosine monophosphate CFU Colony Forming Units CT Cholarae toxin
Ctv Cộng tác viên
DAEC Diffusely adhering E coli E coli Escherichia coli
EAEC Enteroaggregative E coli EHEC Enterohaemorrhagic E coli EIEC Enteroinvasive E coli ETEC Enterotoxigenic E coli EPEC Enteropathogenic E coli
IMTGP Intestinal mucin-type glycoprotein LT Heat-labile enterotoxin PEDV Porcine Epidemic Diarrhea virus SLTs Shiga-like toxin ST Heat-stable enterotoxin Stx Shiga toxin Stxl Shiga toxin 1 Stx2 Shiga toxin 2 su2e Shiga toxin 2e
TGE Transmissable Gastro Enteritis virus VTs Vero toxins
Trang 11
TĨM LƯỢC
Bệnh tiêu chảy là một trong những bệnh xảy ra thường xuyên trên heo con
Bệnh do nhiều nguyên nhân gây ra cĩ thể do việc chăm sĩc nuơi dưỡng khơng tốt, điều kiện thời tiết thay đổi làm cho sức đề kháng của heo con giảm tạo
điều kiện cho các vì khuẩn tấn cơng, trong đĩ đáng quan tâm là vi khuẩn E
coli Xét về nguyên nhân vi khuẩn học thì chủng E coli đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới thơng nhất là một trong số các nguyên nhân thường gặp
và quan trọng gây bệnh tiêu chảy cho heo con Qua thời gian từ tháng 8 đến tháng L1 năm 2013, bằng phương pháp khảo sát lâm sàng, nghiên cứu này đã
thu thập 101 mẫu phân heo con tiêu cháy từ 45 đàn heo(192 con tiêu chảy trong tổng số 621 con khảo sát) thuộc các hộ chăn nuơi của huyện Vũng Liêm,
Long Hồ và thành phố Vĩnh Long, tỷ lệ bệnh tiêu chảy là 30,92% Tiến hành
phân lập vi khuẩn E coli, kết quả cho thấy cĩ 100% mẫu dương tính với vi
khuẩn E coli Kết quả định danh các chủng vi khuẩn E coli K88, K99, 987P
bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính cho tỷ lệ lần lượt là 26,73%, 18,72% và 7,92% Bằng phương pháp sinh học phân tử đã xác định độc tổ của vi khuẩn E coli trên heo con theo mẹ và sau cai sữa tai huyện Long
Hồ là cĩ sự hiện diện cúa STa, STb, LT với tỷ lệ lần lượt là 7,41%; 18,51% và
3,70% Tỷ lệ bệnh tiêu chảy trên heo con tại các địa điểm lấy mau là khá cao,
chúng vi khuẩn K88 là nguyên nhân chính gây tiêu cháy ở heo con, chủng vì
khuẩn E coli gây tiêu chảy trên heo con tại huyện Long Hồ tiết các loại độc tổ
STa, STb, LT trong do d6c tơ STb chiếm tỷ lệ cao nhất
Trang 12CHUONG 1
DAT VAN DE
Cùng với sự phát triển chung của cả nước, ngành chăn nuơi heo ở khu vực Đồng bằng sơng Cửu Long đã được đầu tư mở rộng quy mơ sản xuất Tuy nhiên, vấn đề đặt ra là tình hình dịch bệnh xảy ra ngày càng phức tạp, chỉ phí
cho thuốc dùng trong việc phịng và điều trị khá cao Một trong những bệnh
được quan tâm nhất hiện nay là bệnh tiêu chảy trên heo trước và sau cai sữa Cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu tìm ra nguyên nhân gây bệnh Các tác giả quan tâm nhiều đến một số loại vi khuân gây bệnh trên đường tiêu hĩa như
Escherichia coli (E coli), Salmonella spp., Clostridium perfringens Trong đĩ,
E coli thuộc nhĩm cĩ khả năng sinh độc tố đường ruột Enterotoxingenic E coli (ETEC) được coi là một trong các vi khuân thường gặp và quan trọng nhất
gây tiêu chảy trên heo con đặc biệt là heo con theo me 1 — 3 tuần tuổi
(Bertchinger, 1990)
Các chủng E coii gây bệnh tiêu chảy trên heo quan trọng nhất là chủng vi khuan K88, K99, 987P (Moon et al., 1980) Tuy nhiên, những chủng này thay
đổi trên từng vùng và trên những đàn khác nhau Hiện tai, phần lớn các trang
trại chăn nuơi tập trung và hộ gia đình ở các tỉnh Đồng bằng sơng Cửu Long đã sử dụng vắc-xin phịng nhưng bệnh vẫn xảy ra với tý lệ cao Các yếu tố độc
lực gây bệnh tiêu chảy cho heo con rất phức tạp Các chủng vi khuẩn E coli thuộc nhĩm ETEC tham gia vào quá trình gây bệnh nhờ hai đặc tính chủ yếu
là yếu tố bám đính, đây là yếu tơ đầu tiên giúp vi khuẩn bám vào biểu mơ ruột vật chủ như: K88, K99, 987P và yếu tơ thứ hai là sản sinh một hoặc nhiều độc
tố ruột, bao gồm độc tố chịu nhiệt ST và độc tố khơng chịu nhiệt LT
(Fairbrother, 1992) Vì thế, để đánh giá khả năng gây bệnh của các chủng vi
khuẩn E coli 1a cần xác định được chúng cĩ mang một hoặc cả hai yếu tố gây
bệnh là rất cần thiết
Nguyễn Phương Vũ (2012) và Lê Thị Bích Hạnh (2012) đã nghiên cứu về khả
năng gây bệnh tiêu chảy của chủng vi khuẩn E coli K§§, K99, 9§87P trên heo
con theo mẹ tại huyện Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long nhưng chỉ dừng lại ở mức xác định tỷ lệ bệnh tiêu chảy và xác định chủng vị khuẩn Z£ coii Chưa xác định độc lực của chủng vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy ở heo con
Xuất phát từ tình hình thực tế và được sự phân cơng của bộ mơn thú y, khoa Nơng nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ, đề tài: “Phân
lập, định danh, kiếm tra độc lực của vi khuẩn Ezerofoxingenic
Escherichia coli trén heo con tiéu chay tại tỉnh Vĩnh Long” được thực hiện
Trang 13Muc tiéu dé tai:
Xác định tỷ lệ bệnh tiêu chảy, tỷ lệ nhiễm vi khuan E coli va tỷ lệ các chủng vi khuẩn E coli K88, K99, 9§87P từ phân heo con theo mẹ và sau cai sữa mắc
bệnh tiêu chảy
Xác định gene mã hĩa độc tố đường ruột của các chủng vi khuẩn E coli K88,
Trang 14CHUONG 2
CO SO LY LUAN
2.1 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về vi khuẩn E coli gay bệnh tiêu chảy trên heo con
2.1.1 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nguyễn Anh Tuấn (2013), tỷ lệ phân lap E coli tit mau phan heo con theo me
thuộc mơ hình trại cơng nghiệp tại cơng ty Sơn Trà (Bắc Ninh) 1a 86.2%, tir mẫu phân heo con cai sữa là 78,0% Tỷ lệ các chủng E coli phân lập từ heo
con theo mẹ mang gene mã hĩa độc tố STa, STb, LT và các yếu tố bám dính
F4, F18 là 32%; 44%; 24%; 44% và 32% Ở nhĩm heo con sau cai sữa, tỷ lệ
tương ứng là 65,5%; 21,8%; 59,45; 0% và 34,3%
Theo Phan Thị Hồng Gắm (2012), tỷ lệ E coii trong phân heo con tiêu chảy
tại huyện Mỏ Cày Nam tỉnh Bến Tre là 100% Tỷ lệ K99 là 14%, kế đến là
K88 chiếm 10% và thấp nhất là 987P 8%
Trương Minh Nhã (2012), kết quả phân lập vi khuẩn E cøli tại Miền Đơng và Tây Nam Bộ mang các kháng nguyên K88, K99, 987P chiếm tỷ lệ 52%
Trong đĩ E coli mang K88, K99, 987P chiếm tỷ lệ lần lượt là 9,59%; 15,74%
và 27,39%
Nghiên cứu trên heo con sau cai sữa tại huyện Long Hồ, tỉnh Vĩnh Long cho
kết quả về tý lệ bệnh tiêu chảy là 32,92% Kết quả đỉnh danh các chủng vi
khuẩn E coli K8§, K99, 987P cho tỷ lệ lần lượt là 72%, 2% và 6% (Lê Thị
Bích Hạnh, 2012)
Nghiên cứu của Huỳnh Tấn Lộc (2012), kết quả định danh các chủng E coli
cho thấy các chủng E coli K88, K99, 987P hiện diện gây tiêu chảy trên heo
con theo mẹ và sau cai sữa tại tỉnh An Giang, Vĩnh Long, Bến Tre và thành
phố Cần Thơ với tÿ lệ lần lượt là 51,85%; 29,63% và 18,52% Bằng phương
pháp PCR đã xác định được độc tố của vi khuẩn E coli, chủng cĩ mang gene mã hĩa độc tổ STb chiếm tỷ lệ cao nhất 66,67% kế đến là STa 33,33% va LT là 22,22%
Trần Đức Hạnh (2012), kết quá nghiên cứu về vai trị của vi khuẩn E coli,
Salmonella, Clostridium perfringens gây tiêu chảy ở heo tại 3 tỉnh miền núi
Trang 15Tỷ lệ heo con mắc bệnh tiêu chảy tại 8 tỉnh khu vực Nam trung bộ - Tây
Nguyên dương tính với vi khuẩn E cøii là 80,2%, cĩ 164/184 chủng vi khuẩn
E coli (7,5%) cĩ khả năng sản sinh ít nhất một loại kháng nguyên bám dính, kháng nguyên F4 và F18 chiếm ưu thế ở các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh
tiêu chảy ở heo con với tỷ lệ lần lượt là 29,8% và 43,3%, tiếp theo là F6
(13,5%), F5 (6,7%) và Intimin (1,09%) Tỷ lệ chủng vi khuẩn E coli sản sinh
ít nhất một trong năm loại độc tố (STa, STb, LT, EASTI, Stx2e) là 67,39%
Trong đĩ STb chiếm tỷ lệ cao nhất (40,76%), tiếp theo là STa (30,43%), LT
(28,26%), EASTI (19,57%) và Stx2e (7,61%) (Võ Thành Thìn, 201 1)
Nghiên cứu tại một số trại chăn nuơi ở thành phố Hồ Chí Minh cho thấy tỷ lệ
mẫu phân tiêu chảy nhiễm vi khuân E coli là 44,76%, trong đĩ cĩ 8,57% mẫu
phân tiêu chảy nhiễm vi khuẩn E coli mang kháng nguyên K88 (Lâm Thị Thu Hương và Dương Chi Mai, 2011)
Theo Trần Thị Diễm Châu (2010), tại tỉnh Trà Vinh tỷ lệ mẫu phân heo con
theo mẹ tiêu chảy đương tính với vi khuẩn E coi là 100% Kết quả định danh
các chủng vi khuẩn K88, K99, 987P cĩ tỷ lệ lần lượt là 33,33%; 17,28%; 13,58%
Nguyễn Cảnh Dũng và cứ (2010), tỷ lệ phân lập vi khuân E coli trong hội chứng tiêu chảy ở heo con sau cai sữa tại một số địa phương tỉnh Lâm Đồng là
74,71% Yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E col: gồm hai yếu tố bám dính F4 (40%) và F5 (15%); bốn yếu tố độc tố là STb (75%), Sta (55%), LT (45%), VT2e (25%)
Nguyễn Xuân Hịa và cứ (2009), nghiên cứu về gene sản sinh độc tố STa, ST,
LT, VT2e của các chủng vi khuẩn E coli phân lập được trên địa bàn Thừa
Thiên Huế cho kết quả như sau: tỷ lệ vi khuẩn mang gene LT cao nhất là
40,98%, kế tiếp là vi khuẩn E coli mang gene STb 29,51% và STa là 14,75%
sau cùng là vi khuẩn E coli mang gene sản sinh độc tố dung huyết VT2e
9,84% Tý lệ vi khuẩn mang 2 gene độc tố STa/STb, STa/LT, STa/VT2e,
STb/LT lần lượt là 8%, 16%, 12% và 36%
Nghiên cứu của Lê Thị Hồi (2008), kết quả xác định vai trị của E coli trong hội chứng tiêu chảy ở heo từ sơ sinh đến 60 ngày tuơi tại Hưng Yên là: vi
khuẩn E coli phân lập được ở heo tiêu chảy là 96,9% Kết quả kiểm tra độc
lực cĩ 40% các chủng mang gene F4; 30,0% các chủng mang gene F18; Cịn
các loại độc tố STb,STa, LT, VT2e lần lượt chiếm tỷ lệ là 50%, 36,7%, 23,3%
va 40,%
Nghién ciru cua Tran Thanh Phong va ctv (2007), gene déc le cia vi khuan E coli phân lập từ phan heo con tiêu chảy va phân bình thường cho kết quả
Trang 16như sau: tý lệ mẫu phân heo con cai sữa tiêu chảy cĩ E coli mang gene độc
lực STa, STb, VT2e là 25; 81,3 và 31,3% Đối với phân heo bình thường, gene
STb được phát hiện với tỷ lệ cao nhất là 28%, kế đến là VT2e 16%, chưa phát
hiện được gene STa
Theo nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai và c/w (2003), tỷ lệ nhiễm E coli trên
heo con tiêu chảy tại tỉnh Cần Thơ là 87,5% Trong đĩ tỷ lệ K88, K99, 987P
lần lượt là 7,32%, 18,29%, 13,41%
2.1.2 Tình hình nghiên cứu ngồi nước
Nghiên cứu của Vidotto và ctv (2009), nhận thấy 60% số chủng vi khuẩn E
coli phan lập từ heo con mắc bệnh tiêu chảy tại Brazil cĩ khả năng sản xuất ít nhất một loại kháng nguyên bám dính Trong số đĩ chủng mang gene sinh
tổng hợp kháng nguyên bám dính K88 là 44%, K99 30% và 987P 25%
Theo Zhang va ctv (2007), kết quả nghiên cứu tại Mỹ cho thấy trong số 304
chủng E coli nghiên cứu thì số chủng vi khuân # coi dương tính với kháng
nguyên bám dính K88, K99 với tỷ lệ lần lượt là 64,4%; 0,57%; gene độc tố:
LT 57,7%, STb 72,6% và STa 27,2%
Theo một nghiên cứu ở Trung Quốc thì trong 227 mẫu phân heo con cai sữa bị
tiêu chảy do E coli thì cĩ 10,1% mang kháng nguyên K88, 13/227 mẫu (5,7%) mang kháng nguyên K99 Trong 179 mẫu phân heo con theo mẹ cĩ 20,1% K88, 1,1% K99, 6,1% 987P (Wang và cứv., 2006)
Ken Katsuda va ctv (2006), nghiên cứu ở Nhật Bản cho rằng E coi chiếm 2%
trong các nguyên nhân gây tiêu chảy ở heo con E còÏ¡ gây tiêu chảy ở các lứa
tuổi 1 — 7 ngày là 13,3%, 8 — 14 ngày 13,6%, 5 — 21 ngày 13% và >21 ngày là
55%
Nghiên cứu của Vũ Khắc Hùng và Pilipcinec (2003), ở Cộng hịa Slovakia trong 218 mau phân heo con sau cai sữa bị tiêu chảy dương tính với E coli
kháng nguyên bám dính K88, K99 + F41, 987P chiếm tỷ lệ lần lượt là 37,7%,;
0,46% và 3,2%
Theo nghiên cứu của Frydendahl (2002), tại Đan Mạch trên 44% số chủng vi
khuan E coli phân lập từ heo con sau cai sữa tiêu chảy mang kháng nguyên bám dính K88 (44,7%), 987P (0.9%) và F18 (39,3%)
2.2 Đặc điểm sinh lí heo con
2.2.1 Chức năng thần kinh và điều tiết nhiệt
Trang 17con mới sinh lớp mỡ da chưa phát triển và glycogen trong cơ cịn thấp, da
mỏng, lơng thưa nên chống lạnh kém Nuơi heo con trong chuồng cĩ nhiệt độ thấp và âm độ cao thân nhiệt heo con hạ rất nhanh, mức độ hạ tùy thuộc vào
ngày tuổi càng ít thì hạ nhiệt càng nhiều, sau 3 ngày tuổi cơ năng điều tiết
nhiệt của heo con mới tương đối hồn chỉnh và thân nhiệt én định hơn ở mức
39 — 39,5°C (Lê Hồng Mận, 2006)
Trong bụng mẹ, sự cân bằng nhiệt của bào thai được xác định do thân nhiệt của mẹ Sau khi sinh cơ thể heo con chưa cĩ thể bù đắp được lượng nhiệt đã bị mất do ảnh hưởng của mơi trường bên ngồi Vì vậy, hầu như tất cả heo con
sơ sinh trong những giờ đầu tiên đều bị giảm thân nhiệt, sau đĩ thân nhiệt đần
dần tăng lên (Đào Trọng Đạt, 1999)
2.2.2 Bộ máy tiêu hĩa
Heo con chưa thành thục nên cơ quan tiêu hĩa cũng rất dễ mắc bệnh, dễ bị rối loạn Một đặc điểm cần lưu ý, ở heo con cĩ giai đoạn khơng cĩ acid clohydric
trong dạ dày Giai đoạn này được coi như một tình trạng thích ứng tự nhiên
của heo con Nhờ vậy mới tạo được khả năng thấm thấu các kháng thể cĩ
trong sữa đầu của heo mẹ Trong giai đoạn này dịch vị khơng cĩ hoạt tính
phân giải protide, mà chỉ cĩ hoạt tính làm vĩn sữa đầu và sữa (Đào Trọng Đạt,
1999),
Bộ máy tiêu hĩa heo con sơ sinh chưa phát triển hồn chỉnh Dịch tiêu hĩa tiết ra ban đêm là 69% và ban ngày là 31% cho nên heo con bú đêm nhiều và đến
ngày sắp cai sữa mới cân bằng dịch vị ban ngày 51%, ban đêm 49% Heo con đến 2 tháng tuổi trong dạ dày vẫn chưa cĩ acid clohydric (HCI) tự do nên chưa
cĩ tính kháng khuẩn bảo vệ đường tiêu hĩa hay bị bệnh đường ruột nhất là
bệnh phân trắng ở heo con (Lê Hồng Mận, 2006)
Bộ máy tiêu hĩa thay đối khi cai sữa: màng nhày ruột non thay đổi khi heo
được 3 — 4 tuần tuổi So với trước khi cai sữa, nhung mao ngắn đi 75% trong vịng 24 giờ sau cai sữa và tình trạng này vẫn tiếp tục nhưng giảm dần đến ngày thứ 5 sau cai sữa (Hampson and Kidder, 1986) Mào ruột lại sâu hơn
bình thường, mào ruột là nơi mà tế bào của chúng sẽ di chuyên dần lên đỉnh nhung mao để trở thành tế bào ruột trưởng thành với vi nhung mao hấp thu
chất dinh dưỡng Vài enzyme tiêu hĩa (lactase, glucosidase, protase) bị giảm
nhưng maltase lại tăng Do đĩ kha nang hap thu chất đinh dưỡng của ruột cũng giảm Việc giảm chiều dai của nhung mao và hình đạng chưa trưởng thành của tế bào ruột (do tốc độ thay thế nhanh) cĩ thể giải thích tại sao heo con cai sữa
Trang 182.2.3 Vi sinh vật đường ruột của heo con
Ở heo con mới sinh hệ vi sinh vật đường ruột chưa phát triển, chưa đủ số
lượng vi khuẩn cĩ lợi nên chưa đủ khả năng kháng lại vi khuẩn gây bệnh, nên rất dễ cảm nhiễm bệnh nhất là các bệnh đường tiêu hĩa (Đào Trọng Đạt,
1999)
Vi sinh vật xuất hiện trong đường ruột của heo con ngay từ những ngày đầu sau khi sinh, chúng bao gồm những vi sinh vật cĩ trong sữa đầu và mơi trường
sống xung quanh Các hoạt động tiêu hĩa của heo phụ thuộc rất nhiều vào hệ vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hĩa từ khi mới đẻ và tạo thành vi sinh vật
cộng sinh Thành phần vi sinh vật trong hệ thống tiêu hĩa của heo thay đổi tùy theo điều kiện chuồng trại, dinh dưỡng và lứa tuổi heo (Nguyễn Thị Kim Ngân, 2007)
Thành phần vi sinh vật trong đường tiêu hĩa của heo con (Nicotkif, 1983):
Ngày thứ nhất: trực khuẩn Bacillus anacrogenes, Bacillus enterococcus
Ngày thứ hai: vi khuẩn tăng lên rõ rệt, đặc biệt là vi khuẩn G*, vi khuẩn
Lactic, Streptococcus, nam Candida, Micrococcus, E coli, Bacillus
alealense
Ngày thứ 3 và ngày thứ 4: vi khuẩn GŒ' chiếm ưu thế, trong đĩ trực khuẩn
chiếm 50 - 80%, cịn lại là vi khuan G* chi c6 vi khuan Lactic, Bacillus
mensentericus khoang 40%
Ngày thứ 5: trong rudt heo c6 Streptococcus va truc khuan Lactic, sé long E
coli và vi khuân G chiếm khoảng 40 — 50% Ngày thứ 6: số lượng trực khuẩn 60 — 65%
Từ ngày thứ 15 đến ngày thứ 20: lượng vi khuẩn Œ tăng lên 60 — 70%
Ở thời điểm cai sữa, số lượng vi khuẩn G' tăng lên 70 — 80%
Trong điều kiện bình thường vi sinh vật sống cộng sinh trong đường tiêu hĩa
của heo con khơng ảnh hưởng xấu đến sức khỏe heo con Nhưng khi điều kiện sống thay đổi khơng cĩ lợi cho heo con như thiếu dinh đưỡng, thời tiết thay
đổi khơng tốt, vệ sinh chăn nuơi kém thì một số vi khuẩn trở thành tác nhân gay bénh: Clostridium perfringens, E coli
Sự cân bằng của quần thể vi sinh vật đường tiêu hĩa heo con cĩ vai trị quan trọng trong sự trăng trưởng và phát triển của động vật chủ Tác động qua lại
của vi khuẩn trong đường tiêu hĩa cĩ thể là đối kháng hay hiệp đồng, tác động giữ vai trị trong sự duy trì điều tiết hệ sinh thái thể hiện giữa vật chủ và các vi
sinh vật trong đường tiêu hĩa của chúng khi mất cân đối và sự cân bằng hệ vi
Trang 19sinh vật đường tiêu hĩa sẽ dễ dàng dẫn đến rối loạn sinh thái đường ruột
Chính vì vậy, việc chăm sĩc nuơi dưỡng tốt, tạo điều kiện mơi trường sơng
thích hợp là một trong những biện pháp phịng các bệnh đường ruột ở heo
Mơi trường ầm ướt, giàu chất dinh dưỡng thuận lợi cho vi sinh vật phát triển,
nhưng sự phát triển cĩ giới hạn trong dạ dày và ruột vì ống tiêu hĩa cĩ những
tác nhân làm kiềm hãm sự phát triển của chúng như mật, acid dạ dày, tác dụng
đối kháng của các loại vi khuẩn khác nhau 2.3 Một số nguyên nhân gây tiêu chảy heo con
2.3.1 Tiêu chảy do vi khuẩn
Bệnh do E coli
Bénh do E coli gay ra là bệnh truyền nhiễm, diễn biến cấp tính ở dạng nhiễm
trùng huyết hoặc nhiễm độc đường ruột, viêm ruột ở động vật non nhất là vào 3 đến 5 ngày sau khi sinh thậm chí bị bệnh từ một ngày tuơi Cĩ đến 48%
trường hợp bị bệnh tiêu chảy ở heo con 1a do E coli gay ra, vi vay bénh do E
coli cĩ tầm quan trọng đặc biệt trong các bệnh nhiễm khuẩn ở heo con (Đào Trọng Đạt, 1999)
Bệnh do Salmonella spp
Bệnh phĩ thương hàn heo là bệnh truyền nhiễm thường xảy ra ở heo con tir 1 — 3 thang tuéi Bénh do vi khuan Salmonella cholerae suis va Salmonella
typhysuis gay nén, bệnh nhiễm chủ yếu qua đường tiêu hĩa khi sứ dụng thức ăn, nước uống đã bị nhiễm khuẩn
Do khả năng mang mầm bệnh ở heo con rất lâu dài, vi khuẩn cĩ trong ruột, túi mật, manh tràng của heo qua hai ba năm kê từ khi heo cĩ triệu chứng bệnh đã
hết hắn Khi heo nái hoặc heo đực giống đã mắc bệnh từ nhỏ, cĩ thai hoặc
phối giống Vi khuẩn truyền qua heo nái xâm nhập vào bào thai gây chết thai
hoặc thai cĩ sống thì cũng bị nhiễm bệnh thé ân tính, khi đé ra sẽ tiêu chảy phân trắng, cịi cọc và chết
Bénh do Salmonella spp đặc trưng là sốt cao, viêm ruột, ỉa chảy kéo dài rồi
chết (Nguyễn Xuân Bình, 2000)
Bệnh do xoắn khuẩn Treponema hyodysenteriae (bénh ly)
Bệnh do xoắn khuẩn Treponema hyodysenteriae thường xuất hiện ở heo choai
Trang 20Mầm bệnh xâm nhập qua đường tiêu hĩa do lây nhiễm qua thức ăn và nước uống Khi vào tới ruột gây viêm ruột già, làm tốn thương xuất huyết dẫn đến tiêu chảy ra máu
Đặc trưng của bệnh là heo con tiêu chảy vọt cần câu, phân lỗng vàng, xám hoặc cĩ máu Phân dính đầy phía sau hậu mơn, đi tới đâu chảy tới đĩ (Nguyễn
Xuân Bình, 2000)
Bénh do Proteus spp
Proteus mirabilis va Proteus amoniae cac ching thudéc loai nay kha phé bién kết hợp với nhiễm trùng đường niệu ở các thú nhỏ, mặc dù chúng được phân lập từ những bệnh khác nhau, bao gồm viêm tuyến tiền liệt, viêm hơ hấp, tốn
thương da ở chĩ, viêm nội tâm mạc ở heo, nhiễm khuẩn huyết ở gà tây Các
giống vi khuan Proteus thường xuyên cĩ mặt trong đường ruột động vật, song ít khi gây bệnh (Nguyễn Như Thanh, 1997)
Bénh do Shigella
Shigella gây bệnh tiêu chảy ở heo con theo mẹ và heo con sau cai sữa Các
chung thường gây bệnh la: Shigella dysentery va Shigella flexmitia Ching xâm nhập vào đường tiêu hĩa, sản sinh độc tố gây tiêu chảy
Bénh do Clostridium perfringens
Clostridium perfringens dugc phân thành 6 serotype A, B, C, D, E, F Co ba loai C perfringens A, B, C là mầm gây bệnh đường ruột quan trọng đối với heo con
C perfringens type C gây bệnh viêm ruột hoại tử cấp tính chủ yếu ở heo con dưới một tuần tuổi Heo con mắc bệnh cĩ tỷ lệ tử vong cao C perfringens
type C cũng được coi là vi khuẩn gây viêm ruột hoại tử ruột non ở người chủ
yếu là trẻ nhỏ
C perfringens type A được tìm thấy nhiều trong phân heo, chủng này cĩ thể
gây bệnh cho cả heo sơ sinh lẫn heo lớn sau cai sữa Các chủng sinh độc tố ruột cĩ thế gây ngộ độc thức ăn cho người (Đào Trọng Dat, 1999)
Cơ chế gây bệnh: Clostridium perfringens thường gây tốn thương ở ruột, vi khuẩn thường xâm nhập vào biểu bì của lơng nhung, tăng sinh khắp màng
nhày của ruột và hoại tử ở đĩ, đồng thời gây xuất huyết, vùng hoại tử lan dần và gây tơn thương vào chiều sâu đến niêm mạc, dưới niêm mạc Vi khuẩn cịn gây tác hại suốt chiều dài của khơng tràng nên tiêu chảy thường cĩ máu và
niêm mạc hoại tử trong phân Tỷ lệ chết và cịi cọc cao ở heo con sơ sinh, heo
Trang 212.3.2 Tiéu chay do virus
Bệnh viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm (TGE: Transmissible
Gastroenteritis)
Bệnh viêm dạ dày, ruột truyền nhiễm của heo là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, xảy ra ở tất cả các lứa tuổi của heo Heo mắc bệnh cĩ biểu hiện triệu chứng như: tiêu chảy, mất nước, tỷ lệ mắc bệnh cao ở mọi lứa tuổi, nhưng tỷ
lệ chết cao thường ở heo từ sơ sinh đến 10 ngày tuổi (Lê Văn Tạo, 2007)
Virus gay bệnh viêm ruột, dạ dày truyền nhiễm ở heo là một virus thuộc nhĩm Coronavirus với nhân ARN, cĩ kích thước 75 — 120 nm, cĩ tên gọi tắt là TGE
Đường xâm nhập tốt của virus vào cơ thể là qua miệng Cơ quan cư trú đầu tiên của virus là đường tiêu hĩa, ở đĩ virus phát triển nhanh chĩng, đạt hàm
lượng cao nhất sau 24 giờ
Virus TGE sinh san phat trién trong tế bào biểu mơ ruột sẽ làm cho lớp tế bào này bị phá hủy, các tế bào trở thành hình đẹt và ngắn lại Sự thay đổi cấu trúc, bề mặt niêm mạc ruột dẫn đến làm thay đối chức năng sinh lý của nĩ, phá vỡ
quá trình tiêu hĩa và hấp thu ở ruột Đối với heo con do chất dinh dưỡng quan trọng nhất trong sữa mẹ là đường lactose khơng được thủy phân và hấp thu, do chênh lệch áp suất thẩm thấu giữa lớp tế bào nhung mao và tế bào nội mơ
thành ruột bị phá vỡ, nước khơng thu được lại ở ruột già gây nên tiêu chảy, cịi
cọc, heo mất nước dẫn đến trụy tim mạch và chết (Lê Văn Tạo, 2006)
Bénh do Rotavirus
Rotavirus thudc chi Rotavirus ho Reoviridae Ho Reoviridae cĩ 3 lồi quan
trong: Orthoreovirst, Orbivirus va Rotavirus Rotavirus la nguyén nhan gay bệnh tiêu chảy ở gia súc vật nuơi thâm canh trên tồn thế giới (Đào Trọng Đạt,
1999)
Đặc điểm bệnh: tiêu chảy phân vàng với nhiều bọt và chất nhày, bệnh rất nặng trên heo con theo mẹ và nhẹ hơn trên heo con cai sữa Bệnh truyền lây chủ yếu
qua đường tiêu hĩa
2.3.3 Tiêu chảy do ký sinh trùng
Cĩ nhiều loại ký sinh trùng gây bệnh tiêu chảy ở heo như cầu trùng, Cryptosporidium, Ascaris suum, Trichuris suis Dac điểm chủ yếu tiêu chảy do
ký sinh trùng là con vật mắc bệnh nhưng khơng liên tục, cĩ sự xen kẽ giữa tiêu
chảy và bình thường, cơ thể thiếu máu, da nhợt nhạt, gia súc kém ăn, thể trạng sa sút (The Merck Veterinary Manual, 2000)
Trang 22Cryptosporidium: là lồi nguyên sinh động vật ký sinh, nếu gia súc non ăn phải sẽ phát triển trên bề mặt ruột Nếu nhiễm nặng, ký sinh trùng làm nhung mao 6 ruột ngắn đi và dính lại vào nhau Bệnh tiêu chảy do Cryptosporidium
dai đẳng trong vài ngày và mức độ nghiêm trọng tùy theo mức độ nhiễm bệnh
Stronggyloides ransomi (bệnh giun luon): Stronggyloides ransomi ky sinh 6
nhung mao ruột và gây bệnh tích ở niêm mạc ruột, rối loạn tiêu hĩa và dinh
dưỡng do khơng tiêu hĩa và hấp thu thức ăn Heo bị nhiễm nặng gây hấp thu acid amin kém do tơn thương chức năng của ruột non
Isospora suis (cau tring): cdc giai đoạn phát triển khác nhau sẽ phá hoại các tế
bào của lớp biểu mơ lơng nhung và những tế bào hoại tử lan vào xoang ruột
Do làm mắt nước và tạo nên quá trình viêm nhiễm, gây rối loạn tiêu hĩa dẫn
đến tiêu chảy
2.3.4 Tiêu cháy do thức ăn nhiễm nắm mốc
Thức ăn khi chế biến hoặc bảo quản khơng đúng phương pháp đễ bị nhiễm
nắm mốc Một số lồi như Aspergillus, Penicillium phân bố rộng rãi trong tự
nhiên, cĩ khả năng xâm nhập và phát triển mạnh trong thức ăn và sản sinh nhiều loại độc tố rất nguy hại cho cơ thể động vật, là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nguy hiểm như hủy hoại gan, thận và ung thư tổ chức
Aflatoxin gây ngộ độc cho nhiều lồi gia súc gia cầm Heo khi nhiễm độc
thường bỏ ăn, thiếu máu, vàng da, tiêu chảy, phân lẫn máu
Nếu trong khâu phần cĩ từ 500 — 700 ug/kg thức ăn sẽ làm heo chậm lớn, cịi
cọc, giám sức đề kháng với các bệnh truyền nhiễm khác (Lê Thị Tài, 1997) 2.3.5 Tiêu cháy do ánh hướng cúa yếu tố mơi trường
Mơi trường ngoại cảnh là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sức đề kháng của cơ thể gia súc Khi cĩ sự thay đổi của các yếu tố như nhiệt độ, độ âm, mưa,
nắng, điều kiện chuồng nuơi đều ảnh hưởng đến sức khỏe của heo, do cấu tạo
và chức năng sinh lí chưa ốn định và hồn thiện, khi gặp các yếu tố bất lợi dễ
bị stress dẫn đến nhiều bệnh trong đĩ cĩ tiêu chảy
Khi gia súc bị nhiễm lạnh kéo dài sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch, giảm tác
dụng thực bào và dễ bị nhiễm khuẩn gây bệnh (Hồ Van Nam va ctv., 1997)
Khẩu phần ăn cho heo khơng thích hợp, trạng thái thức ăn khơng tốt, thức ăn kém chất lượng như mốc, thối, nhiễm tạp chất, các vi sinh vật cĩ hại, đẫn đến
rồi loạn tiêu hĩa kèm theo viêm ruột, tiêu chảy ở gia súc
Trang 23Như vậy nguyên nhân mơi trường ngoại cảnh khơng mang tính đặc hiệu mà
mang tính tổng hợp Lạnh và âm gây rối loạn hệ thống điều hịa trao đơi nhiệt
của cơ thể, dẫn đến rối loạn trao đối chất, các mầm bệnh cĩ thời cơ tăng cường
độc lực và gây bệnh
2.4 Vi khuẩn Escherichia coli
2.4.1 Lịch sử nghiên cứu
Vi khuan Escherichia coli (E coli) được đặt theo tên nhà khoa học người Đức Theodor Escheris (1857 - 1911) — người đầu tiên phân lập vi khuẩn này vào năm 1884 Đây là vi khuẩn thường trú trong đường tiêu hĩa của động vật và
người Vi khuân này thường xuất hiện rat sớm ở đường tiêu hĩa người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2 giờ), chúng thường ở phần sau của ruột với số lượng
khoảng 10” — 10” vi khuân/gram phân Trong nhiều trường hợp, vi khuẩn cịn
được tìm thấy ở niêm mạc của nhiều bộ phận khác nhau trong cơ thể (Gyles
and Fairbrother, 2010)
2.4.2 Phan loai
Vị khuẩn E coii thuộc bộ Eubacteriales, họ Enterobacteriaceae, tộc
Escherichiea, giỗng Escherichia Giỗng Eseherichia cĩ 5 lồi khác nhau là E
coli, E blattae, E fergusonii, E hermannii va E vulneris (Hirish, 2004)
Hién nay, co 6 nhom E coli gây bệnh được biét dén dé 1a: Enteropathogenic
E coli (EPEC), Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteroinvasive E coli
(EIEC), Enterohaemorrhagic E coli (EHEC), Enteroaggregative E coli
(EAEC) va Diffusely adhering E coli (DAEC) (Nataro and Kaper, 1998) Cac
nhĩm vi khuẩn này mang các yếu tố độc lực điển hình và gây nên các bệnh lý khác nhau trên động vật và người
Enteropathogenic E coli (EPEC): mang yếu tố bám dính và cĩ khả năng
xâm nhiễm vào ruột non, phá hủy lớp tế bào biểu mơ ruột, kèm theo biểu hiện
sốt và tiêu chảy Vi khuẩn thuộc nhĩm này thường gây bệnh ở thỏ, chĩ, mèo,
heo và cĩ thể ở ngựa
Enterohaemorrhagic E coli (EHEC): phan lập được từ người và động vật
nhai lại Nhĩm này thường sản sinh yếu tố xâm nhiễm, độc tố Shiga (Stx)
Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh thường gây nên những bệnh lý tế bào rất
nặng
Enterotoxigenic E coli (ETEC): vi khuẩn thuộc nhĩm này thường cĩ khả năng mang một số kháng nguyên bám dính và sinh độc tố đường tiêu hĩa Vi khuẩn nhĩm này thường gây bệnh tiêu chảy trên người, heo, cừu, gà, bị, chĩ,
ngựa
Trang 24Enteroaggregative E coli (EAEC): vi khuẩn bám lên thành ruột non và ruột
già, sản sinh độc tố tế bào và độc tổ đường tiêu hĩa (EASTI) Vi khuân nhĩm
này cĩ thê tìm thấy ở người, heo, bị
Enteroinvasive E coli (ETEC): vi khuẩn xâm nhiễm vào biểu mơ tế bào ruột
kết, làm dung giải thể thực bào (phagosome) Vi khuẩn thuộc nhĩm này chủ
yếu được phân lập ở người
Diffusely adhering E coli (DAEC): cé thé tim thay trong ruột non, đặc biệt
là trẻ em từ 12 tháng tuơi trở lên
2.4.3 Đặc điểm của vi khuẩn E coli
Đặc điểm hình thái và nhuộm màu
E coli là trực khuân hình gay ngan, kich thudc 2 — 3 p x 0.6 p, hai dau tron,
trong cơ thể cĩ hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đơi khi xếp thành chuỗi
ngắn, cĩ lơng ở chung quanh thân nên cĩ thể di động (Nguyễn Vĩnh Phước,
1977)
Vi khuẩn bắt màu Gram âm, cĩ thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày để nhuộm cĩ thể thấy giáp
mơ, cịn khi soi tươi khơng nhìn thấy được (Nguyễn Như Thanh, 1997)
Đặc tính nuơi cấy
Trực khuân hiếu khí và hiếu khí tùy tiện, cĩ thể sinh trưởng ở nhiệt độ từ 15 —
24°C Nhiệt độ thích hợp là 37C, pH thích hợp là 7,4 (Nguyễn Vĩnh Phước,
1977)
Trên mơi trường NA ở 37°C trong 24 giờ, vi khuẩn hình thành những khuẩn
lạc trịn ướt, khơng trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 — 3
mm (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977)
Trên mơi trường EMB vi khuan E coli hình thành những khuẩn lạc màu tím đen
Trên mơi trường Endo, E coii cĩ khuân lạc màu đỏ
E coli bị ức chế trên mơi trường Wilson — blair (Nguyễn Như Thanh, 1997)
Đặc tính sinh hĩa
Vi khuẩn được định danh bằng phản ứng sinh hĩa trên các mơi trường như:
KIA, indole, MR, VP va Simmon citrate
Vi khuẩn E coii lên men sinh hoi Glucose, Galactose, Lactose, Mantose,
Arabinose, Xylose, Manifol, Fructose Cĩ thể làm lên men hoặc khơng lên men các đường Saccharose, Rafinose, Xalixin, Esculin, Dunxit, Glycerol
Trang 25Vi khuan E coli khéng lén men cac đường Dextrin, Amidol, Glycogen,
Inoside, Xenlobiose, Methyglycoside
Vi khuan E coli khong sinh HS, thường sinh indole khi thứ với thuốc thử
Kowaes thì xuất hiện vịng màu đỏ trên bề mặt Phản ứng Methyl Red dương tính
Phản ứng Voges Prauskauer âm tính, hồn nguyên nitrate thành nitrite và
khơng sử dụng urea (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) 2.4.4 Cấu trúc kháng nguyên
Cấu trúc kháng nguyên của E coii rất phức tạp, cĩ đủ loại kháng nguyên O,
H, K và kháng nguyên bám dính F Kháng nguyên K cũng cĩ nhiều loại L, A, B nên cĩ nhiều type huyết thanh khác nhau
Theo Lê Văn Tạo (2006), đã xác định được L70 type khang nguyén O, 80 type
kháng nguyên H, 56 loại kháng nguyên K và một số kháng nguyên F Kháng nguyên O
Đây là kháng nguyên vỏ, chịu nhiệt khi đun 100°C trong vịng 2 giờ 30 phút vần giữ được tính kháng nguyên khả năng ngưng kết và kết tủa (Đào Trọng
Đạt, 1999) Khơng bị cồn phá hủy, cĩ bản chất là lipopolysacchride (LPS)
LPS được cấu tạo gồm 3 thành phần chinh 1a lipid A, nhan oligosaccharide
(core — Oligosaccharide) va chudi O — specific polysaccharide (Madigan and
Martinko, 2006)
Các nhĩm kháng nguyên O của vi khuân được xác định dựa trên cấu trúc hĩa học khác nhau của phần O — specific polysaccharide Sy da dang về cấu trúc của phần này đã tạo nên các nhĩm kháng nguyên O khác nhau và được xác
định bằng phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh chuẩn Kháng nguyên H
Kháng nguyên H cấu tạo bởi thành phần lơng của vi khuẩn, cĩ bản chất là protein Kháng nguyên H cĩ đặc tính như dễ bị phá hủy ở 60°C trong 1 giờ, bị
cồn 50% và các enzyme phân hủy phá hủy, kháng nguyên H vẫn tồn tại khi xử
ly bang formol 0,5% (Pham Hồng Sơn, 2002) Kháng nguyên này khơng cĩ
vai trị về độc lực, đồng thời khơng cĩ vai trị về đáp ứng miễn dịch nên ít
được quan tâm nghiên cứu, nhưng nĩ cĩ ý nghĩa rất quan trọng trong việc xác
định giống, lồi của vi khuẩn (Gyles, 1994)
Trang 26Khang nguyén K
Kháng nguyên K là kháng nguyên bề mặt (hoặc kháng nguyên vỏ, kháng
nguyên bao) chúng gồm cĩ 3 loại, kí hiệu là L, B và A (Đào Trọng Đạt, 1999),
Kháng nguyên L khơng chịu được nhiệt, bị phá hủy khi đun 100°C trong vịng
1 giờ Trong điều kiện đĩ kháng nguyên mất khả năng ngưng kết, kết tủa và
khơng giữ được tính kháng nguyên
Kháng nguyên B là kháng nguyên khơng chịu được nhiệt Dưới tác dụng
100°C trong vịng I giờ thì chúng sẽ bi phá hủy Khác với kháng nguyên L kháng nguyên B chỉ mắt tính kháng nguyên, nhưng vẫn giữ được khả năng
ngưng kết và kết tủa Kháng nguyên này rất đặc hiệu cho các type trong nhĩm
trực khuẩn đường ruột
Kháng nguyên A là kháng nguyên vỏ chịu nhiệt, khơng bị phá hủy khi đun sơi trong 100C trong vịng 2 giờ 30 phút, tính kháng nguyên và khả năng ngưng
kết, kết tủa đều được giữ nguyên
Kháng nguyên F (kháng nguyên bám dính)
Hầu hết các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh đều sản sinh ra một hoặc nhiều
kháng nguyên bám dinh (Fleckenstein va ctv., 2010) Khang nguyén bam dính
cho phép vi khuẩn cĩ thê bám vào các thy thé đặc hiệu trên bề mặt tế bào biểu
mơ ruột và trên lớp màng nhầy niêm mạc ruột
Cĩ 4 kháng nguyên bám dính quan trọng của vi khuẩn E coi thuộc nhĩm ETEC gây bệnh tiêu chảy trên heo là F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) và F18
Trong đĩ, kháng nguyên bám dính F4 và F18 chiếm tỷ lệ cao nhất và đĩng vai
trị quan trọng nhất trong quá trình gây bệnh ở heo (Frydendahl, 2002) Kháng nguyên bám dính F4 (K88)
Kháng nguyên bám dính F4 được Orskov mơ tả lần đầu tiên vào năm 1961 (Orskov et al.,1961) da chiét tách kháng nguyên bám dính F4 bằng phương
pháp đun canh khuẩn E coi trong 20 phút ở 68°C để nghiên cứu các tính chất
hĩa học của kháng nguyên Bằng việc sử đụng các kháng huyết thanh đặc
hiệu, Orskov e ai., (1961) đã phân biệt được 2 loại khác nhau của F4 là F4ab và F4ac Loại thứ 3 được phát hiện bởi Guinee và Jansen được đặt tên là F4ad
Sợi F4 giúp cho vi khuân bám được vào thụ thể tương ứng của nĩ trên tế bào
biểu mơ của lơng nhung ruột non, từ đĩ vi khuẩn cĩ thể xâm nhập cố định và phát triển ở thành ruột non Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, kháng nguyên bám dính F4 bao quanh tế bào vi khuân như lớp áo mỏng và cĩ cầu
trúc khơng 6n định (Guinee and Jansen, 1979)
Trang 27Kháng nguyên bám dính F5 (K99)
Các chủng E coli mang kháng nguyên bám dính F5 chủ yếu được tìm thấy ở các chủng E coli thuộc nhĩm ETEC phân lập từ heo sơ sinh, bê con va cừu con mắc bệnh tiêu chảy Tuy nhiên, hiện nay chúng cũng được tìm thấy với tỷ
lệ thấp ở các chủng ETEC phân lập từ heo tiêu chảy Kháng nguyên bám dính F5 thực hiện chức năng gắn tế bào vi khuẩn vảo vị trí Neu5Gc-a(2-3)Galp- B(1-4)Glco- B(1-1)-Cerramide trên các điểm tiếp nhận đặc hiệu chủ yếu trên tế bào biểu mơ ruột non Kháng nguyên bám dính F5 cũng được mã hĩa bởi cụm gene gồm cĩ 8 gene nằm trên plasmid với trọng lượng phân tử là 52 MDa
Tiểu phân tử FanC do gen fanC ma héa đĩng vai trị bám dính lên các thụ thé
trên niêm mạc ruột (Jacobs e ai., 1987)
Sự sản sinh F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn như: tốc độ sinh
trưởng, pha sinh trưởng, nhiệt độ và alanine trong mơi trường Các gene mã hĩa cho sự tổng hợp F5 nằm trên ADN của plasmid (Isaacson er al., 1977)
Kháng nguyên bám dính F6 (987P)
Kháng nguyên bám dính F6 đĩng vai trị trong cơ chế gây bệnh của ETEC bằng cách bám dính vào các tế bào biểu mơ niêm mạc ruột, phát triển, tăng
sinh về số lượng và sản sinh độc tố đường ruột gây bệnh cho heo Tám gene ŒasA-H) tham gia vào quá trình sinh tổng hợp kháng nguyên bám dính F6 nằm trên plasmid 35 MDa Kháng nguyên bám dính F6 cĩ cấu trúc dạng xoắn
với sự sắp xếp của tiêu phân tử chủ yếu FasA và 2 tiểu phân tử thứ yếu là FasF
và FasG Trong đĩ, FasF và FasG nằm ở đầu ngồi cùng Tiểu phân tử FasG đĩng vai trị bám dính, giúp kháng nguyên F6 bám lên các thụ thể cĩ bản chất
là glucoprotein và glucolipid trên biêu mơ ruột (Dean and Samuel, 1994)
Quá trình sinh tổng hợp kháng nguyên bám dính của vi khuẩn E coi ảnh
hưởng bởi nhiều yếu tố như thời gian nuơi cấy vi khuẩn, điều kiện mơi trường
nuơi cấy vi khuân như: nguồn cung cấp carbon, độ pH của mơi trường nuơi
cấy, áp suất thấm thấu, mức độ cung cấp oxy (Mol and Oudega, 1996) Những chủng vi khuẩn E coli cĩ khả năng gây bệnh chỉ giải phĩng đầy đủ các yếu tố
độc lực khi chúng được nuơi cấy trong mơi trường đảm bảo các điều kiện
tương đương cho việc bám dính và xâm nhập vào tế bào niêm mạc ruột non
của heo Đối với các chủng ETEC cĩ sản sinh kháng nguyên bám dính, điều
kiện nuơi cấy tối ưu là 37C, pH từ 6,8 — § và lượng kháng nguyên thu được
nhiều nhất ở cuối pha tang trưởng
Trang 28Bang 2.1: Mối liên quan giữa một vài kháng nguyên O cúa vi khuẩn E
coli và đối tượng gây bệnh của nĩ (Gaastra and De Graaf, 1982) Kháng nguyên Đối tượng gây Kháng nguyên O bệnh K88 Heo con 8, 45, 138, 141, 147, 149, 157 987P Heo con 9, 20, 141 K99 Cừu, bê 8, 9, 20, 101 K99 Heo con 64, 101 F41 Bé 9, 101
2.4.5 Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E coli
2.4.5.1 Độc tố tế bào: loại độc tố này phá hủy tế bào, tăng tính thâm thấu
thành mạch, tạo bệnh tích ở các tơ chức cơ quan và gây thẩm dịch mơ bào
Theo Konowalchuck và cứ (1977), đã phát hiện một loại độc tố hoạt động trong mơi trường nuơi cấy tế bào Vero (nên chúng được đặt tên là độc tố tế
bao Vero), được sản sinh bởi vi khuan E coli gây bệnh tiêu chảy ở người, tiêu chảy và bệnh phù đầu ở heo con Ảnh hưởng gây bệnh ở tế bào của độc tố
Vero rất khác so với ảnh hưởng của độc tố đường ruột khơng chịu nhiệt cổ
điển ở nhĩm vi khuẩn E coli gây bệnh đường ruột (ETEC) Độc tố Vero
(VTs) hay Shiga (SLTs) là thuật ngữ được sử dụng trước đây Gần đây, các
nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này Stx sản sinh bởi E coli bao gồm 2 nhĩm: Stx1và Stx2 Độc tố Shiga ở heo là một loại trong nhĩm độc tố Stx2 với một số khác biệt trong đặc tính sinh học StxIvà Stx2 gây độc cho tế bào Hela Stx2e kém độc hơn,
nhưng gây độc mạnh cho tế bào Vero
2.4.5.2 Độc tố thần kinh: đây là loại độc tố phá hủy tế bào thần kinh, gây
những triệu chứng thân kinh (Lê Văn Tạo, 2006)
2.4.5.3 Độc tố đường ruột: Khả năng sản sinh độc tố đường ruột là một trong những yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu chảy ở heo
con Độc tố đường ruột làm thay đối nước, chất điện giải ở ruột non và dẫn tới tiêu chảy (Gyles and Fairbrother, 2010)
Trang 29Bảng 2.2: Sự tương quan giữa kháng nguyên và khá năng sinh độc tố của
vi khuan E coli (Gaastra and De Graaf, 1982) Loại độc tố Kháng nguyên ST LT LT +ST K88 + + + 987P + - - K99 + - - F41 + - -
Độc tố đường ruột của vi khuẩn Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) Cĩ 2 loại độc tố đường ruột của vi khuẩn thuộc nhĩm ETEC được xác định là
độc tố khơng chịu nhiệt (LT) và độc tố chịu nhiệt (ST) (Nataro and Kaper,
1998)
Bảng 2.3: Một số đặc tính của hai loại độc tố của vi khuẩn E cọi (Carter and Wise Darla, 2004)
Độc tố bền với nhiệt Độc tố khơng bền với độ (Heat — Stable nhiệt độ (Heat — Labile Enterotoxin) Enterotoxin)
Bị cái Cĩ hiện diện Ít hiện diện
Heo Cĩ hiện diện Cĩ hiện diện
Khả năng chịu nhiệt Chịu được 121°C trong Bị phá hủy ở 60°C trong
15 phút 30 phút
Trang 30Độc tố khơng chịu nhiệt (LT)
LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt cĩ cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với
cholera enterotoxin (CT) được sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hĩa cho
cấu trúc của độc tố LT nằm trên plasmid cĩ nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio
cholerae (Nataro and Kaper, 1998) Cầu trúc của độc tổ LT gồm I tiểu đơn vị A (A-subunit) với 240 axit amin va 5 tiéu don vi B (B-subunit) voi 103 acid
amin (O’Bien and Holmes, 1996) Tiéu don vi A mang hoat tinh enzyme cua
độc tổ và gồm 2 chuỗi peptide A1, peptide A2 Hai chudi peptide nay liên kết nhau bởi cầu nối disulfide giữa AI- acid amin Cystein (Cys) 187 và A2-
Cys199 Chuỗi A2 tạo thành cái mĩc liên kết khơng đồng hĩa trị giữa tiều đơn vị A và lỗ hồng giữa của vịng 5 tiểu đơn vị Năm tiểu phân tử B trong cấu trúc
của LT sắp xếp thành vịng nhẫn 5 cạnh bền vững Mỗi tiêu phân tử B cĩ 1 vi trí gắn với thụ thể tiếp nhận độc tố của tế bào vật chủ (O’Bien and Holmes,
1996)
LT được chia làm 2 nhĩm: LT cĩ hai nhĩm chính là LT-I và LT-H, hai độc tố
này khơng đáp ứng miễn dịch chéo với nhau LT-I được biểu hiện trong các
chủng E coli gây bệnh trên người và động vật cịn LT-II chỉ được tìm thấy trên những chủng # coli phân lập được trên động vật và một số rất ít chủng phan lập được trên người tuy nhiên khơng cĩ bằng chứng cho thấy LT-I cĩ
khả năng gây bệnh do đĩ cơ chế tác động của độc tố LT tập trung chủ yếu vào
LT-I, LT thấy ở trên heo là LT-I LT-I cĩ 55 — 57% tương đồng với LT-I ở
tiểu đơn vị A, nhưng khơng cho thấy sự tương đồng ở tiêu đơn vị B, LT-II cĩ hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-Ia và LT-Ib, hai kiêu kháng nguyên
này cĩ sự tương đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A và 66% ở tiểu đơn vị B LT-II cĩ cơ chế tác động tương tự LT-I là gia tăng hàm lượng cAMP nội bao, khác biệt là receptor của LT-H là GDI cịn của LT-I là GMI, tuy nhiên như đề
cập ở trên thì khơng cĩ bằng chứng cho thấy LT-II gây độc cho tế bào của
người và động vật (Nataro and Kaper, 1998) Những loại độc tố LT, được sản
sinh trên người và heo do ETEC được ký hiệu là LT; và LTp dựa trên sự khác nhau các gen mã hĩa của độc tố (Fairbrother, 1992)
Cơ chế tác động của độc tổ LT
Sau khi bám lên các thụ thê tiếp nhận của tế bào biêu mơ ruột, độc tổ LT được chuyên qua màng và đi vào nội bào Bên trong tế bào, độc tố di chuyển nhờ hệ thống vận chuyển của Golgi Sau khi tiểu phân tử A và B phân cắt ở Golgi,
tiểu phân tử A được chuyên đến màng lưới nội chat, tiêu phân tử B được tái sử
dung tir Golgi cho dén cuéi endosome va lysosome (Rappuoli et al.,1999)
Độc tố LT trong tế bào là enzyme adenylate cyclase nam ở lớp màng ngồi
Trang 31bao tuong, chudi peptide Al bam lén phttc hop protein Gs,gy Chudi peptide A1 cĩ hoạt tính như enzyme ADP-ribosyltransferase chuyén phan ADP-
ribosyl từ NAD đến protein của lién két GTP (GTP-binding protein) 1a Gs,
Quá trình bám của GTP lên Gs„ làm cho Gs„ tách khỏi phức hợp protein Gspy và gây hoạt hĩa enzyme Adenylate cyclase, làm gia tăng cAMP (cyclic adenosine monophosphate) trong té bao Vi vay, cAMP sé hoat hoa enzyme
cAMP-dependent protein kinase (A kinase) dan dén sy phosphoryl héa kénh
ion chloride (Cl-) 6 mang tế bào biểu mơ vượt quá mức bình thường Kết quả
là kích thích tế bào bên dưới tiết Cl- và ngăn cản sự hấp thụ NaCl bởi những tế
bào lơng nhung Hàm lượng 1on Cl- trong lịng ruột gia tắng kéo theo sự di chuyền thụ động của nước từ tế bào vào lịng ruột gây tiêu chảy, bên cạnh đĩ
cịn cĩ các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp
ứng miễn dịch của tế bào thành ruột với độc tố cho nên cĩ ít nhất một cơ chế
tác động đồng thời với cơ chế tăng hàm lượng cAMP (Nataro and Kaper, 1998)
Độc tổ chịu nhiệt (ST)
ST là protein nhỏ chỉ được cau tạp từ một đơn vị, nhưng cấu trúc chứa nhiều
amino acid cystein, đo đĩ trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối đisulfic
tính chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố Độc tố này cĩ 2 loại, cĩ cấu trúc và cơ chế hoạt động khác biệt nhau đĩ là STa va STb, gene mã hĩa cho hai độc tố này được qui định trên plasmid, một số gene được phát hiện
nằm trên transposon
Độc tổ STa
Cấu tạo: STa cĩ trọng lượng phân tử là 2 kDa, cĩ hai dạng khác nhau là STap
trong cấu trúc chứa 18 amino acid cĩ khả năng gây độc cho heo và người, dạng cịn lại là STah cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho người Ban đầu
STa được tổng hợp dưới đạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đĩ được phan cat thanh peptide c6 52 acid amine, dang peptide nay duoc chuyén vao vung periplasm sau đĩ hình thành cầu nối disulfic nho enzyme DsbA được mã
hĩa trên genome cua vi khuẩn, sau đĩ dạng protoxin sẽ được cắt thành dạng toxin hồn chỉnh và được khuếch tán qua vách tế bào Trong đĩ, cĩ 6 acid amin cystein tạo thành 3 cầu nối disulfide bên trong cấu trúc phân tử của STa là Cys6 - Cys1 1, Cys7 - Cys15 và Cys10 - Cys18 Ngồi ETEC ra thì ŠTa cịn
được tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (-) khác như Yezsinia
enterocolitica va V cholerae non-OI, bên cạnh đĩ STa cĩ 50% protein tương
đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC Sự khác nhau giữa 2 biến thé chí xuất
hiện ở đầu tận cùng N- với 4-5 acid amin (Nataro and Kaper, 1998)
Trang 32Cơ chế tác động của độc tổ STa: receptor của STa là enzyme xuyên màng
được gọi là guanylate cyclase C (GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mơ ruột, protein này là receptor ca hormone guanylin cua thú,
hocmone này cĩ l5 amino acid trong đĩ cĩ 4 cystein đĩng vai trị giúp cân bằng trạng thái bình thường của ruột, cơ chế tác động của receptor này với
guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đĩ là cơ chế receptor gắn với ligand
tiếp nhận các thơng tin ngoại bào từ đĩ thúc đây sự hoạt động của các enzyme
nội bào Tương tự như vậy sau khi liên kết với receptor, STa thúc đây hoạt tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lượng cGMP nội bào, cGMP hoạt hĩa protein kinase G, hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh clorua, làm đây mạnh việc tiết ion clorua và ức chế sự hấp
thu NaCI dẫn đến địch ruột bị tiết ra ngồi gây nên hiện tượng tiêu chảy Độc
tố STa tác động nhanh hơn LT do khơng cần phải di chuyển vào bên trong tế
bào mà truyền tín hiệu trực tiếp vào bên trong Ngồi GC-C ra thì STa cĩ thể cịn cĩ các receptor khác tuy nhiên GC-C là receptor chiếm ưu thế nhất (Nataro and Kaper, 1998) Độc tế STa kích thích giải phĩng cGMP đạt nồng đa sau 5 phút Tuy nhiên, quá trình này duy trì trong thời gian ngắn
(Hitotsubashi et al , 1992)
Độc tổ STb
Cấu tạo: tương tự độc tơ STa, độc tố STb cũng là chuỗi polypeptide được sản sinh chủ yếu bởi các chúng vi khuân ETEC phân lập từ heo, STb ban đầu cũng
được tổng hợp dưới dạng pretoxin cĩ 72 acid amine sau đĩ được chế biến thành dạng protein hồn chỉnh cĩ 48 acid amine, protein này cĩ trọng lượng
phân tử là 5,1 kDa, cấu trúc của STb khơng tương đồng với STa mặc dù trong cấu tạo của nĩ cũng cĩ 4 amino acid cystein (Nataro and Kaper, 1998) Trong
cấu trúc của STb, 4 acide amine cystein tạo thành 2 cầu nối disulfide giữa
Cys10 — Cys48 va Cys21 — Cys36 Cac cầu nối này cĩ vai trị giúp cho STb
bền vững trong chu chất (Fujii et al ,1991)
Cơ chế tác động của độc tố STb: SŠTb làm tơn thương các tế bào ruột do tác
động lên các lơng ruột dẫn đến các lơng tơ trên tế bào biểu mơ bị mất hoặc bị
thu ngắn lại, receptor của STb vẫn chưa được xác định, cĩ thê độc tố này gắn
vào những vùng khơng chuyên biệt trên màng tế bào trước khi đưa vào trong,
tác động của STb trong tế bào khơng giống như STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến việc phân tiết bicarbonate, STb khơng làm gia tăng hàm
lượng cAMP hay cGMP nội bào mà tác động của nĩ làm tăng hàm lượng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên ngồi, ngồi ra tác động của nĩ cịn
làm tăng sự phân tiết PGE; và serotonin, cho thấy tác động của STb cĩ liên
quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) (Nataro and Kaper, 1998)
Trang 33Hơn nữa, sự gia tăng nồng độ Ca?” trong tế bào cũng cĩ thé kích thích mở kénh CTI, ting cwong tiét Cl va HCO’; vao long rudt (Worrell va ctv.,1991)
Kết quả cuối cùng là sự tích lũy chất lỏng trong lịng ruột và gây tiêu chảy
2.4.6 Sức đề kháng của vi khuẩn
Vi khuẩn E coli dé kháng yếu với nhiệt độ, ở 55C sẽ bị diệt trong một giờ,
60°C trong 30 phút và chết ngay khi đun sơi ở 100°C (Nguyễn Như Thanh và
ctv., 1997)
Các chất sát trùng bình thường như phenol, formol, vơi ở nồng độ thơng
thường cũng làm E coii chết rất nhanh Tuy nhiên, ở mơi trường bên ngồi các chủng Z coii độc cĩ thé tồn tại đến 4 tháng (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997)
Theo nghiên cứu Bùi Thị Tho (2003) thì E cøfi là vi khuẩn cĩ khả năng tăng
sức đề kháng đối với kháng sinh nhanh nhất
2.4.7 Khả năng gây bệnh
Bệnh do E coli gây cho heo gồm cĩ ba thể: tiêu chảy, phù thủng và nhiễm
trùng huyết Cĩ thể xuất hiện một triệu chứng hoặc cùng lúc xuất hiện 2 hoặc
3 triệu chứng Ở thể tiêu chảy, cĩ thể chia làm 2 loại là tiêu chảy heo sơ sinh
(một vài ngày đầu mới khi sinh) và tiêu chảy heo sau cai sữa Vi khuẩn E coli là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy trên heo con sơ sinh và heo sau cai
sữa
Trong đường tiêu hĩa vi khuẩn E coii chiếm tỷ lệ cao nhất trong các vi khuẩn hiếu khí (khoảng 80%), gây bệnh quan trọng, nĩ đứng đầu trong các vi khuẩn
gây tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, nhiễm khuẩn huyết (Lê Văn Tạo, 1997) Ở heo, bệnh cĩ thể lây cho cả ơ thậm chí từ ổ này sang ơ khác Ở động vật lớn, vi khuẩn cĩ thể gây một số bệnh như viêm phúc mạc, túi mật, buồng vú, khớp xương
Trong phịng thí nghiệm, tiêm vi khuẩn vào đưới da cho chuột bạch, chuột
lang, thỏ cĩ thể gây viêm cục bộ, nếu tiêm với liều lớn cĩ thê gây bại huyết, giết chết con vật (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977) Thật vậy, để xác định vai trị
của một chủng vi khuan E coli gây ra một bệnh nào đĩ, cần kiểm tra độc lực và các yếu tơ gây bệnh mà chủng E col đĩ cĩ được Do vậy, kết quả những
nghiên cứu về độc lực, yếu tố gây bệnh của E coli chinh là đánh giá khả năng
gây bệnh của nĩ (Lé Van Tao va ctv., 2003)
Trang 342.5 Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E coli ở heo con
2.5.1 Điều kiện xuất hiện bệnh
Các chủng vi khuẩn E coii thuộc nhĩm ETEC tham gia vào quá trình gây
bệnh cĩ 2 đặc tính chủ yếu: khả năng bám đính vào các tế bào biểu mơ ruột nhờ các yếu tố bám dính ở bề mặt vi khuẩn như F4 (K88), F5 (K99), F6
(987P) và khả năng sản sinh một hoặc nhiều loại độc tố đường ruột, bao gồm
độc tố chịu nhiệt và khơng chịu nhiệt (Fairbrother, 1992)
E coli là vi khuân mơi trường, nơi nào cũng cĩ Bình thường, vi khuẩn khơng gây tác hại trên ký chủ (10 CFU/g phân) Khi mật số tăng lên cao (10° — 10°
CEU/g phân) thì nĩ sẽ trở nên gây bệnh
Các chủng E coi K8§§, K99, 9§7P là vi khuẩn khu trú và hoạt động trong
đường ruột cúa heo và cĩ thể trở thành nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy trên heo khi đề kháng của heo giảm súc Chỉ cĩ các chủng E coli mang các yếu tố
độc lực mới gây tiêu chảy Vì thế trong điều kiện vệ sinh kém hoặc chuồng đẻ thâm canh liên tục, hình thành nén nhom E coli gay bénh trong mơi trường sẽ
dẫn đến sự bộc phát tiêu chảy cho heo (Fairbrother, 1992)
Heo sau cai sữa rất mẫn cảm với các chủng vi khuẩn E coli gây bệnh tiêu
chảy do tại thời điểm này lượng kháng thể thụ động khơng cịn đủ bảo hộ Hơn nữa, số lượng các thụ thể của kháng nguyên bám đính F4 trên lớp tế bào niêm mạc ruột tăng dần theo lứa tuổi của heo cho đến giai đoạn sau cai sữa Đây là
điều kiện thuận loi dé vi khudn bam dính và gây bệnh (Nagy er ai., 1992)
Ở heo sau cai sữa, hệ tiêu hĩa chưa hồn chỉnh, nếu cho ăn quá nhiều thức ăn khơng được tiêu hĩa kịp sẽ tích tụ trong đường ruột tạo chất nền cho vi khuẩn
E coli phát triển Do đĩ ở giai đoạn này heo rất dễ nhiễm bệnh Stress và việc thay đổi khẩu phần thức ăn đột ngột cũng là yếu tố quan trọng làm cho bệnh tiêu chảy gia tăng
Nhiệt độ chuồng cũng quan trọng Nhiệt độ thấp hơn 25°C, nhu động ruột
giảm, việc bài thải vi khuẩn và tiếp nhận kháng thể bị đình trệ làm tăng số
lượng E coli gây bệnh trong ống tiêu hĩa của những heo con này làm cho heo
bị tiêu chảy tram trọng hơn những heo con khác được giữ ở nhiệt độ 30°C (Sarmiento, 1983)
Stress do tách mẹ hay do chuyên chuồng cĩ thể gây ức chế sợi phĩ giao cam,
làm giảm nhu động ruột, giảm tiết dịch tiêu hĩa, tạo điều kiện cho vi khuẩn cĩ
hại ở đường ruột phát triển (Nguyễn Như Thanh, 1997)
Trang 352.5.2 Cơ chế gây bệnh tiêu chảy
Theo Sarmiento (1983) vi khuẩn E coli bằng cách trực tiếp hay gián tiếp xâm nhập vào đường ruột của heo Trong ruột, khi cĩ đủ các điều kiện thuận lợi, vi khuẩn nhân lên với số lượng lớn, sản sinh yếu tố kháng khuẩn Colicin (ColV) Yếu tố này tiêu diệt hoặc hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột
khác, đặc biệt là các vi khuẩn cĩ lợi, các vi khuẩn lactic và trở thành vi khuẩn
cĩ số lượng lớn trong ruột Khi cĩ số lượng lớn, chiếm ưu thế, vi khuẩn tràn
lên ruột non, nhờ kháng nguyên bám dính, vi khuẩn bám vào lớp tế bao biéu
mơ nhung mao ruột và xâm nhập vào bên trong lớp tế bào biểu mơ Trong lớp
tế bào biểu mơ, vi khuẩn phát triển nhân lên làm phá huỷ lớp tế bào này gây
viêm ruột Cũng tại đây, vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột (cơ chế gây tiêu
chảy độc tố LT, STa, STb xem phần 2.4.4) Nước tập trung ở ruột làm cho ruột căng lên, cộng với khí do vi khuẩn E coli trong ruột lên men tao ra làm
cho ruột căng lên, sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột mạnh đây nước và phân
ra ngồi gây tiêu chảy
2.5.3 Triệu chứng và bệnh tích
Triệu chứng
Tiêu chảy do vi khuẩn E coli phụ thuộc vào yếu tố độc lực của vi khuân Z coli và tuơi cũng như tình trạng miễn dịch của heo con Cĩ trường hợp bệnh
diễn ra nhanh và chết trước khi cĩ triệu chứng tiêu chảy (Fairbrother, 1992)
Bệnh tiêu chảy do vĩ khuẩn E coli Xảy ra đối với heo theo mẹ và sau cai sữa, thường xảy ra ở heo con vừa cai sữa Mức độ tiêu chảy tùy thuộc vào độc lực của vi khuẩn và độ tuổi của heo Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn ở heo sau cai sữa cũng rat cao nhưng do heo dễ chăm sĩc nên heo cĩ thể qua khỏi, tỷ lệ heo mắc bệnh chết giảm Heo nhiễm bệnh cĩ thê xuất hiện riêng lẽ từng cá thể hoặc cả đàn Heo tiêu chảy phân màu vàng hoặc hơi nâu, tiêu chảy thường xuất hiện 3-5 ngày ở heo cai sữa và cĩ thể kéo dài hàng tuần Heo cĩ biểu hiện cịi cọc,
chậm lớn, lơng xù, da nhăn nheo, mắt trũng sâu Trong trường hợp tiêu chảy
nặng, trong lượng cơ thê cĩ thể giảm 30- 40% Hệ thống cơ vùng xoang bụng nhão và mất trương lực Tỷ lệ heo mắc bệnh chết cĩ thê đến 70% (Gyles and
Fairbrother, 2010)
Bệnh tích
Bệnh tích đại thể cĩ thé thấy được là heo con bị mất nước nặng Bệnh tích đặc trưng ở heo sau cai sữa là các tĩnh mạch trên đường cong lớn dạ dày bị nhồi huyết, ruột non giãn nở, thành ruột non xuất huyết Một số trường hợp thấy
Trang 36xuất huyết thành dạ dày, chất chứa trong ruột cĩ màu nau (Gyles and
Fairbrother, 2010)
Bệnh tích vi thể đường tiêu hĩa tùy thuộc vào độc lực của chủng vi khuẩn gây
bệnh Heo nhiễm các chủng ETEC thường cĩ biểu hiện xuất huyết tĩnh mạch màng treo ruột, thỉnh thoảng cĩ xuất huyết trong lịng ruột, bạch cầu trung tính
và đại thực bào tăng trong hạch màng treo ruột và chuyền vào trong lịng ruột Hệ thống lơng nhung cĩ thể bị bong trĩc và hoại tử hoặc tập trung thành từng
đám Khi quan sát tiêu bản màng nhây ruột non dưới kính hiễn vi điện tử thấy
vi khuẩn gắn chặt với các tế bào biêu mơ ruột và cạnh các vi lơng nhung Trong trường hợp bệnh nặng, các lơng nhung biến mắt và xuất hiện các sợi tơ
huyết làm tắt các vi tĩnh mạch ở màng treo ruột, dạ dày, ruột non và kết tràng (Gyles and Fairbrother, 2010)
2.5.4 Chấn đốn và chấn đốn phân biệt
Chẩn đốn
Tiêu chảy do E colï ở heo theo mẹ và sau cai sữa thường kết hợp với các tác nhân gây bệnh khác nên phải chú ý phân biệt khi chân đốn Chắn đốn tiêu chảy do E coli cĩ thể dựa trên triệu chứng lâm sàng, bệnh tích, phân lập vi khuẩn hoặc ứng dụng các phương pháp chân đốn phân tử với các yếu tố độc lực đã được xác định
Chẩn đốn dựa vào triệu chứng lâm sàng
Cĩ thể chân đốn phân biệt dựa vào độ pH của phân Dịch tiêu chảy ETEC gây ra thường cĩ độ pH kiềm, trong khi đĩ nếu bệnh tiêu chảy do hấp thu kém
hay do virus gây ra thì phân cĩ độ pH acid (Fairbrother, 1992)
Chấn đốn bệnh đường rudt do E coli co thé dua vao biéu hién lam sang, bénh tích tế bào và sự hiện diện của vi khuẩn gram âm luơn bám dính vào màng nhày ruột non (Wilson and Francis, 1986)
Heo tiêu chảy cĩ thể xuất hiện riêng lẽ từng cá thể hoặc cả đàn Heo cĩ biểu hiện lờ đờ, chậm chạp, da nhăn nheo, âm ướt, mắt trũng sâu Phân tiêu chảy thường cĩ màu trắng hay vàng nhạt và dính bết ở vùng hậu mơn, hai chân sau Đơi khi heo tiêu chảy cĩ lẫn máu, một số heo cĩ thể bị sốt, nơn Heo sau cai sữa thường cịi cọc, giảm trọng lượng cơ thể do mất nước
Chẩn đốn dựa vào bệnh tích
Cĩ thể dựa vào các bệnh tích điển hình như dạ dày bị giãn nở chứa nhiều thức ăn khơng tiêu, ruột non giãn nở, thành ruột non xuất huyết, hệ thống lơng
nhung cĩ thể bị bong trĩc và hoại tử hoặc tập trung thành từng đám
Trang 37Dựa vào cau trúc bề mặt của khơng tràng và hồi trang, nếu cĩ sự bám chắc của
vi khuẩn và tiếp xúc một cách bình thường trên các sợi vi nhung mao thì do
ETEC gây ra Nếu sợi vi nhung mao bắt thường và bất dưỡng thì nguyên nhân cĩ thể do virus và cầu trùng gây nén (Alexander, 1994),
Chân đốn cĩ tính thuyết phục là khi phân lập được E coli đến nhĩm huyết
thanh Ngồi ra, chứng minh E coli bám dính vào màng nhày ruột non bằng
cách cắt lạnh tiêu bản và phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang
gián tiếp hoặc cố định mẫu trong dung dịch formol, đúc khối bằng parafin và
xét nghiệm bằng kỹ thuật miễn dịch men peroxidase (Fairbrother, 1992)
Chấn đốn bằng phương pháp phân lập vi khuẩn
Cần thiết phải phân lập vi khuẩn từ phân, bệnh phâm là máu, hạch ruột, lớp
niêm mạc ruột non và chất chứa trong ruột heo Thử độc lực, kiểm tra yếu tố
gây bệnh của vi khuẩn E coli phân lập được để khăng định vai trị gây bệnh
của chúng Nếu phân lập được một lượng lớn E coi, cần xác định xem chúng cĩ phải là loại gây bệnh hay khơng Cĩ nhiều phản ứng huyết thanh học đề định danh vi khuẩn E coii Phân ứng ngưng kết đơn giản trên phiến kính cũng
phát hiện hầu hết các trường hợp cĩ bệnh (Đào Trọng Đạt và c/v., 1999)
Chan doan phân biệt
Bệnh do ETEC gây tiêu chảy ở heo con, heo sau cai sữa cần phân biệt với
những nguyên nhân gây tiêu chảy với những heo con cùng lứa tuổi Những nguyén nhan d6 bao gém: Adenovirus, Rotavirus, Isopora suis, Clostridium perfringens, TGE virus, PEDV type II
Chân đốn phân biệt với bệnh tiêu chay do Clostridium perfringens type C:
thường gây bệnh trên heo con dưới 10 ngày tuổi, phân tiêu chảy thường cĩ
máu Heo con trở nên yếu và suy nhược, thuốc kháng sinh khơng cĩ tác dụng
trong trường hợp này và heo con thường chết sớm Ở heo 2 tuần tuổi thì bệnh nhẹ hơn và phân cĩ màu vàng sậm Khi mơ khám thấy vách tế bào khơng
tràng đỏ thẫm hoặc đỏ tía và chất chứa trong ruột cĩ màu như rượu vang (Alaxander, 1994)
Nếu tiêu chảy do Rotavirus gây nên (thường ở heo con trên 7 ngày tuơi) thì heo con bị suy nhược hoặc bỏ ăn 1 hoặc 2 ngày Phân lỏng và vàng, tý lệ chết thấp và thường thay đổi sau 5 ngày Trong trường hợp này thuốc kháng sinh
khơng cĩ tác dụng Dạ dày heo con thường chứa những hạt sữa và dịch ruột
non giống như kem (Alexander, 1994)
Tiêu chảy do virus TGE và PED type II thì thường tạo thành dịch và lan truyền nhanh chĩng và nĩ gây bệnh trên tất cả các lứa tuổi Phân thường lỏng
Trang 38như nước, màu sắc rõ nét và mùi đặc trưng Heo tiêu chảy thường dừng lại sau
4 — 5 ngày bệnh và thường phục hồi sức lực sau 7 ngày Tý lệ chết do virus
PED type II thi thường thấp hơn Mồ khám thấy vách dạ dày, ruột mỏng và cĩ màu sáng đục, trong ống ruột thường sinh hơi và chất dịch cĩ màu nhạt Các
soi vi nhung mao bi bat dưỡng và biến dang (Alexander, 1994)
Tiéu chay do cau tring Isospora suis gay nén thi phan mềm nhão, chat dich
long, mau nau vang Heo con ốm yếu, lơng xù và một số Ít cĩ thể tự khỏi bệnh
sau vài tuần bệnh hoặc sau cai sữa Mổ khám thấy thành khơng tràng và hồi
tràng cĩ điểm dày lên, chất chứa dạng kem hoặc lỏng hơn Sợi vi nhung mao ruột bị bất dưỡng và cĩ điểm xuất huyết (Alexander, 1994)
2.5.5 Điều trị và phịng bệnh
Điều trị
Điều trị bénh do E coli can phai dat được mục tiêu là cắt đứt E coli gây bệnh, khắc phục các ảnh hưởng xấu và tạo điều kiện mơi trường tốt Trị liệu nhanh
và hiệu quả nếu cĩ thể Kết hợp giữa việc tiêu diét mam bénh E coli với việc
bổ sung nước và dung dịch điện giải để chống mất nước, nâng cao sức đề kháng của con vật trong khi sử dụng kháng sinh và hĩa được tiêu diệt mầm bệnh (Fairbrother, 1992)
Theo nghiên cứu của Võ Thành Thìn và cứ (2011), thì kháng sinh cịn nhạy
với vi khuẩn E coli là ceftazidime, norfloxacin, gentamycin
Dùng các loại vitamin để nâng cao thể trạng và sức đề kháng của cơ thể Để
chống mất nước và chất điện giải cần cho uống dung dịch glucose hoặc pha dung dịch electroline vào nước uống cho heo uống tự đo
Ngày nay, cĩ thê dùng kháng thể chống E coli chế tạo qua lịng đỏ trứng gà để điều trị, cho hiệu quả tốt, khơng cĩ tồn dư kháng sinh, khơng gây cịi cọc heo
sau điều trị (Lê Văn Tạo, 2006) Phịng bệnh
Quy trình phịng ngừa cảm nhiễm vi khuẩn E coi phải đạt được mục tiêu
giảm thiểu số lượng vi khuẩn E coi gây bệnh trong mơi trường xung quanh
bằng biện pháp vệ sinh tiêu độc tốt, duy trì điều kiện mơi trường chăn nuơi thích hợp, đồng thời tạo mức độ miễn dịch cao cho heo con (Fairbrother,
1992)
Sử dụng kháng thể men vi sinh sản xuất từ các chủng vi sinh vật cĩ lợi như
Lactobacillus acidopphilus, B subtilis, B licheniformis, B polymysa dé diéu
trị ứng dụng rộng rãi trong chăn nuơi
Trang 39Theo Dao Trong Dat va crv (1999), thì một trong những yếu tố quan trọng
nhất đề phịng bệnh tiéu chay 6 heo con do E coli la duy trì cho heo con sống ở mơi trường thích hợp (32 — 34°C đối với heo chưa cai sữa va 28 — 30C cho heo vừa cai sữa) Khơng để chuồng bị mưa tạt, giĩ lùa, vì heo con rất dễ bị mắt nhiệt đo bề mặt đa quá rộng so với thê trọng
Các hộ chăn nuơi cần phải cĩ chuồng nuơi heo cai sữa, heo cai sữa được phân
chia cùng ngày hoặc gần ngày cai sữa nhất Tập cho heo con ăn sớm nhằm kích thích hệ thống tiêu hĩa của heo phát triển hồn thiện về chức năng và tổ
chức nhằm thích nghỉ với điều kiện sống Cân trọng chăm sĩc và cho khẩu phần ăn thích hợp cho heo con mới cai sữa để tránh tiêu chảy
Khẩu phần cĩ thể giảm xuống để hạn chế sự cư trú của E coli trong ruột, thêm acid lactic vào khẩu phần ăn hoặc nước uống cĩ thé làm giảm độ pH dạ dày và ức chế sự tăng nhanh số lượng của vi khuẩn E coli gây bệnh
Trang 40CHUONG 3
PHUONG TIEN PHUONG PHAP
3.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện: đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 11/2013 Địa điểm: phịng thí nghiệm vệ sinh thực phẩm, Bộ mơn Thú Y, khoa Nơng
nghiệp và Sinh học Ứng dụng — Trường Đại học Cần Thơ 3.1.2 Đối tượng thí nghiệm
Heo con bị tiêu chảy tại các hộ chăn nuơi của huyện Vũng Liêm, Long Hồ và thành phố Vĩnh Long Mẫu phân heo tiêu chảy chưa qua điều trị
3.2 Phương tiện nghiên cứu
3.2.1 Dụng cụ và trang thiết bị thí nghiệm
Thùng lấy mẫu, tăm bơng, bình cồn, hột quẹt, ống nghiệm lấy mẫu, giấy đo PH, bơng gịn, phiếu điều tra, kéo, tủ sấy, tủ ấm, autoclave, may li tâm, máy
lắc, máy chạy điện đi, máy PCR, bếp đun cách thủy, buồng cấy vơ trùng, cân,
dao, kéo, dia petri, ống nghiệm, ống đong, ống hút, chai, que cấy, đèn cơn,
nhiệt kế, túi nylon, găng tay, khâu trang, đá khơ 3.2.2 Hĩa chất, mơi trường
Cồn, nước cất, natri clorua, MacConkey Agar (MC; Merck, Germany), Nutrient Agar (NA), Kligler Iron Agar (KIA; BBL™, France), Trypticase Soy
Agar (TSA; BBL, USA), Lysine Indole Motility Medium (LIM; Eiken, Japan), VP medium (Eiken, Japan)
Thuéc thir Kowacs, VP1, VP2
Khang thể chuẩn K88, K99, 987P được cung cấp boi Denka Seiken Co., Ltd Tokyo Japan
Cac héa chat va dung dich ding cho phan tng PCR: TE buffer, TAE buffer,
agrarose, Distilled — Water, Master Mix 2X (Promega Corperation, Madison,
USA), Ethidium bromide, 100 bp DNA Ladder (Fermentas, USA)
Các đoạn mỗi sử dụng trong phản ứng PCR để khuếch đại các gene độc tố LT,
STa, STb (Promega Corporation, USA)