Nghiên cứu thu nhận và xác định đặc tính gắn kết igg của protein g từ chủng vi khuẩn streptococcus sp ở việt nam

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Bùi Thị Hải Hòa Khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội TS Đỗ Biên Cương Phòng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tận tình giúp đỡ, hướng dẫn cho trình nghiên cứu suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, anh chị, bạn sinh viên phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học - Viện Đại học Mở Hà Nội anh chị, bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh sinh học phân tử - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực đề tài Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khuyến khích giúp vượt qua khó khăn suốt thời gian nghiên cứu thực đề tài Hà Nôi, ngày 24 tháng năm 2015 Phạm Thế Phúc LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu thực hướng dẫn khoa học TS Bùi Thị Hải Hòa trường Viện Đại học Mở Hà Nội TS Đỗ Biên Cương trường Đại học Bách khoa Hà Nội, với giúp đỡ sinh viên Tạ Thị Hiền sinh viên làm việc phòng thí nghiệm khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội bạn học viên, sinh viên học tập làm việc phòng thí nghiệm Vi sinh - Hóa sinh sinh học phân tử, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 24 tháng năm 2015 Phạm Thế Phúc LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Mục lục DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung protein G 1.1.1 Khái niệm, nguồn gốc protein G .3 1.1.2 Vai trò sinh học protein G 1.1.3 Protein G bệnh lý .4 1.2 Cấu tạo protein G 1.3 Cơ chế gắn kết protein G với IgG 1.4 Nguồn thu đặc tính gắn kết protein G với IgG 1.5 Ứng dụng protein G miễn dịch học 1.6 Vi khuẩn sinh tổng hợp protein G 11 1.6.1 Giới thiệu vi khuẩn Streptococcus 11 1.6.1.1 Đặc điểm hình thái vi khuẩn Streptococcus 11 1.6.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa .11 1.6.2 Đặc điểm sinh trưởng khả sinh độc tố vi khuẩn Streptococcus .13 1.6.2.1 Đặc điểm sinh trưởng 13 1.6.2.2 Cấu trúc kháng nguyên 15 1.6.2.3 Các enzym độc tố .15 1.6.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển Streptococcus spp…………………………………………………………………………….17 1.6.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 17 1.6.3.2 Ảnh hưởng pH 17 1.6.3.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon .18 1.6.3.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ .18 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP 1.6.3.5 TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 18 1.7 Tình hình nghiên cứu khả sinh tổng hợp protein G từ Streptococcus spp 19 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị máy móc 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Hóa chất thiết bị .20 2.1.2.1 Thiết bị 20 2.1.2.2 Hoá chất thí nghiệm .21 2.1.3 Môi trường nuôi vi sinh vật 21 2.1.3.1 Môi trường phân lập 21 2.1.3.2 Môi trường lên men 21 2.2 Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phương pháp vi sinh .22 2.2.1.1 Phương pháp phân lập tuyển chọn vi khuẩn Streptococcus .22 2.2.1.2 Xác định đặc điểm sinh lý - sinh hóa .22 2.2.1.3 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp protein chủng vi khuẩn .24 2.2.2 Phương pháp hóa sinh sinh học phân tử 25 2.2.2.1 Tách chiết protein G 25 2.2.2.2 Tinh protein qua sắc ký lọc gel Sephadex G-50 26 2.2.2.3 Xác định hàm lượng protein G 27 2.2.2.4 Điện di protein .27 2.2.2.5 Đánh giá độ tinh protein phần mềm Image J 29 2.2.2.6 Phương pháp Western blot 29 2.2.2.7 Tách DNA tổng số 30 2.2.2.8 Phương pháp điện di gel agarose 31 2.2.2.9 Nhân dòng gen 16S rRNA 31 2.2.2.10 ELISA gián tiếp kiểm tra khả gắn kết kháng thể động vật Protein G ……………………………………………………………………………32 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .34 3.1 Phân lập định tên chủng vi khuẩn Streptococcus 34 3.1.1 Phân lập tuyển chọn chủng Streptococcus .34 3.1.2 Chọn chủng có khả sinh protein G cao 40 3.1.3 Định tên chủng theo trình tự 16S rRNA .41 3.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp protein Streptococcus suis L5 43 3.2.1 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy 43 3.2.2 Ảnh hưởng pH 45 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn cacbon 46 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ 47 3.2.5 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống .48 3.2.6 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 49 3.3 Làm protein G Streptococcus suis L5 50 3.4 Nghiên cứu đặc tính gắn kết với kháng thể động vật protein G Streptococcus suis L5 53 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .55 Kết luận 55 Kiến nghị 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHIA : Brain Heart Infusin Agar BSA : Bovine Serum Albumin CAMP : Christie, Atkins, Munchpeterson cAMP : Cyclic Adenosine Monophosphate DAG : diacyglycerol DNA : Deoxylribonucleic aicd ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GTP : Guanosine triphosphate IgG : Immunoglobulin G IP3 : Inositol trisphotphate KIA : Kligler Iron Agar KLPT : Khối lượng phân tử LB : Luria-Bertani MR :Methyl Red OD : Độ đục PBS : Phosphate Buffer Saline PLC : Phospholipase C SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophores TSA : Tryticase Soy Agar V.P : Voges-Proskauer LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Mô tả cấu trúc G-protein………………………………………… Hình 1.2: Hình thái vi khuẩn Streptococcus 11 Hình 3.1: Đặc điểm hình thái sinh hóa số chủng cầu khuẩn sàng lọc 39 Hình 3.2: Khả sinh protein G chủng phân lập 41 Hình 3.3: Điện di đồ DNA tổng số chủng L5 42 Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR nhân dòng 16S rDNA chủng L5 42 Hình 3.5 Cây phân loại chủng L5 theo trình tự 16S rDNA 43 Hình 3.6 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng protein G 44 Hình 3.7 Ảnh hưởng pH đến hàm lượng protein G 45 Hình 3.8 Ảnh hưởng nguồn carbon đến hàm lượng protein G 46 Hình 3.9 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hàm lượng protein G 48 Hình 3.10 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến hàm lượng protein G 49 Hình 3.11 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein G 50 Hình 3.12: Điện di đồ protein sau sắc ký 51 Hình 3.13 Kết Western Blot 53 Hình 3.14: Khả gắn kết protein G từ Streptococus suis L5 với IgG số loài động vật 54 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Khả gắn kết kháng thể protein G 10 Bảng 3.1: Kết cầu khuẩn gram dương phân lập 34 Bảng 3.2: Kết thử nghiệm sinh hóa 24 chủng cầu khuẩn sàng lọc .37 Bảng 3.3: Độ tương đối protein G qua phân đoạn 52 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI MỞ ĐẦU Ngày nay, việc sử dụng kháng thể công tác điều trị chuẩn đoán bệnh người, động vật thực vật trở nên phổ biến Trong IgG, chiếm 80% tổng số immunoglobulin, lớp kháng thể máu dịch ngoại bào, có chức kiểm soát bảo vệ thể với tượng nhiễm trùng Được cấu tạo từ bốn chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng (H, heavy) giống hệt hai chuỗi nhẹ (L, light) giống hệt nhau, IgG giữ vai trò việc bảo vệ thể chống lại tác nhân gây bệnh, đảm nhiệm chức opsonin hóa, hoạt hóa bổ thể, gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (giúp tế bào diệt tế bào đích), trung hòa ngoại độc tố, gây ngưng kết vi khuẩn trung hòa virut Trên giới, có hàng ngàn loại sinh phẩm chẩn đoán miễn dịch học có sử dụng IgG Hiện Việt Nam, IgG sử dụng hệ thống chẩn đoán miễn dịch nhiên chưa có hệ thống tinh IgG có hiệu cao dẫn tới chưa thiết lập hệ thống chuẩn đoán nước Một nghiên cứu quan tâm sử dụng phương pháp sắc ký lực với protein A protein G để tách tinh chế IgG Theo nghiên cứu, protein A protein G có khả liên kết với IgG mảnh Fc IgG Tuy nhiên, protein G khả gắn với vùng Fc IgG nhiều loài động vật có vú có khả gắn kết với vùng Fab IgG Bên cạnh đó, Protein G gắn kết làm loạt IgG mà protein A gắn kết yếu liên kết lực protein G với IgG số loài cao so với lực protein A [33] Do vậy, theo nghiên cứu việc sử dụng protein G tinh IgG đem lại hiệu tốt so với dùng protein A tinh IgG Ở Việt Nam nay, chưa có nghiên cứu cụ thể cho việc xác định loại protein tách chiết tinh kháng thể Do việc thu LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI nhận sản xuất protein G làm nguyên liệu tách chiết IgG từ chủng vi khuẩn Streptococus Việt Nam hướng cần nghiên cứu để sử dụng nguồn thu nguyên liệu sẵn có phục vụ cho công tác điều trị chẩn đoán bệnh người động vật nước Trên sở đó, thực đề tài: “Nghiên cứu thu nhận xác định đặc tính gắn kết IgG protein G từ chủng vi khuẩn Streptococcus sp Việt Nam” Mục tiêu đề tài: Xác định điều kiện thích hợp thu nhận protein G từ chủng vi khuẩn thuộc chi Streptococcus phân lập Việt Nam đánh giá khả gắn kết protein G với IgG Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu nghiên cứu phải tiến hành số nội dung cụ thể sau: - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn thuộc chi Streptococcus có khả sinh protein G - Định tên vi khuẩn - Tách chiết protein G - Đánh giá đặc tính gắn kết protein G với IgG số động vật LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 3.2.3 Ảnh hƣởng nguồn cacbon Các thí nghiệm tiến hành với điều kiện sau: nhiệt độ 35°C; pH = 7,0; tỷ lệ giống chủng L5 10%, nguồn cacbon sử dụng nguồn saccharose, glucose, rỉ đường so sánh với không bổ sung nguồn cacbon Tiến hành lấy mẫu sau 24 giờ, đem siêu âm phá vỡ tế bào, kết tủa định lượng protein Kết thể đồ thị hình 3.8 Nguồn cacbon Hình 3.8 Ảnh hƣởng nguồn cacbon đến hàm lƣợng protein G Hình 3.6 cho thấy chủng có khả sinh tổng hợp protein G mạnh môi trường chứa nguồn cacbon saccharose, glucose Trong môi trường chứa rỉ đường không bổ sung nguồn cacbon, chủng phát triển sinh tổng hợp protein thấp rõ rệt Trong nghiên cứu Chao cộng sự, tối ưu hóa nguồn cacbon môi trường dinh dưỡng để tăng mật độ tế bào vi khuẩn Streptococcus suis ST171 bổ sung nguồn cacbon glucose, saccharose, lactose galactose vào môi trường nuôi cấy 46 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Kết tối ưu cho thấy sử dụng nguồn cacbon 5g/l saccharose cho kết tốt nhất, hẳn bổ sung nguồn cacbon glucose, lactose galactose [19] Điều phù hợp với nghiên cứu đề tài, bổ sung nguồn cacbon saccharose cho hàm lượng protein cao (2,09 g/l) Lựa chọn nguồn cacbon saccharose cho nghiên cứu 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn nitơ Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả tổng hợp protein G chủng Streptococcus suis L5, tiến hành điều kiện nhiệt độ 35°C; pH = 7,0; bổ sung 5% saccharose, tỷ lệ giống chủng L5 10% bổ sung nguồn nitơ pepton, cao nấm men, dịch chiết ngô, bột đậu tương, dịch chiết malt Tiến hành lấy mẫu sau 24 giờ, đem siêu âm phá vỡ tế bào, kết tủa định lượng protein Các kết thể đồ thị hình 3.9 cho thấy protein G Streptococcus suis L5 sinh tổng hợp mạnh môi trường có cao nấm men, dịch chiết ngô pepton (khoảng g/l) Trong với bột đậu tương dịch chiết malt, protein G sinh tổng hợp thấp hơn, đạt khoảng 1,8 g/l (hình 3.9) Theo công bố Chao cộng sự, cao nấm men nguồn nitơ tốt cho Streptococcus suis ST171 tăng sinh, pepton, cao thịt bò cho kết [19] 47 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Nguồn Nitơ Hình 3.9 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến hàm lƣợng protein G Trong nghiên cứu này, hàm lượng protein đạt cao sử dụng cao nấm men dịch chiết ngô 2,14 g/l Tuy nhiên, để giảm chi phí, dịch chiết ngô lựa chọn bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho nghiên cứu 3.2.5 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống Tỷ lệ cấp giống ảnh hưởng tới tốc độ tăng trưởng vi sinh vật Tiến hành khảo sát tỷ lệ cấp giống điều kiện: nhiệt độ 35°C; pH=7; bổ sung đường saccharose, dịch chiết ngô vào môi trường nuôi cấy, chuẩn bị mẫu thí nghiệm với hàm lượng giống ban đầu khác theo tỷ lệ % thể tích nuôi cấy từ 5% đến 25% Tiến hành lấy mẫu sau 24 giờ, đem siêu âm phá vỡ tế bào, kết tủa định lượng protein Kết thí nghiệm thể hình 3.10 48 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Tỉ lệ giống Hình 3.10 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến hàm lƣợng protein G Hình 10 cho thấy tăng tỷ lệ cấp giống, khoảng 5% đến 10%, khả sinh tổng hợp protein chủng tăng Nhưng tỷ lệ cấp giống từ 15% đến 25% protein thu giảm Với tỷ lệ cấp giống 10% (sau 24 nuôi L5 35oC môi trường chứa 5% saccharose, dịch chiết ngô, pH 7,0), protein thu cao 2,27 g/l Ta lựa chọn bổ sung tỷ lệ giống 10% cho nghiên cứu 3.2.6 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy Sau khảo sát điều kiện số yếu tố, tiến hành khảo sát khả lên men sinh tổng hợp protein G qua thời điểm: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 72 96 Streptococcus suis L5 lên men môi trường: LB lỏng, nhiệt độ 35°C; pH = 7,0; bổ sung 5% saccharose, bổ sung dịch chiết ngô tỷ lệ giống chủng L5 10% Tiến hành nuôi 96 giờ, sau 12 tiến hành lấy mẫu xác định khối lượng sinh khối hàm lượng protein Kết thí nghiệm thể hình 3.11 49 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Thời gian Hình 3.11 Ảnh hƣởng thời gian nuôi cấy đến hàm lƣợng protein G Kết từ hình 3.11 cho thấy hàm lượng protein G tỷ lệ thuận với hàm lượng sinh khối tế bào Hàm lượng sinh khối tăng, hàm lượng protein G tăng ngược lại Kết cho thấy hàm lượng protein G cao thời điểm 24h bắt đầu giảm dần tăng thời gian nuôi cấy Từ ta lựa chọn thời gian nuôi cấy 24 Như vậy, qua khảo sát, Streptococcus suis L5 tiến hành lên men sinh tổng hợp protein G điều kiện: nhiệt độ 35 oC, pH 7, bổ sung 5% saccharose, bổ sung dịch chiết ngô, tỷ lệ giống 10% nuôi cấy 24 3.3 Làm protein G Streptococcus suis L5 Theo Gilman, protein G bao gồm tiểu phần α, β, γ [15][30] Có cấu trúc bền vững khó bị phân cắt trypsin [1] Căn vào đặc tính protein G tham khảo tài liệu nghiên cứu tách chiết protein G từ Streptococcus công bố [33], tiến hành làm protein G từ L5 sau: Dịch protein thô thu sau phá vỡ tế bào pha PBS (0,05M, pH 7,0) xử lý với trypsin, sau protein G kết tủa 50 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI aceton lạnh nồng độ 50% v/v Tiếp ly tâm, hòa tan tủa PBS (0,05M, pH 7,0) tiến hành tinh sắc ký lọc gel sử dụng cột Sephadex G-50 thể tích 15 ml, tốc độ chảy 25ml/giờ, thu phân đoạn ml, tiến hành kiểm tra hiệu tinh cách điện di protein gel SDSPAGE Kết điện di đồ cho thấy protein có khối lượng 52 kDa (có thể tiểu phần α protein G [15, 30]) tập trung phân đoạn từ 3-10 (hình 3.11) Hình 3.12: Điện di đồ protein sau sắc ký M: Thang protein chuẩn, 12: phân đoạn 12, 3: phân đoạn 3, 9: phân đoạn 9, 8: phân đoạn 8, 10: phân đoạn 10, 4: phân đoạn 4, 5: phân đoạn Sử dụng phần mềm ImageJ đánh giá độ tinh protein G qua phân đoạn (hình 3.12) cho thấy phân đoạn protein G có độ cao phân đoạn khác 51 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng 3.3: Độ tƣơng đối protein G qua phân đoạn Để khẳng định xác protein 52 kDa thu từ Streptococus suis L5 sau sắc ký thành phần protein G, sử dụng phương pháp lai phân tử Western Blot Protein phân đoạn số sau sắc ký phân tách điện di gel SDS-PAGE, sau tiếp tục chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí phân tách gel Ủ màng lai cố định protein với IgG bò IgG bò kháng thể đặc hiệu, bám vào protein tạo thành phức hợp protein-kháng thể protein G Tiếp theo ủ màng lai với kháng thể thứ cấp IgG thỏ có enzyme peroxidase 52 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI kèm Kháng thể thứ cấp bám vào kháng thể sơ cấp giống kháng thể sơ cấp bám vào protein Tiếp tục ủ màng lai hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme Kết thu cho thấy màng lai xuất băng có kích thước tương ứng 52 kDa so với thang chuẩn kích thước tương đương với protein G chuẩn Sigma (Hình 3.12) Hình 3.13 Kết Western Blot M: Thang protein chuẩn; 1: protein tách chiết từ Streptococus suis L5; 2: Đối chứng (protein G KPL, Canada) 3.4 Nghiên cứu đặc tính gắn kết với kháng thể động vật protein G Streptococcus suis L5 Theo Sjobring cộng sự, protein G gắn với IgG loài gà, lợn, thỏ, bò chuột [33] Vì vậy, nghiên cứu sử dụng IgG gà, lợn, thỏ, bò chuột (Sigma, Mỹ) để xác định khả gắn kết protein G phân đoạn tách chiết từ chủng vi khuẩn Streptococcus suis L5 theo phương pháp ELISA Kết trình bày hình 3.13 53 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 3.14: Khả gắn kết protein G từ Streptococus suis L5 với IgG số loài động vật Kết hình 3.13 cho thấy: protein G tách chiết từ Streptococcus suis L5 gắn kết với loại kháng thể, mức độ gắn kết với IgG loài khác nhau, đó, mức độ gắn kết cao với IgG bò Đáng ý, khả gắn kết protein G từ chủng nghiên cứu với IgG gà khác biệt so với tính chất kết gắn protein G thu nhận từ nguồn khác [14] 54 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ mẫu nội tạng động vật lợn, gà, vịt, cá địa bàn thành phố Hà Nội, phân lập, tuyển chọn định tên theo trình tự 16S rDNA chủng Streptococcus suis L5 có khả sinh protein G Trong điều kiện nhiệt độ: 35oC; pH 7; 5% saccharose, bổ sung dịch chiết ngô tỷ lệ cấp giống 10% sau 24 nuôi cấy, Streptococcus suis L5 sinh tổng hợp protein G đạt 2,27 g/l Sử dụng quy trình kết hợp siêu âm phá tế bào, xử lý loại protein tạp với trypsin, kết tủa aceton 50% v/v sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G-50, làm phần protein G từ Streptococcus suis L5 Protein G từ Streptococcus suis L5 có khối lượng phân tử 52 kDa, có khả kết gắn với IgG loài động vật: gà, lợn, thỏ, bò chuột Kiến nghị -Nghiên cứu ứng dụng protein G từ Streptococcus suis L5 để tách chiết IgG phục vụ công tác điều trị chẩn đoán bệnh vật nuôi 55 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TRONG NƢỚC Đỗ Ngọc Liên (2007), “Sinh học phân tử mạng tế bào”, Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội Gs Vũ Triệu An( 2007), “Giải thưởng Nobel Sinh lý hay Y học từ năm 1901 đến năm 2007”, NXB Y học Đồng Thanh Hà, Nguyễn Viết Khuê, Nguyễn Thị Hạnh (2011), “Tác nhân gây bệnh streptococcosis cá rô phi miền bắc Việt Nam”, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I Viện vệ sinh dịch tễ TW (2008), “Qui trình nuôi cấy phân lập vi khuẩn Streptococcus suis”, http://www.nihe.org.vn/ Khuất Hữu Thanh (2006), “Kỹ thuật gen: Nguyên lý ứng dụng” NXB Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng (2004), “Công nghệ vi sinh vật – Cơ sở vi sinh vật Công nghiệp”, NXB Đại học Quốc gia TP HCM Lê Đức Trình ( 2012), “Hormon nội tiết học” ; Nội tiết học phân tử, NXB Y học Trịnh Phú Ngọc cs (1999), “Bệnh liên cầu khuẩn Streptococcus suis gây lợn biện pháp phòng chống”, Tạp chí thú y số TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI Angela M Gronenborn and G Marius Clore (1993), “Structural studies of immunoglobulin-binding domains of Streptococcal protein G”, Immunomethod 2, 3-8 10 Angel A, Patrick EA, Norma MA, Monica P (2013), “Use of Staphylococcal protein-A and Streptococcal protein-G for detection of red blood cells (RBC) antibodies and comparison with other techniques”, British Journal of Medicine and Medical Research 3(4): 1671-1677 56 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 11 Bjorck and Kronvall, 1984 (1984), “Purification and some properties of streptococcal protein G, a novel IgG-binding reagent “, Journal of Immunology 133(2):969-974 12 Bjorck and Kronvall (1991), “Protein G from groups G and C streptococcus was described ”, The journal of biological chemistry 266 (1): 399-405 13 Bengt Guss, Margareta Eliasson, Anders Olsson, Mathias Uhlen, AnnKristin Frej, Hans Jornval, JanIngmar Flock and Martin Lindberg (1986), “Structure of the IgG-binding regions of streptococcal protein G”, The EMBO journal, vol.5 no.7 pp.1567-1575 14 Bouchra Serhir, Daniel Dubreuil, Robert Higgins and Mario Jacques (1991), “Purification and characterization of a 52-kilodalton immunoglobulin G-binding protein from streptococcus suis capsular type 2”, The journal of bacteriology, p 3830–3836 15 Christopher G, Laurence I, Jonathan M, Tony A (1991), “The secondary structure of protein G', a robust molecule”, The journal of biological chemistry 274, 503-50 16 Frank Lowy, “Streptococci and Enterococci” , Murray - chapters 23, pages 237-258 and Chapter 24, pages 259-263 17 Goward CR, Murphy JP, Atkinson T, Barstow DA (1990), “Expression and purification of a truncated recombinant streptococcal protein G”, Journal of Biochemistry 267(1): 171–177 18 Graziella El Khoury and Christopher R Lowe (2013), “A biomimetic protein G affinity adsorbent: an ugi ligand for immunoglobulins and Fab fragments based on the third IgG-binding domain of protein G”, Journal of Molecular Recognition, 26: 190–200 57 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 19 Jing Wang , Qiang Fu, Xiuyan Yang, Shuguang Li, Feng Li Zhiqiang Shen (2015), “Optimization of carbon and nitrogen sources and substrate feeding strategy to increase the cell density of Streptococcus suis”, Biotechnology & Biotechnological Equipment, Vol 29, No 20 Kang Chao , Wang Bo , Jin Meilin , Chen Guan Ping , Chen Bo , Hanjin (2009), “High-density culture method of streptococcus suis2009”, Foreign zootecnic - swine and poultry , Vol 29, No 21 Kennet Todar, “Streptococcus pyogenes and Streptococcal disease,” Todar's online textbook of bacteriology, The Good, the Bad, and the Deadly 22 Khoury EG, Lowe CR (2013), “A biomimetic protein G affinity adsorbent: an ugi ligand for immunoglobulins and Fab fragments based on the third IgG-binding domain of protein G”, Journal of Molecular Recognition, 26(4):190-200 23 John C Foreman, Torben Johansen ( 2003), Text book of receptor pharmacology Second Edition 24 Lewis WW(1983), “Type 49 Streptococcus pyogenes: Phage subtypes as epidemiological markers in isolates from skin sepsis and acute glomerulonephritis”, J Hyg (Lond) , 91(1): 71–76 25 Line Naomi Lund, Trine Christensen , Eric Toone , Gunnar Houen, Arne Staby and Phaedria Marie St Hilaire (2011), “Exploring variation in binding of protein A and protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry”, Journal of Molecular Recognition, 2011; 24: 945–952 26 Margareta E, Anders O, Elisabeth P, Kristina W, Martin Lindberg, and Mathias U (1987), “Chimeric IgG-binding receptors engineered from Staphylococcal protein A and Streptococcal protein G”, The journal of biological chemistry 263: 4324-4327 58 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 27 Martin R, Lutz B, Stephen LP, Sundby F (1971), “The Reaction of Glucagon with Its Receptor: Evidence for Discrete Regions of Activity and Binding in the Glucagon Molecule”, Proc Natl Acad Sci U S A.; 68(5): 909– 913 28 Marie-Claude Jobin, Daniel Grenier (2003), “Identi¢cation and characterization of four proteases produced by Streptococcus suis”, FEMS Microbiology Letters 220, 113-119 29 Michael D P Boyle, Ervin Faulmann (1990), “Novel extraction procedure for protein G”, United States Patent 30 Micheal Wilcox, Kevin Schey, Dingus J, Tatum BS, Halushka M, Finch JW, Hildebrandt JD (1994), “Analysis of G protein gamma subunit heterogeneity using mass spectrometry”, The journal of biological chemistry 269, 12508-12513 31 Ruchi Sharma, Aditi Gupta (2014), “Differentiation of oral Streptococcal species by haemolysis in blood agar medium in vitro”, International journal of engineering and advanced technology (IJEAT) ISSN: 2249 – 8958, Volume3, Issue-4 32 Riad B, Marcelo GG, Mario J, Daniel D (1998), “Immunochemical characterization of an IgG-binding protein of Streptococcus suis”, FEMS Immunology and Medical Microbiology 20: 121-127 33 Sjobring L, William B (1991), ”Streptococcal protein G Gene structure and protein binding properties”, The journal of biological chemistry 266 (1): 399-405 59 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHỤ LỤC Trình tự 16S rDNA chủng L5 Tctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtggaacgcatgatt gataccggagcttgctccaccattaatcatgagtcgcgaacgggtgagtaacgcgtag gtaacctacctcatagcgggggataactattggaaacgatagctaataccgcataaca gtatttatcgcatggtaaatgcttgaaaggagcaactgcttcactatgagatggacct gcgttgtattagctagttggtggggtaacggctcaccaaggcttcgatacatagccga cctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggag gcagcagtagggaatcttcggcaatggggggaaccctgaccgagcaacgccgcgtga gtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgtaagagaagaacgtgtgtgagagt ggaaagttcacacagtgacggtatcttaccagaaagggacggctaactacgtgccag cagccgcggtaatacgtaggtcccgagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgag cgcaggcggtttgataagtctgaagtaaaaggctgtggcttaaccatagtacgctttg gaaactgtcaaacttgagtgcagaaggggagagtggaattccatgtgtagcggtgaa atgcgtagatatatggaggaacaccggtggcgaaagcggctctctggtctgtaactga cgctgaggctcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgc cgtaaacgatgagtgctaggtgttgggtcctttccgggactcagtgccgcagctaacg cattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgac gggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacct taccaggtcttgacatcccgatgaccgccctagagatagggtttctcttcggagcatc ggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcc cgcaacgagcgcaacccctattgttagttgccatcattcagttgggcactctagcgag actgccggtaataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttat gacctgggctacacacgtgctacaatggctggtacaacgagtcgcaagtcggtgacgg caagctaatctcttaaagccagtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatg aagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggcc ttgtacacaccgccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaac catttaggagccagccgcctaaggtgggata 60 ... lực g n IgG hai vùng B1, B2 Ngoài ra, nghiên cứu cho thấy protein G g n kết với vùng Fab IgG yếu so với vùng Fc [9] 1.4 Nguồn thu đặc tính g n kết protein G với IgG Protein G, tế bào vi khuẩn. .. dê… [11] Ngoài khả g n kết với kháng thể loài động vật, protein G g n kết với bốn lớp IgG1 , IgG2 , IgG3 , IgG4 người nhiên không g n kết với lớp IgA, IgY, IgD, IgE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC... Xác định điều kiện thích hợp thu nhận protein G từ chủng vi khuẩn thu c chi Streptococcus phân lập Vi t Nam đánh giá khả g n kết protein G với IgG Nội dung nghiên cứu Để đạt mục tiêu nghiên cứu