Dịch enzyme ựược tiến hành tủa phân ựoạn bằng muối amoni sunphate, kết tủa ựược hòa tan trong ựệm phosphate pH 7 và tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký.
Sau khi khảo sát liên tiếp các phân ựoạn, 0 - 30%; 30 - 40%; 40 - 50%; ..; 80 - 90% bão hòa của muối amoni sunphate với dịch enzyme thô, chọn phân ựoạn 30 - 80% bão hòa ựể làm sạch sơ bộ enzyme.
Tiến hành kết tủa enzyme ở 4oC, muối amoni sunphate ựược thêm vào dung dịch ựến 30% bão hòa, ựể qua ựêm, ly tâm 6000 vòng/phút, bỏ cặn tủa. Sau ựó tiếp tục tủa enzyme bằng muối ở phân ựoạn 80% bão hòa. Chế phẩm enzyme thu bằng phương pháp này chứa nhiều muối vì vậy cần loại muối bằng cách phương pháp sắc kắ lọc gel, sử dụng gel sephadex- G25.
Quá trình lọc gel thực hiện với thông số như sau: Thể tắch bơm mẫu: 10ml
Tốc ựộ dòng chảy: 10ml /phút
Hệ dung môi: ựệm phosphate 0,05 M, pH = 7; rửa giải với gradient 0 ọ 0,05 M NaCl
Detector : UV, bước sóng 280 nm
Thu các pic và xác ựịnh pic có hoạt tắnh chitosanase cao và tiếp tục làm sạch bằng sắc ký trao ựổi ion.
Các thông số của quá trình sắc ký trao ựổi ion như sau: Cột: CMFF (GE Health care, Sweden)
Thể tắch bơm mẫu: 5ml Tốc ựộ dòng chảy: 2ml/phút
Hệ dung môi: ựệm phosphate 0,05 M, pH = 7; rửa giải với gradient 0 ọ 0,16 M NaCl
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 37
Tiếp tục thu nhận các pic thể hiện hoạt tắnh chitosanase cao, thực hiện ựiện di ựể kiểm tra ựộ sạch và thực hiện sắc ký trao ựổi ion lần thứ hai nếu thấy cần thiết.