Hoạt tắnh enzyme chitosanase xác ựịnh qua sản phẩm tạo ra là hàm lượng ựường khử tạo ra sau phản ứng.
Nguyên tắc: Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các
oligosaccharide có chứa ựường khử D-glucosamine. Phương pháp acid dinitrosalicylic kiểm tra sự có mặt của nhóm (C = O) trong ựường khử, oxy hoá nhóm aldehyt trong ựường, ựồng thời 3,5-dinitrosalicylic bị khử tạo thành 3-amino,5-nitrosalicylic trong môi trường kiềm.
CHO- COO-
3,5 Ờ dinitrosalicylic acid 3-amino,5-nitrosalicylic acid Theo trình tự phản ứng, một phân tử ựường sẽ phản ứng với 1 phân tử DNS.
Nguyên liệu:
Tác nhân phản ứng DNS gồm:
Nước cất: 1416 ml; 3,5 Acid dinitrosalicylic C7H4N2O7: 10,6 g; NaOH: 19,8 g; Muối Seignette KNaC4H4O6.4H2O: 306 g; Phenol: 7,6 ml; Natri metabisulfit: 8,3 g.
Chuẩn bị mẫu và ựo ựộ hấp thụ quang học của các mẫu enzyme:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm, một ống thắ nghiệm, một ống ựối chứng. Lấy 1ml dịch enzyme cho vào mỗi ống, ở ống ựối chứng cho thêm 0,6ml dung dịch NaOH 10N ựể bất hoạt enzyme. Sau ựó, thêm vào mỗi ống 3ml dung dịch chitosan 0,2%. đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt ựộ 50oC/20phút. Sau ựó, nhỏ 0,6 ml NaOH 10N vào ống thắ nghiệm ựể dừng phản ứng. Ly tâm 2 ống, hút mỗi ống 2ml dịch trong, thêm vào mỗi ống 2ml DNS, ựặt trong bể ổn nhiệt 95oC/5-10 phút, ựể nguội ựến nhiệt ựộ phòng và ựo A540.
Lượng ựường khử tạo ra tắnh theo phương trình ựường chuẩn.
định nghĩa ựơn vị hoạt tắnh enzyme chitosanase: Một ựơn vị hoạt tắnh
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 39
giải phóng ra 1ộmol ựường khử trong thời gian 1 phút ở các ựiều kiện của phương pháp phân tắch.