hoạch thực nghiệm
Từ kết quả thực nghiệm thăm dò ựơn yếu tố, chúng tôi lấy ựiều kiện pH 7, nhiệt ựộ 37oC và nồng ựộ chitosan là 0,2% là mức cơ sở và xác ựịnh vùng khảo sát như sau:
Nhiệt ựộ nuôi cấy: 29 ọ 45oC pH môi trường nuôi cấy: 6 ọ 8
Nồng ựộ chitosan trong môi trường nuôi cấy: 0,1 ọ 0,3%
Kết quả bố trắ thắ nghiệm theo ma trận kế hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai của Doehlert trên bảng 4.1.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 42
Bảng 4.1. Bố trắ thắ nghiệm theo kế hoạch trực giao bậc hai của Doehlert
Số TN Nhiệt ựộ ( 0 C) pH Nồng ựộ chitosan (%) 1 45,0 7,0 0,2 2 29,0 7,0 0,2 3 41,0 7,9 0,2 4 33,0 6,1 0,2 5 41,0 6,1 0,2 6 33,0 7,9 0,2 7 41,0 7,3 0,3 8 33,0 6,7 0,1 9 41,0 6,7 0,1 10 37,0 7,6 0,1 11 33,0 7,3 0,3 12 37,0 6,4 0,3 13 37,0 7,0 0,2 14 37,0 7,0 0,2 15 37,0 7,0 0,2
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 43
Bảng 4.2. Kết quả của các thực nghiệm trong ma trận thực nghiệm
Biến thực Biến mã Số TN Nhiệt ựộ (0C) pH Nồng ựộ chitosan (%) X1 X2 X3 Hoạt tắnh chitosanase (U/ml) Y 1 45,0 7,0 0,2 1,0000 0,0000 0,0000 0,0348 2 29,0 7,0 0,2 -1,0000 0,0000 0,0000 0,0589 3 41,0 7,9 0,2 0,5000 0,8660 0,0000 0,0391 4 33,0 6,1 0,2 -0,5000 -0,8660 0,0000 0,0300 5 41,0 6,1 0,2 0,5000 -0,8660 0,0000 0,0232 6 33,0 7,9 0,2 -0,5000 0,8660 0,0000 0,0619 7 41,0 7,3 0,3 0,5000 0,2887 0,8165 0,0518 8 33,0 6,7 0,1 -0,5000 -0,2887 -0,8165 0,0693 9 41,0 6,7 0,1 0,5000 -0,2887 -0,8165 0,0430 10 37,0 7,6 0,1 0,0000 0,5774 -0,8165 0,0328 11 33,0 7,3 0,3 -0,5000 0,2887 0,8165 0,0690 12 37,0 6,4 0,3 0,0000 -0,5774 0,8165 0,0389 13 37,0 7,0 0,2 0,0000 0,0000 0,0000 0,0698 14 37,0 7,0 0,2 0,0000 0,0000 0,0000 0,0699 15 37,0 7,0 0,2 0,0000 0,0000 0,0000 0,0701
Với hệ số tương quan bội R2 = 0,7 cho phép khẳng ựịnh phương trình thể hiện mối quan hệ giữa các yếu tố nhiệt ựộ, pH và nồng ựộ chitosan với hoạt tắnh enzyme là hồi quy với các hệ số như sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 44
Bảng 4.3. Hệ số của phương trình hồi quy
Hệ số Giá trị hệ số Mức ý nghĩa. % b0 0,06923 < 0,01 *** b1 -0,01064 0,0493 *** b2 0,00301 0,649 ** b3 0,00190 1,89 * b11 -0,02238 0,0395 *** b22 -0,03345 0,0227 *** b33 -0,01541 0,0667 *** b12 -0,00924 0,337 ** b13 0,03101 0,0407 *** b23 -0,00572 1,32 *
( *** mức ý nghĩa 0,01, ** mức ý nghĩa 0,05, * mức ý nghĩa 0,1)
Với mức ý nghĩa 0,05 các hệ số b0, b1, b2, b11, b22, b33, b12, b13 là có ý nghĩa, hệ số b3, b23 là không có ý nghĩa hay chỉ có ý nghĩa với mức ý nghĩa là 0,1.
Ta có phương trình hồi quy theo biến mã có dạng như sau
Y = 0,06923 - 0,01064 *X1 + 0,00301 *X2 - 0,02238 *X1*X1 - 0,03345 *X2*X2 - 0,01541 * X3*X3 - 0,00924 *X1*X2 +0,03101 *X1*X3
đồ thị 4.4, 4.5, 4.6 biểu diễn mối quan hệ của các yếu tố và ựánh giá sự tương tác của các yếu tố và ảnh hưởng của chúng ựến hàm mục tiêu như sau:
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 45
đồ thị 4.4. Sự tác ựộng của nhiệt ựộ (X1) và pH (X2) tới hoạt tắnh chitosanase khi nồng ựộ chitosan (X3) là tâm
Từ ựồ thị chúng tôi thấy, sự tác ựộng của nhiệt ựộ và pH ảnh hưởng rõ ràng tới hoạt tắnh của chitosanase. Trong khoảng biến thiên khảo sát của nhiệt ựộ và pH ta thấy bề mặt biểu diễn có tắnh hội tụ, và ựể ựạt ựược khả năng sinh enzyme tốt (y>0,069 U/ml) trong trường hợp cố ựịnh về nồng ựộ chitosan tại
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 46
tâm kế hoạch là 0,2 % thì X1 (-0,45 ọ -0,1) và X2 (-0,1 ọ 0,22) tương ứng với nhiệt ựộ (33,1 ọ 36,2 oC) và pH (6,9 ọ 7,2).
đồ thị 4.5. Sự tác ựộng của nồng ựộ chitosan (X3) và pH (X2) tới hoạt tắnh chitosanase khi nhiệt ựộ (X1) là tâm
Từ ựồ thị chúng tôi thấy, sự tác ựộng của nồng ựộ chitosan và pH ảnh hưởng lớn tới hoạt tắnh của chitosanase. Trong khoảng biến thiên khảo sát của nồng ựộ chitosan và pH, bề mặt biểu diễn có tắnh hội tụ cao, và ựể ựạt ựược khả năng sinh enzyme tốt trong ựiều kiện cố ựịnh nhiệt ựộ tại tâm kế hoạch là
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 47
37oC chọn khoảng X2 (-0,23 ọ 0,38) và X3 (-0,48 ọ 0,51) tương ứng với khoảng pH (6,8 ọ 7,4) và nồng ựộ chitosan (0,15 ọ 0,25 %).
đồ thị 4.6. Sự tác ựộng của nồng ựộ chitosan (X3) và nhiệt ựộ (X1) tới hoạt tắnh chitosanase khi pH (X2) là tâm
Từ ựồ thị chúng tôi thấy, sự tác ựộng của nồng ựộ chitosan và nhiệt ảnh hưởng tới hoạt tắnh của chitosanase, trong khoảng biến thiên khảo sát của nồng ựộ chitosan và nhiệt ựộ, bề mặt biểu diễn có tắnh hội tụ thấp, ựể ựạt ựược (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 48
khả năng sinh enzyme tốt trong ựiều kiện cố ựịnh pH tại tâm kế hoạch (pH 7) có thể chọn khoảng X1 ( -0,42 ọ 0,08) và X3 (- 1 ọ 0,1) tương ứng với nhiệt ựộ (33,4 ọ 37,6 oC) và nồng ựộ chitosan (0,1 ọ 0,21 % ).
Như vậy, ựiều khiển ựiều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis
NN1 cho khả năng sinh tổng hợp chitosanase tốt (y > 0,069 U/ml), có thể lựa chọn các ựiểm thắ nghiệm nằm trong vùng tạo nên bởi giao của các khoảng biến ựộng nêu trên, cụ thể như sau:
X1 ( -0,42 ọ -0,1); X2 ( -0,1 ọ 0,22); X3 ( -0,48 ọ 0,21)
Tương ứng với: Nhiệt ựộ: 33,4 ọ 36,2 0C; pH: 6,9 ọ 7,2; Nồng ựộ cơ chất chitosan: 0,15 ọ 0,21 %
Xác ựịnh ựiều kiện nuôi cấy tối ưu
Từ phương trình hồi quy cho phép ta giải bài toán cực trị ựể tìm ựiều kiện nuôi cấy tối ưu cho vi khuẩn sinh tổng hợp cao enzyme chitosanase. Thuật toán này cũng ựược thực hiện trên phần mềm Memrodw cho kết quả như sau:
Bảng 4.4 Bảng biến mã và biến thực tương ứng của ựiều ựiện nuôi cấy tối ưu
Biến mã Giá trị biến mã Yếu tố Giá trị thực
X1 -0,065350 Nhiệt ựộ 36,2
X2 0,080023 pH 7,08
X3 0,010479 Nồng ựộ chitosan 0,20
Với ựiều kiện này hoạt tắnh chitosanase tắnh theo phương trình ựạt ựược là: 0,07 U/ml.
Kiểm chứng bằng thực nghiệm
Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn theo ựiều kiện nêu trên, hoạt tắnh chitosanase thu ựược là 0,0702 U/ml, ựiều này phù hợp với giá trị tối ưu xác ựịnh bởi phương trình hồi quy. Do vậy, ựiều kiện nuôi cấy vi khuẩn
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 49
Bacillus licheniformis NN1 ựể sinh tổng hợp cao enzyme chitosanase ựược
lựa chọn là :
Nhiệt ựộ: 36,2 oC pH: 7,08
Nồng ựộ chitosan: 0,2%
4.1.3 Xác ựịnh ựường cong sinh trưởng của vi khuẩn
Thực hiện theo phương ựã nêu ở 3.4.2.3, vi khuẩn từ môi trường giữ giống ựược chuyển sang môi trường hoạt hóa, cứ 6 h ựo ựộ hấp thụ quang ở bước sóng 620 nm và xác ựịnh hoạt tắnh enzyme. Kết quả ựược trình bày trên ựồ thị 4.7. 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108114 120 126 Thời gian (h) A260 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 Hoạt tắnh chitosanase (u/m l) A 620 Hoạt tắnh (U/ml)
đồ thị 4.7. đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus lichenifomis
Từ ựồ thị 4.7 cho thấy, từ 0 - 12h ựầu nuôi cấy số lượng tế bào tăng lên rất chậm, ựây chắnh là thời gian tương ứng với pha mở ựầu (pha lag) trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Từ 12 - 42 h, vi khuẩn sinh trưởng và phát triển nhanh chóng tương ứng với pha tăng trưởng
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 50
(pha log), ựộ hấp thụ quang học lúc này ựạt cao nhất là 2,630, nhưng sau ựó số lượng tế bào ổn ựịnh và có xu hướng giảm dần sau 102 h nuôi cấy, giai ựoạn này ứng với pha ổn ựịnh và pha tử vong trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khi nuôi cấy trong hệ "kắn". Như vậy, dựa trên ựường cong sinh trưởng ta xác ựịnh ựược thời ựiểm tiếp giống tốt nhất là khoảng gần 40h của môi trường hoạt hóa hoặc nhân giống, trong giai ựoạn này số lượng tế bào lớn, các tế bào ở trạng thái ựộng học biểu hiện ựặc tắnh hình thái và sinh lý ựiển hình nhất, cho chất lượng giống tốt nhất.
đồng thời với việc theo dõi ựộng thái sinh trưởng và phát triển của quần thể vi khuẩn, tiến hành xác ựịnh khả năng sinh tổng hợp chitosanase. Enzyme chitosanase là loại sản phẩm mà sự hình thành của nó gắn với sự sinh trưởng vi khuẩn, do vậy sự tổng hợp của nó thường xảy ra trong thời gian sinh trưởng và có thể tiếp diễn sau ựó. Sự tổng hợp chitosanase bắt ựầu trong pha lag và log, nhưng phải ựến giữa pha ổn ựịnh sự tổng hợp ựạt mức cao và sau ựó lại có xu hướng giảm sau 72h nuôi cấy. Một ựiều ựáng chú ý là sự sản sinh chitosanase lại tăng và tăng cao hơn khi vẫn tiếp tục nuôi cấy sau ựó, vào khoảng 108 h hoạt tắnh ựạt khoảng 0,069 U/ml. điều này cũng tương tự như quá trình chitosanase của vi khuẩn Bacillus cereus TP 1224 [36].
4.2.Tinh sạch chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn theo ựiều kiện ựã chọn (Nhiệt ựộ: 36,2oC; pH: 7,08; Nồng ựộ chitosan: 0,2%), tiến hành ly tâm lạnh và thu dịch enzyme thô, xác ựịnh hoạt tắnh ban ựầu và chuẩn bị cho các bước làm sạch. Hoạt tắnh chitosanase của dịch enzyme thô sau nuôi cấy là 0,0702 U/ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});