đối với Việt Nam, nghiên cứu về chitosan, COS, glucosamine và chitosanase mới ựược chú ý trong những năm gần ựây và ựang có những kết quả bước ựầu.
Năm 1998-2001 ựề tài nghiên cứu ỘHoàn thiện công nghệ sản xuất Chitin-Chitosan và sản xuất một số chế phẩm công nghệ và dược học từ vỏ tôm, ghẹỢ ựã ựược nghiên cứu và hoàn thành tại đại học Thủy sản Nha Trang. Căn cứ vào kết quả và tắnh ứng dụng của ựề tài, Bộ giáo dục và ựào tạo ựã giao cho trường đại học Thủy sản Nha Trang thực hiện tiếp dự án thử nghiệm: ỘSản xuất Chitin, Chitosan từ phế liệu sản xuất thủy sản (vỏ tôm, vỏ ghẹ)Ợ(2003). Kết quả thu ựược là ựã hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học với các mức deacetyl khác nhau, sản xuất thử nghiệm ựược 25 tấn chitin, 100 kg chitosan với chất lượng tốt.
Năm 2006, ựề tài: ỘNghiên cứu sử dụng các hoạt chất sinh học biển ựể thay thế các chất ựộc hại trong bảo quản nông thủy sản sau thu hoạch và chế biến thực phẩmỢ PGS. TS Trần thị Luyến Khoa Chế Biến, Trường đại Học Thủy sản Nha Trang lần ựầu tiên ựã ựưa ra quy trình công nghệ sản xuất COS bằng phương pháp hóa học cùng với khả năng bảo quản nông thủy sản của chitosan, COS trên các ựối tượng cá ồ, cam, quýt, cà chua, hành tắm và dứa quả, thịt heo, thịt bò, cá ngân, và xúc xắch.
Ngoài ra còn rất nhiều những ựề tài nghiên cứu tai các trường đại học , các Viện nghiên cứu trong việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tắnh cao và các nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm này trong lĩnh vực bảo quản và chế biến nông sản, bảo vệ môi trường, y dượcẦnhư: Viện Vacxin Nha Trang cũng ựã nghiên cứu và sản xuất ra 2 thành công sản phẩm Chitosan chữa béo phì và Glusivac ựiều trị thoái hoá khớp ựã ựược Bộ Y tế cấp phép lưu hành toàn quốc vào ựầu tháng
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 30
6/2005. Một số ựề tài nghiên cứu liên quan ựến chitosanase và chitosan oligosaccharide ựã và ựang ựược thực hiện:
Tên ựề tài Thời gian Người thực hiện
Phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp chitosanaza ựể thu nhận chitooligosaccharit
2007
Nghiên cứu thu nhận hoạt chất sinh học chitooligosaccharit bằng enzym chitosanaza cho y dược Việt Nam
2009
TS. Lê Thanh Hà, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm
Bước ựầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitosanase kỹ thuật từ
Streptomyces griseus
2008 Phạm Hồng Ngọc Thùy,
Khoa chế biến, trường đại học Nha Trang Lựa chọn ựiều kiện nuôi cấy tối ưu
ựể sản xuất chitosanase từ
Streptomyces griseus (chủng NN2)
2009
Chọn lựa ựiều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus sp.
2009
PGS.TS. Ngô Xuân Mạnh, Khoa Công nghệ thực phẩm, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội
Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzym chitinase và chitosanase tái tổ hợp"
2010-2011
TS.Phắ Quyết Tiến, Phòng công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Có thể nói chế phẩm chitosan và COS sẽ còn là một lĩnh vực rộng mở và ựang thu hút sự quan tâm không chỉ của các nhà nghiên cứu mà còn của các nhà sản xuất trong nước và ngoài nước.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 31
PHẦN BA: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu
3.1.1. đối tượng
Vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 do bộ môn công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp.
3.1.2. Vật liệu
Môi trường cấy truyền
Peptone (1%); Cao thịt (0,5%); NaCl (0,5%); Agar (2%). pH 7, khử trùng ở 1atm/20 phút.
Môi trường nuôi cấy:
Peptone (1%); Cao thịt (0,5%); NaCl (0,5%); Chitosan (0,2%). pH 7, khử trùng ở 1atm/20 phút.
Thiết bị
Nồi hấp Hiyama (Nhật Bản); Tủ ựịnh ôn ALP (Nhật Bản); Tủ sấy Binder (đức); Buồng cấy vô trùng loại 2 (Anh); Tủ lạnh Toshiba (Nhật Bản); Máy lắc ổn nhiệt GFL (đức); Máy ly tâm lạnh Hettich 6000 vòng/phút (đức); Máy quang phổ UV-1800 Shimadzu (Nhật Bản), Máy khuấy từ (đức); Máy ựo pH Orion (Mỹ); Cân ựiện tử; Bếp ựiệnẦ
Hoá chất
NaCl, NaOH, HCl, Na2SO3, Na2HPO4, NaH2PO4, tinh bột tan, agar, peptone, cao thịt, cao men, chitosan, manitol, acid dinitrosalicylic, acid citric, acid acetic, phenol, potassium sodium tartrate, cồn,.., methanol, axit acetic, Coomasie Blue, metanol..có ựộ sạch P và PA.
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 32
3.1.4. địa ựiểm nghiên cứu
Phòng Công nghệ sinh học thực phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm, trường đại học Nông nghiệp Hà Nội
3.2. Quy trình thu nhận enzyme chitosanase từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis NN1
Enzyme chitosanase ựược thu nhận theo phương pháp ựược Ngô Xuân Mạnh và Nguyễn Thị Phương Nhung (2010) mô tả [3].
3.3. Nội dung nghiên cứu
Lựa chọn các ựiều kiện nuôi cấy tối ưu ựể sinh tổng hợp enzyme chitosanase có hoạt tắnh cao từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1.
Thu nhận và làm sạch enzyme chitosanase
Xác ựịnh một số tắnh chất của enzyme chitosanase.
Hoạt hóa (37oC, 40h, 200v\p) Tinh sạch Ly tâm lạnh (6000v\p) Chế phẩm chitosanase Bacillus licheniformis NN1 Nuôi cấy Tiếp giống 7%
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 33
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
Xác ựịnh ựiều kiện nuôi cấy vi khuẩn bằng bài toán quy hoạch thực nghiệm. Quá trình sinh tổng hợp chitosanase của vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố của quá trình nuôi cấy, trong ựó các yếu tố nhiệt ựộ, pH và nồng ựộ cơ chất chitosanase ảnh hưởng rõ ràng tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase.
Xét ảnh hưởng của ựơn yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh tổng hợp chitosanase:
Ảnh hưởng của pH
Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau: pH thay ựổi từ 4,5 - 8,5
Nhiệt ựộ: 50oC
Nồng ựộ chitosan 0,2%
Ảnh hưởng của nhiệt ựộ
Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau: Nhiệt ựộ thay ựổi 25 - 50oC
pH: pH ựã chọn
Nồng ựộ chitosan 0,2%
Ảnh hưởng của nồng ựộ chitosan Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau: Nồng ựộ chitosan thay ựổi 0,1 - 0,4% Nhiệt ựộ và pH ựã chọn
Sau khi xác ựịnh ựược sự ảnh hưởng của các ựơn yếu tố, xác ựịnh các mức cơ sở và vùng khảo sát ựể giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và tìm ựiểm tối ưu cho vi khuẩn sinh tổng hợp cao chitosananse.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 34
Bố trắ thắ nghiệm theo ma trận kế hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai của Doehlert.
Số ựiểm thắ nghiệm: N=k2 + k + 1= 13 (k=3) Hai thắ nghiệm lặp lại tại tâm
Bảng 3.2. Ma trận kế hoạch thực nghiệm trực giao bậc hai của Doehlert
Số thắ nghiệm X1 X2 X3 1 1,0000 0,0000 0,0000 2 -1,0000 0,0000 0,0000 3 0,5000 0,8660 0,0000 4 -0,5000 -0,8660 0,0000 5 0,5000 -0,8660 0,0000 6 -0,5000 0,8660 0,0000 7 0,5000 0,2887 0,8165 8 -0,5000 -0,2887 -0,8165 9 0,5000 -0,2887 -0,8165 10 0,0000 0,5774 -0,8165 11 -0,5000 0,2887 0,8165 12 0,0000 -0,5774 0,8165 13 0,0000 0,0000 0,0000 14 0,0000 0,0000 0,0000 15 0,0000 0,0000 0,0000
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 35
Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm ựể tìm phương trình mô tả mối quan hệ giữa các yếu tố: Nhiệt ựộ, pH và nồng ựộ chitosan tương ứng với các biến mã hóa X1,X2, X3 có dạng lý thuyết như sau:
Y = b0 + b1*X1 + b2*X2 + b3*X3 + b11* (X1*X1) + b22* (X2*X2)+ b33* (X3*X3) + b12* (X1*X2) + b13* (X1* X3) + b23* (X2*X3) Trong ựó: b0 là hệ số tự do bi (i =1,2,3) là hệ số tuyến tắnh bij (j = 1, 2, 3) là hệ số tương tác cặp
3.4.2.Các phương pháp nuôi cấy và làm sạch enzyme 3.4.2.1. Giữ giống và bảo quản giống
Giống ựược cấy truyền vào môi trường thạch nghiêng và nuôi cấy ở tủ ấm 37oC ựể giữ giống. Sau khi các giống ựã mọc tốt, bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ 3 Ờ 4oC, sau 2-3 tuần cấy truyền lại một lần.
3.4.2.2. Nuôi cấy
Nuôi cấy quy mô phòng thắ nghiệm: Môi trường nuôi cấy ựược phân chia vào các bình tam giác và hấp vô trùng. Cấy giống ựã hoạt hoá vào môi trường nuôi cấy ở chế ựộ vô trùng. Quá trình nuôi ựược tiến hành trên máy lắc ở chế ựộ 200v/ph ở 37oC.
3.4.2.3. Xác ựịnh ựường cong sinh trưởng của vi khuẩn
đường cong sinh trưởng của vi sinh vật biểu diễn sự biến ựổi của số lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh. Tiến hành nuôi vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 trong môi trường nuôi cấy. Cứ sau 6h lại lấy dịch nuôi cấy ựem ựo ựộ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 620nm (A620), ựồng thời xác ựịnh hoạt tắnh enzyme chitosanase. đường cong sinh trưởng ựược xác ựịnh chắnh là sự thay ựổi của ựộ hấp thụ quang học trong quá trình nuôi cấy.
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 36
3.4.2.4. Làm sạch enzyme chitosanase
Dịch enzyme ựược tiến hành tủa phân ựoạn bằng muối amoni sunphate, kết tủa ựược hòa tan trong ựệm phosphate pH 7 và tiếp tục làm sạch bằng phương pháp sắc ký.
Sau khi khảo sát liên tiếp các phân ựoạn, 0 - 30%; 30 - 40%; 40 - 50%; ..; 80 - 90% bão hòa của muối amoni sunphate với dịch enzyme thô, chọn phân ựoạn 30 - 80% bão hòa ựể làm sạch sơ bộ enzyme.
Tiến hành kết tủa enzyme ở 4oC, muối amoni sunphate ựược thêm vào dung dịch ựến 30% bão hòa, ựể qua ựêm, ly tâm 6000 vòng/phút, bỏ cặn tủa. Sau ựó tiếp tục tủa enzyme bằng muối ở phân ựoạn 80% bão hòa. Chế phẩm enzyme thu bằng phương pháp này chứa nhiều muối vì vậy cần loại muối bằng cách phương pháp sắc kắ lọc gel, sử dụng gel sephadex- G25.
Quá trình lọc gel thực hiện với thông số như sau: Thể tắch bơm mẫu: 10ml
Tốc ựộ dòng chảy: 10ml /phút
Hệ dung môi: ựệm phosphate 0,05 M, pH = 7; rửa giải với gradient 0 ọ 0,05 M NaCl
Detector : UV, bước sóng 280 nm
Thu các pic và xác ựịnh pic có hoạt tắnh chitosanase cao và tiếp tục làm sạch bằng sắc ký trao ựổi ion.
Các thông số của quá trình sắc ký trao ựổi ion như sau: Cột: CMFF (GE Health care, Sweden)
Thể tắch bơm mẫu: 5ml Tốc ựộ dòng chảy: 2ml/phút
Hệ dung môi: ựệm phosphate 0,05 M, pH = 7; rửa giải với gradient 0 ọ 0,16 M NaCl
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 37
Tiếp tục thu nhận các pic thể hiện hoạt tắnh chitosanase cao, thực hiện ựiện di ựể kiểm tra ựộ sạch và thực hiện sắc ký trao ựổi ion lần thứ hai nếu thấy cần thiết.
3.4.2.5. Phương pháp ựiện di
Khảo sát thành phần protein - enzyme ngoại bào tổng số bằng phương pháp ựiện di SDS-PAGE 3 lớp (4, 10 và 16,5%) theo phương pháp của Schảgger và Von Jagow (1987) [16].
Kắch thước bản gel 8 x 8,5 cm. Mẫu ựược trộn với ựệm mẫu SDS, ủ tại 95ỨC trong 5 phút, ly tâm 7000 vòng/phút trong 5 phút, nhỏ 20ộl vào giếng. Gel ựược chạy bằng máy ựiện di Consort EV222 tại 100V trong 5 phút ựầu ựể tải mẫu vào gel, sau ựó chạy ở 150V trong 2h.
Gel ựược nhuộm bằng Coomassie (0.1% Coomassie Blue G250, 40% methanol, 10% acetic acid, 50% nước cất) qua ựêm và tẩy bằng dung dịch tẩy nhuộm (50% nước cất, 40% methanol, 10% acetic acid) cho ựến khi nền bản gel trắng sạch.
Bảng 3.3. Thành phần bản ựiện di theo phương pháp Schảgger và Von Jagow (1987) cho 2 bản gel
Hóa chất 16,5% 10% 4% Acrylamide (ml) 4,392 1,33 0,535 Gel buffer (ml) 2,669 1,33 0,969 Nước (ml) 1,34 2,996 Glyxerol 87% (ml) 0,944 APS (ộl) 26,64 15 31,25 TEMED (ộl) 2,669 1,5 3,125
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 38
3.4.3. Các phương pháp phân tắch
3.4.3.1. Xác ựịnh hoạt tắnh enzyme chitosanase
Hoạt tắnh enzyme chitosanase xác ựịnh qua sản phẩm tạo ra là hàm lượng ựường khử tạo ra sau phản ứng.
Nguyên tắc: Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các
oligosaccharide có chứa ựường khử D-glucosamine. Phương pháp acid dinitrosalicylic kiểm tra sự có mặt của nhóm (C = O) trong ựường khử, oxy hoá nhóm aldehyt trong ựường, ựồng thời 3,5-dinitrosalicylic bị khử tạo thành 3-amino,5-nitrosalicylic trong môi trường kiềm.
CHO- COO-
3,5 Ờ dinitrosalicylic acid 3-amino,5-nitrosalicylic acid Theo trình tự phản ứng, một phân tử ựường sẽ phản ứng với 1 phân tử DNS.
Nguyên liệu:
Tác nhân phản ứng DNS gồm:
Nước cất: 1416 ml; 3,5 Acid dinitrosalicylic C7H4N2O7: 10,6 g; NaOH: 19,8 g; Muối Seignette KNaC4H4O6.4H2O: 306 g; Phenol: 7,6 ml; Natri metabisulfit: 8,3 g.
Chuẩn bị mẫu và ựo ựộ hấp thụ quang học của các mẫu enzyme:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm, một ống thắ nghiệm, một ống ựối chứng. Lấy 1ml dịch enzyme cho vào mỗi ống, ở ống ựối chứng cho thêm 0,6ml dung dịch NaOH 10N ựể bất hoạt enzyme. Sau ựó, thêm vào mỗi ống 3ml dung dịch chitosan 0,2%. đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt ựộ 50oC/20phút. Sau ựó, nhỏ 0,6 ml NaOH 10N vào ống thắ nghiệm ựể dừng phản ứng. Ly tâm 2 ống, hút mỗi ống 2ml dịch trong, thêm vào mỗi ống 2ml DNS, ựặt trong bể ổn nhiệt 95oC/5-10 phút, ựể nguội ựến nhiệt ựộ phòng và ựo A540.
Lượng ựường khử tạo ra tắnh theo phương trình ựường chuẩn.
định nghĩa ựơn vị hoạt tắnh enzyme chitosanase: Một ựơn vị hoạt tắnh
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 39
giải phóng ra 1ộmol ựường khử trong thời gian 1 phút ở các ựiều kiện của phương pháp phân tắch.
3.4.3.2. Phương pháp xác ựịnh hàm lượng protein
Xác ựịnh hàm lượng protein trong dung dịch enzyme theo phương pháp Bradford [4].
3.4.4. Các phương pháp xác ựịnh tắnh chất của enzyme
3.4.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ và pH tới hoạt tắnh của enzyme
Hoạt tắnh enzyme cũng ựược ựo trong môi trường phản ứng có pH khác nhau (pH 3,6 - 8,5) sử dụng các ựệm acetate (pH 3,6 - 5,6), ựệm phosphate (pH 5,7 - 8,0), ựệm Tris ( pH 7,2 - 9), nhiệt ựộ phản ứng 50oC. Từ ựó xác ựịnh ựược pH thắch hợp cho enzyme hoạt ựộng.
Enzyme chitosanase ựược xác ựịnh hoạt tắnh tại các nhiệt ựộ khác nhau (30 -90 oC) ở pH tối ưu ựã xác ựịnh dưới các ựiều kiện xác ựịnh hoạt tắnh enzyme. Từ ựó xác ựịnh ựược nhiệt ựộ thắch hợp cho enzyme hoạt ựộng.
3.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ và pH tới tắnh ổn ựịnh của enzyme
Chitosanase trước khi tiến hành phản ứng với cơ chất sẽ ựược ủ tại các ựiều kiện về nhiệt ựộ hay pH khác nhau trong 1h (30 - 90 oC và pH 3,6 - 8,5), sau ựó tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh enzyme theo các bước ựã xác ựịnh.
3.4.4.3. Ảnh hưởng của một số ion kim loại tới hoạt tắnh của enzyme
Trước khi tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh của enzyme, ủ enzyme với các muối chứa ion kim loại với nồng ựộ 1mM, và 10 mM trong 1h, sau ựó tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh của enzyme.
Các muối chứa: Cu2+,Mg2+, Al3+, Fe2+, Fe2+, Zn2+. Pb2+, K+, Ca2+
3.4.5. Phương pháp xử lý số liệu
- Sử dụng phần mềm Nemrodw giải bài toán mô hình thực nghiệm - Sử dụng phần mềm Excel, Irristat
Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ. 40
PHẦN BỐN: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác ựịnh ựiều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis ựể sinh tổng hợp cao chitosanase tổng hợp cao chitosanase
4.1.1. Kết quả thực nghiệm thăm dò ựơn yếu tố
Thực hiện theo phương pháp ựã nêu phần 3.4.1. Xác ựịnh sự ảnh hưởng của các ựơn yếu tố, kết quả ựược thể hiện trên ựồ thị 4.1; 4.2; 4.3
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 4.5 5 6 7 8 8.5 pH h o ạ t tắ n h c h ito s a n a s e ( U /m l)
đồ thị 4.1. Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1
0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 25 30 37 45 50 nhiệt ựộ h o ạ t tắ n h c h ito s a n s e ( U /m l)
đồ thị 4.2. Ảnh hưởng của nhiệt ựộ tới quá trình sinh tổng hợp