Luận văn thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn streptomyces griceus (NN2) và ứng dụng để sản xuất đường chitosanoligosaccha

Luận văn thu nhận enzyme chitosanase từ chủng xạ khuẩn streptomyces griceus (NN2) và ứng dụng để sản xuất đường chitosanoligosaccha

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI -------  ------- NGUYỄN THỊ THẮM THU NHẬN ENZYME CHITOSANASE TỪ CHỦNG XẠ KHUẨN STREPTOMYCES GRICEUS (NN2) VÀ ỨNG DỤNG ðỂ SẢN XUẤT ðƯỜNG CHITOSANOLIGOSACCHARIDE (COS) CHỨC NĂNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Mã số : 60.54.10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGÔ XUÂN MẠNH HÀ NỘI - 2010 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong khoá luận này là trung thực và chưa hề được sử dụng. Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện khoá luận này đã được cảm ơn và các thông tin được trích dẫn trong khoá luận này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thắm Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, bên cạnh sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự động viên và giúp đỡ rất lớn của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh, Trưởng khoa - Khoa công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô trong Khoa Công nghệ thực phẩm và Viện đào tạo sau đại học trường đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạo mọi điều kiện cho tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Mặc dù đã hết sức cố gắng, nhưng khoá luận của tôi không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế. Vì vậy tôi kính mong nhận được sự góp ý, chỉ bảo của thầy cô để giúp tôi có thể phát huy kiến thức một cách hiệu quả sau khi ra trường. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và tất cả bạn bè đã động viên giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn này. Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2010 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thắm Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC ĐỒ THỊ viii DANH MỤC SƠ ĐỒ ix DANH MỤC HÌNH ix 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Chitosan 4 2.2. Enzyme chitosanase 5 2.2.1. Khối lượng phân tử 5 2.2.2. Khái niệm về enzyme chitosanase 5 2.2.3. Phân loại 6 2.2.4. Nguồn nguyên liệu để thu nhận enzyme chitosanase 7 2.2.5. Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 9 2.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme chitosanase từ vi sinh vật 11 2.2.7. Các phương pháp thu nhận và tinh sạch enzym chitosan 17 2.3. Hiệu quả của đường oligosaccharide chức năng 21 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . iv 2.4. Chitosan oligosaccharide 23 2.4.1. Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide (COS) 23 2.4.2. Tính năng của chitosan oligosaccharide ( COS ) 24 2.4.3. Ứng dụng chitosan và COS trong đời sống 28 2.5. Những hướng sản xuất COS trong công nghiệp 33 2.5.1. Phương pháp hoá học 33 2.5.2. Phương pháp enzyme 34 2.6. Xạ khuẩn Streptomyces griseus (chủng NN2) 35 2.6.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 35 2.6.2. Khuẩn ti của xạ khuẩn 35 2.6.3. Khuẩn lạc của xạ khuẩn 36 2.5.4. Đặc điểm sinh lí, hóa sinh 36 2.7. Tình hình nghiên cứu, sản xuất enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide (COS) 36 2.7.1. Trên thế giới 36 2.7.2. Tại Việt Nam 40 3. ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 3.1. Đối tượng nghiên cứu 42 3.2. Nội dung nghiên cứu 42 3.2.1.Thu nhận enzyme chitosanase 42 3.2.2. Thu nhận chitosanoligosaccharide (COS) 42 3.3. Phương pháp nghiên cứu 43 3.3.1. Phương pháp vi sinh 43 3.3.2. Phương pháp hóa sinh 43 3.3.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 48 3.3.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả 51 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . v 3.3.5. Xây dựng quy trình thu nhận enzyme chitosanase và đường chitosanoligosaccharide (COS) 54 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56 4.1. Kết quả hoạt hóa và định tính khả năng sinh enzyme chitosanase của xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) 57 4.2. Thu nhận enzyme chitosanase 59 4.2.1. Chọn lựa các điều kiện môi trường nuôi cấy tối ưu xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) để sinh tổng hợp chitosanase 59 4.2.2. Thu nhận enzyme thô 65 4.3. Xác định điều kiện tối ưu thu nhận chitosan oligosaccharide (COS) 71 4.3.1. Xác định ảnh hưởng của đơn yếu tố đến sự hình thành đường COS 71 4.3.2. Xác định các điều kiện ảnh hưởng đến sự hình thành đường COS theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm 77 4.4. Quy trình sản xuất chitosan oligosaccharide sử dụng enzyme chitosanase 83 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 86 5.1. Kết luận 86 5.2. Đề nghị 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC 96 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên ñầy ñủ COS Chitosan oligosaccharide DA Degree of deacetylation DP Degree of polymerization DNS Acid dinitro salisilic E/S Tỷ lệ enzyme/ cơ chất GlcN D- Glucosamine GlcNAc N- acetyl-D- Glucosamine Pro Protein XOS Xylose oligosaccharide Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 5 2.2 Phân loại chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu 7 2.3 Kiểu phân cắt của các loại chitosanase 9 2.4 Điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh vật sản sinh chitosanase 16 2.5 Phân tích thành phần cấu tạo của chitosan oligosaccharide bằng phương pháp HPLC 24 2.6 Sơ lược kết quả nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới 37 4.1 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố và kết quả 60 4.2 Hệ số trong phương trình hồi qui và mức ý nghĩa 60 4.3 Hoạt tính enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc 66 4.4 So sánh hoạt tính chitosanase tủa bằng muối ammoni sunfate trên phân đoạn 50 - 70% 69 4.5 Ma trận qui hoạch thực nghiệm theo phương pháp qui hoạch trực giao bậc 2, ba yếu tố và kết quả 78 4.6 Hệ số trong phương trình hồi qui và mức ý nghĩa 79 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . viii DANH MỤC ðỒ THỊ STT Tên đồ thị Trang 2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase của Gongronella sp. JG 11 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới khả năng sinh tổng hợp chitosanase của Aspergillus sp. CJ 22-326 13 2.3 Hoạt tính chitosanase từ Streptomyces griseus HUT 6037 khi nuôi cấy trong môi trường chitosan với mức độ deacetyl hóa khác nhau 14 4.1 (a) Đồ thị biểu diễn mối quan hệ của X 1 (nhiệt độ, 0 C), X2 (pH) và X3 (nồng độ rỉ đường, %) là tâm 62 4.1 (b) Đồ thị biểu diễn mối quan hệ của X 1 (nhiệt độ, 0 C), X3 (nồng độ rỉ đường, %) và X2 (pH) là tâm 63 4.1 (c) Đồ thị biểu diễn mối quan hệ của X 2 (pH), X 3 (nồng độ rỉ đường, %) và X 1 (nhiệt độ, 0 C) là tâm 64 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol và nồng độ muối amoni sunfate tới hoạt tính riêng của chitosanase 67 4.3 Ảnh hưởng pH đến sự hình thành đường COS 72 4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hình thành đường COS 74 4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) đến sự hình thành đường COS 75 4.6 Ảnh hưởng thời gian đến sự hình thành đường COS 76 4.7 (a) Đồ thị biểu diễn mối quan hệ của X 2 (nhiệt độ), X 3 (Tỷ lệ enzyme/cơ chất) và X 1 (pH) là tâm 80 4.7 (b) Đồ thị biểu diễn mối quan hệ của X 1 (pH), X 3 (Tỷ lệ enzyme/cơ chất) và X 2 (nhiệt độ) là tâm 81 4.7 (c) Đồ thị biểu diễn mối quan hệ của X 1 (pH), X 2 (nhiệt độ) và X 3 ( tỷ lệ enzyme/cơ chất) là tâm 82 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp . ix DANH MỤC SƠ ðỒ STT Tên sơ đồ Trang 4.1 Quy trình nuôi cấy Streptomyces griseus (chủng NN2) để sinh tổng hợp chitosanase 70 4.2 Quy trình thu nhận COS từ chitosan sử dụng enzyme chitosanase 84 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Cấu trúc hoá học của chitosan 4 2.2 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase 10 2.3 Cấu trúc hoá học của chitosan oligosaccharide 23 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc xạ khuẩn NN2 57 4.2 Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu NN2 (phương pháp cấy chấm điểm) 58 4.3 Vòng phân giải cơ chất của chitosanase sản sinh từ mẫu NN2 (phương pháp đục lỗ thạch) 58 4.4 Đặc điểm hình thái tế bào xạ khuẩn NN2 59 . 1.2.1. Mục ñích Thu nhận enzyme chitosanase có hoạt tính cao từ xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) và ứng dụng để thu nhận đường chitosanoligosaccharide. chitosanase từ chủng xạ khuẩn Streptomyces griceus (NN2) và ứng dụng ñể sản xuất ñường chitosanoligosaccharide (COS) chức năng”. 1.2. Mục ñích và yêu cầu 1.2.1.