để tách và tinh chế enzyme thường trải qua các công ựoạn:
- Chiết rút chế phẩm enzyme thô: Ở ựây ta xét việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường lỏng và sau quá trình nuôi cấy ta có dịch nuôi cấy gồm 2 pha riêng biệt: pha rắn - sinh khối tế bào và các tạp chất rắn; pha lỏng Ờ các chất tan của môi trường, sản phẩm của quá trình trao ựổi chất của vi sinh vật. đối với ựề tài này, chúng ta ựang tiến hành thu hồi chitosanase ngoại bào, vì vậy công ựoạn ựầu tiên là loại sinh khối tế bào. Các phương pháp sử dụng phổ biến là lọc và ly tâm, dịch lỏng ựược thu lại và ựem ựi tinh sạch.
- Tinh sạch enzyme: Quá trình tinh sạch enzyme chắnh là quá trình loại bỏ ựi các thành phần không phải enzyme mục tiêu có trong dịch lỏng, nó thường bao gồm các chất hòa tan và các protein tạp chất, việc loại bỏ chúng dựa trên sự khác nhau giữa enzyme mục tiêu và các thành phần khác về kắch thước, hình dạng phân tử, khả năng hòa tan trong các dung môi, ựiện tắchẦ Các phương pháp thường dùng như: tủa muối, tủa cồn, phương pháp sắc kắ trao ựổi ion, phương pháp sắc kắ lọc gel, phương pháp sắc kắ ái lựcẦ thường thì một phương pháp duy nhất không thể thu ựược enzyme tinh khiết mà phải áp dụng kết hợp nhiều phương pháp theo một trật tự nào ựó ựể cho kết quả tốt nhất [2].
đối tượng nghiên cứu là enzyme, ựây là những chất xúc tác sinh học có bản chất protein và rất không ổn ựịnh, chúng rất không bền và dễ dàng biến tắnh. Do ựó khi làm việc với enzyme ta cần chú ý tránh những ựiều kiện làm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 18
mất hoạt ựộ của nó như: các yếu tố acid mạnh, kiềm mạnh, nhiệt ựộ cao, các kim loại nặng như: chì, ựồng, thủy ngânẦ đặc biệt khi thực hiện tinh sạch enzyme phải tiến hành ở nhiệt ựộ thấp, thực hiện thắ nghiệm nhanh, liên tục, không ngắt quãng.
2.2.7.1. Phương pháp ly tâm
Ly tâm là phương pháp tách nhanh chóng các phần tử có khối lượng riêng khác nhau dưới tác dụng của lực ly tâm. đây là cách ựể loại sinh khối tế bào một cách hiệu quả. Tốc ựộ ly tâm và thời gian ly tâm phụ thuộc vào tắnh chất của dịch ly tâm. Sự sai khác về tỷ trọng của các phần tử lơ lửng so với chất lỏng càng lớn thì tốc ựộ kết tủa sẽ càng cao, thời gian ly tâm dài và tốc ựộ ly tâm lớn thì hiệu quả phân tách càng cao. Các chế ựộ ly tâm thường dùng là từ 6000 ựến 10000 vòng/phút trong thời gian 20 phút và ly tâm lạnh.
Ly tâm cũng là phương pháp cơ bản ựể tách kết tủa, huyền phù sau các quá trình tủa muối, tủa cồn. Ngoài ra cũng có thể thực hiện ly tâm siêu tốc trong một thời gian ựủ dài ựể thu ựược từng phân lớp các phần tử có tỷ trọng khác nhau. Phương pháp ly tâm là phương pháp ựược dùng trong suốt quá trình thu nhận chitosanase và thu nhận ựường COS vì phương pháp cũng ựơn giản mà mang lại hiệu quả phân tách cao.
2.2.7.2. Phương pháp sắc ký
Sắc ký là phương pháp quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thắch hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể sử dụng ngay cho việc ựịnh lượng và ựịnh danh. Nhưng chi phắ cho phương pháp này cũng khá ựắt nên trên phạm vi quy mô phòng thắ nghiệm thì thường chưa ựược sử dụng phổ biến.
Trong tinh sạch enzyme có 4 phương pháp ựược sử dụng nhiều nhất như sau:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 19
Sắc ký lọc gel
Phương pháp này dựa vào mức ựộ dịch chuyển khác nhau của các phân tử có kắch thước khác nhau trong hệ thống mạng lưới phân tử của gel sắc ký. Gel thường sử dụng là sephadex, sepharose (sephadex G-10, G-15, G-25, G-50 hay sepharose 4B, 6BẦ). Các phân tử mẫu ựi qua hệ thống các hạt gel, nếu có kắch thước nhỏ hơn kắch thước của lỗ gel sẽ chui vào trong các hạt gel và do ựó thời gian ựi qua cột gel sẽ lâu hơn các phân thử có kắch thước lớn chỉ chui qua khoảng trống giữa các hạt gel. Vì vậy, nếu ta chọn các gel có kắch thước lỗ gel khác nhau có thể tách hỗn hợp của protein với các chất hòa tan như muối, và hỗn hợp của các protein có kắch thước phân tử khác nhau.
đối với tinh sạch chitosanase do kắch thước phân tử thường nằm khoảng 30 Ờ 90 kD nên gel thường dùng là Sephadex G-75 và Sephadex G-100 [17], [19]. Sắc ký trao ựổi ion
Phương pháp này dựa vào ựiện tắch thực của protein tại một ựiểm pH nhất ựịnh ựể phân tách hỗn hợp protein. Pha tĩnh là những hạt mang sẵn một ựiện tắch nhất ựịnh, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử protein mang ựiện tắch trái dấu với chúng, do vậy những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại. để phóng thắch những protein này, ta tăng nồng ựộ ion của pha ựộng, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang ựiện tắch, dung dịch thường sử dụng là natri hoặc kali clorua. Pha tĩnh thường ựược dùng khi tinh sạch chitosanse là: CM- Sephadex C-25, CM- Sepharose CL-6B, CM Ờ Sepharose FF, Q- Sepharose FFẦ [17], [19], [29], [38], [52].
Sắc ký ái lực
Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của protein với những nhóm hóa học chuyên biệt như liên kết giữa enzyme và cơ chất, enzyme và cofactor, hay enzyme và các chất ức chế cạnh tranhẦ, những chất có ái lực ựặc biệt với enzyme sẽ ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 20
gắn với gel. Khi cho hỗn hợp protein chứa enzyme quan tâm ựi qua cột sắc kắ ái lực, enzyme và những chất có ái lực ựặc biệt trên gel sẽ ựược giữ lại, còn chất khác sẽ ựi qua. Enzyme sau ựó ựược tách ra bằng cách thay ựổi nồng ựộ muối, pH môi trường hay dùng một chất cạnh tranh ựặc hiệu enzyme.
Sắc ký lỏng cao áp
Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột. Cột ựược làm từ vật liệu mịn hơn nên có nhiều vị trắ tương tác, tuy vậy cần một áp lực tác ựộng lên cột ựể ựạt ựược tốc ựộ chảy thắch hợp. Kết quả sắc ký cho ựộ phân giải cao và phân tách nhanh.
2.2.7.3. Phương pháp tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (ethanol) và bằng muối
Dung môi hữu cơ thường dung là ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu. Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, cần tiến hành ở nhiệt ựộ thấp (từ 50C trở xuống). Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân ựoạn dưới 00C, như vậy có tác dụng tốt ựến ựộ ổn ựịnh của protein enzyme.
Khi ựã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh. Phương pháp tủa enzyme bằng ethanol cho hiệu quả nhanh, dễ làm và khả năng phân tách enzyme tốt phù hợp với quy mô phòng thắ nghiệm.
Có thể dùng muối trung tắnh hoặc các dung môi hữu cơ ựể tách chiết các protein - enzyme. Cơ sở của phương pháp này là ựộ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tắch ựiện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác ựó (còn gọi là sự hydrate hóa) bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch protein các dung môi hữu cơ hoặc các muối trung tắnh.
Các muối trung tắnh có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4... Tuy nhiên, người ta ựã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 21
mà làm ổn ựịnh (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme. đối với chitosanase thì phương pháp tủa muối là phương pháp thường ựược áp dụng phố biến trong quá trình làm sạch enzyme và phù hợp với quy mô phòng thắ nghiệm [19], [29], [31], [38].
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});