3. đỐI TƯỢNG Ờ NỘI DUNG Ờ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phương pháp bố trắ thắ nghiệm
3.3.3.1. Bố trắ thắ nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm xác ựịnh ựiều kiện nuôi cấy tối ưu xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2)
Thắ nghiệm số Nhiệt ựộ (0C) pH Nồng ựộ rỉ ựường (%) 1 45 6 3 2 29 6 3 3 41 7 3 4 33 5 3 5 41 5 3 6 33 7 3 7 41 6 4 8 33 6 2 9 41 6 2 10 37 7 2 11 33 6 4 12 37 5 4 13 37 6 3
Mỗi thắ nghiệm ựược nhắc lại 3 lần.
Nuôi cấy xạ khuẩn ở các ựiều kiện trên, sau ựó xác ựịnh hoạt tắnh enzyme chitosanase. Xử lý số liệu bằng phần mềm Nemrodw tìm ựược phương trình quy hoạch thực nghiệm.
- Cách tiến hành: Nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) ở các công thức trên ở chế ựộ lắc 200 vòng/phút trong 3 ngày. Sau ựó tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh của dịch enzyme thu ựược theo phương pháp quang phổ có sử dụng acid dinitrosalicylic.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 49
3.3.3.2. Bố trắ thắ nghiệm xác ựịnh tác ựộng của các ựơn yếu tố ảnh hưởng sự hình thành ựường COS
Ảnh hưởng của ựiều kiện pH ựến sự hình thành COS Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau.
- Nồng ựộ cơ chất (chitosan 2%) (V = 5ml) - Tỷ lệ E/S: 0.04 (Venzyme = 0,2ml)
- Nhiệt ựộ: 500C
- pH thay ựổi 4,5 ựến 7 - Thời gian phản ứng: 10 giờ
Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sự hình thành COS Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau:
- pH: Sử dụng pH ựã ựược xác ựịnh
- Nồng ựộ cơ chất (chitosan 2%) (V = 5ml)
- Tỷ lệ E/S: 0,04 (Venzyme = 0,2ml); nhiệt ựộ thay ựổi từ 450C ựến 650C - Thời gian phản ứng: 10 giờ
Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) ựến sự hình thành COS Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau:
- Nồng ựộ cơ chất (chitosan 2%) (V = 5ml)
- Tỷ lệ E/S thay ựổi từ 0,02 ựến 0,14 (Venzyme = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8ml)
- pH: Sử dụng pH ựã ựược xác ựịnh
- Nhiệt ựộ: Sử dụng nhiệt ựộ ựã ựược xác ựịnh - Thời gian phản ứng: 10 giờ
Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ựến sự hình thành COS Thắ nghiệm ựược tiến hành như sau:
- Nồng ựộ cơ chất (chitosan 2%) (V = 5ml) - pH: Sử dụng pH ựã ựược xác ựịnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 50
- Nhiệt ựộ: Sử dụng nhiệt ựộ ựã ựược xác ựịnh
- Tỷ lệ E/S: Sử dụng tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) ựã ựược xác ựịnh - Thời gian phản ứng: 8h, 9h, 10h, 11h, 12h
Sau mỗi phản ứng cho thuốc thử DNS vào và ựun sôi trong 5 phút. Sau ựó cho 1ml dung dịch K-Na tartrat 40% vào ựể ổn ựịnh màu, làm lạnh tới nhiệt ựộ phòng, ly tâm loại bỏ cặn tủa và ựi ựo ựộ hấp thụ quang ở bước sóng 575nm.
3.3.3.3. Bố trắ thắ nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm nhằm xác ựịnh ựiều kiện tối ưu ựể thu nhận ựường chitosanoligosaccharide (COS)
Thắ nghiệm số pH Nhiệt ựộ Tỷ lệ enzyme/cơ chất 1 7.5 60.0 0.12 2 5.5 60.0 0.12 3 7.0 70.0 0.12 4 6.0 50.0 0.12 5 7.0 50.0 0.12 6 6.0 70.0 0.12 7 7.0 63.3 0.16 8 6.0 56.7 0.08 9 7.0 56.7 0.08 10 6.5 66.7 0.08 11 6.0 63.3 0.16 12 6.5 53.3 0.16 13 6.5 60.0 0.12
Mỗi công thức lặp lại 3 lần. Sau ựó sử dụng phần mềm Nemrodw tìm ựược phương trình quy hoạch thực nghiệm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 51
- Cách tiến hành:
Sau khi thu ựược enzyme chitosanase kỹ thuật ta cho phản ứng với chitosan ở những ựiều kiện như bố trắ thắ nghiệm ở trên. Sau ựó tiến hành xác ựịnh hàm lượng ựường thu ựược theo phương pháp quang phổ, có sử dụng acid dinitrosalicylic.