3. đỐI TƯỢNG Ờ NỘI DUNG Ờ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.4. Phương pháp thống kê và xử lý kết quả
3.3.4.1. Chọn lựa những ựiều kiện nuôi cấy tối ưu xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) ựể sinh tổng hợp enzyme chitosanase có hoạt tắnh cao bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
điều kiện nuôi cấy là sự tổng hoà của các yếu tố như thành phần môi trường, pH môi trường, nhiệt ựộ, thời gian nuôi cấyẦ Từng ựiều kiện nuôi cấy riêng rẽ ựều có ảnh hưởng ựến hoạt ựộng sống của xạ khuẩn. Tìm ựược giá trị tối ưu của từng yếu tố riêng rẽ nhưng chưa chắc sự kết hợp của từng yếu tố riêng rẽ ựó ựã là tìm ựược ựiều kiện tốt nhất cho xạ khuẩn sinh trưởng và phát triển, vì giữa các yếu tố riêng rẽ ựó lại có sự tác ựộng tương tác lẫn nhau. Chắnh vì vậy, chúng tôi tiến hành chọn lựa ựiều kiện tổng hợp của các yếu tố nuôi cấy cho xạ khuẩn. Căn cứ vào các tài liệu ựã công bố về khoảng nhiệt ựộ, pH, môi trường thay thế cho sự phát triển của xạ khuẩn, chúng tôi tiến hành tìm ựiều kiện nuôi cấy tối ưu trên ba yếu tố theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm:
- Nồng ựộ rỉ ựường (khoảng khảo sát: 2% - 4%, mức tâm: 3%, bước nhảy: 1%).
- pH môi trường (khoảng khảo sát: 5.0 Ờ 7.0, mức tâm: 6.0, bước nhảy: 1.0). - Nhiệt ựộ nuôi cấy (khoảng khảo sát: 29 Ờ 450C, mức tâm: 370C, bước nhảy: 40C).
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ựã sử dụng ma trận Doehlert. Ma trận này cho phép tìm ựược vùng tối ưu trong khoảng giới hạn ựiểm chọn. Ma
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 52
trận cho phép phân chia rất cân ựối các ựiểm thắ nghiệm trong giới hạn theo bất kỳ hướng nào. Dựa vào ma trận, ta có thể thêm các biến số khác nữa mà không làm mất ựi tắnh ựúng ựắn của ma trận.
Trong ma trận này, số lần thắ nghiệm là N và các biến số K ựược xác ựịnh như sau: N = K2 + K + 1
Trong trường hợp K = 3 tức là ảnh hưởng của 3 yếu tố thì số ựiểm thắ nghiệm cần thực hiện là N = 13
Sau ựó xử lý bằng phần mềm Nemrodw tìm ựược phương trình thực nghiệm (ảnh hưởng của 3 yếu tố).
Phương trình có dạng: Y = b0 + b1*X1 + b2*X2 + b3*X3 + b11* (X1*X1) + b22* (X2*X2) + b33* (X3*X3) + b12* (X1*X2) + b13* (X1* X3) + b23* (X2*X3) Trong ựó: b0 là hệ tự do. bi (i = 1, 2, 3) là hệ số tuyến tắnh bij (j = 1, 2, 3) là hệ số tương tác cặp
Từ kết quả ta xác ựịnh phương trình thực nghiệm của các ựiều kiện tối ưu nuôi cấy xạ khuẩn sinh tổng hợp enzyme chitosanase và cặp nghiệm tối ưu. Sau khi chọn ựược ựiều kiện nuôi cấy tốt nhất, thực hiện nuôi cấy với thể tắch 1000ml.
3.3.4.2. Xác ựịnh ựiều kiện tối ưu ựể thu nhận chitosanoligosacchatide theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm
điều kiện thu nhận COS là tổng hợp của các yếu tố: pH, nhiệt ựộ, tỷ lệ enzyme/cơ chất (E:S)Ầ Mỗi một yếu tố có ảnh hưởng riêng rẽ ựến khả năng tạo ra COS của chủng xạ khuẩn. Dựa trên kết quả nghiên cứu thực nghiệm ở trên ta có khoảng nhiệt ựộ, pH, tỷ lệ enzyme/cơ chất (E:S), chúng tôi tiến hành tìm ựiều kiện tối ưu ựể thu nhận chitosanoligosaccharide (COS) theo
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 53
phương pháp quy hoạch thực nghiệm gồm ba yếu tố sau: - pH môi trường (khoảng khảo sát 5.5 - 7.5)
- Nhiệt ựộ môi trường: (khoảng khảo sát 50 Ờ 700C) - Tỷ lệ enzyme/cơ chất: (khoảng khảo sát: 0.08 - 0.16)
Tiến hành lựa chọn ựiều kiện kiện tối ưu ựể thu nhận chitosanoligosaccharide (COS) của xạ khuẩn theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm, mỗi thắ nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần.
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm ựã sử dụng ma trận Doehlert. Tất cả các ựiểm ựã chọn ựược xác ựịnh theo phương trình hồi quy có dạng sau: Y = b0 + b1*X1 + b2*X2 + b3*X3 + b11* (X1*X1) + b22* (X2*X2)+ b33* (X3*X3) + b12* (X1*X2) + b13* (X1* X3) + b23* (X2*X3) Trong ựó: b0 là hệ số tự do bi (i =1,2,3) là hệ số tuyến tắnh bij (j = 1,2,3) là hệ số tương tác cặp
Quá trình tắnh toán và kết quả ựược xử lý bằng phần mềm Nemrodw tìm ựược phương trình thực nghiệm (ảnh hưởng tổng hợp của 3 yếu tố).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 54