3. đỐI TƯỢNG Ờ NỘI DUNG Ờ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.2. Phương pháp hóa sinh
3.3.2.1. định tắnh khả năng sinh enzyme chitosanase theo phương pháp cấy chấm ựiểm
- Thử hoạt tắnh của giống xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase.
- Sử dụng môi trường thử hoạt tắnh: Cấy chấm ựiểm trên môi trường thử hoạt tắnh ựể thử hoạt tắnh sơ bộ. Sau thời gian nuôi cấy 1 ngày, xác ựịnh các mẫu có hoạt tắnh bằng cách ựổ một lớp mỏng dung dịch Lugol lên bề mặt ựĩa thạch và ựo ựường kắnh vòng phân giải. Vì enzyme chitosanase là enzyme ựặc hiệu với cơ chất chitosan nên những vi sinh vật có khả năng sinh chitosanase ngoại bào sẽ tiết enzyme ra ngoài môi trường ựể phân giải cơ chất chitosan tạo nên vòng phân giải trên môi trường. Enzyme có hoạt tắnh càng cao thì vòng phân giải càng to, rộng và sáng. Vì vậy ta lựa chọn ựược mẫu giống có hoạt
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 44
tắnh chitosanase cao sẽ ựược nghiên cứu tiếp ở ựiều kiện nuôi cấy thắch hợp.
3.3.2.2. Xác ựịnh ựường kắnh vòng phân giải của enzyme (theo phương pháp ựục lỗ thạch)
- Sau khi dừng nuôi cấy, tiến hành ly tâm ựể loại bỏ kết tủa, thu dịch nuôi cấy. Dịch enzyme thu ựược sẽ ựược ựem ựi phân tắch hoạt tắnh enzyme ựể tiếp tục tuyển chọn ra mẫu giống có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tắnh cao.
- đổ môi trường agar Ờ chitosan ra các ựĩa petri, ựể nguội. Dùng dụng cụ ựục lỗ môi trường có ựường kắnh 1cm, ựục các lỗ trên ựĩa thạch (3 lỗ/ựĩa). Hút 50ộl dịch nổi enzyme cho vào mỗi lỗ thạch, ựể 2h trong tủ lạnh, sau ựó ựem ủ ở 370C, 24h sau quan sát, ựo ựường kắnh vòng phân giải của các mẫu, chọn lọc mẫu có hoạt tắnh tốt ựể nghiên cứu tiếp.
3.3.2.3. Xác ựịnh hoạt tắnh enzyme chitosanase bằng phương pháp quang phổ, sử dụng acid dinitrosalicylic (DNS) [26], [45].
Nguyên tắc:
Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các oligosaccharide có ựầu chứa ựường khử D-glucosamine. Phương pháp acid dinitrosalicylic xác ựịnh sự có mặt của nhóm (C = O) trong ựường khử, oxy hoá nhóm aldehyde trong ựường, ựồng thời 3,5 - dinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3 - amino, 5 - nitrosalicylic acid trong môi trường kiềm.
CHO- oxh nhóm COO-
3,5 - dinitrosalicylic acid 3 - amino, 5 - nitrosalicylic acid. Sulfite ựược bổ sung vào phản ứng ựể hấp thụ oxi hoà tan trong môi trường vì oxi hoà tan không cần cho phản ứng màu.
Theo trình tự phản ứng, một phân tử ựường sẽ phản ứng với 1 phân tử DNS.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 45
định nghĩa ựơn vị hoạt tắnh enzyme chitosanase
- Một ựơn vị hoạt tắnh enzyme chitosanase là lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng thuỷ phân ựể giải phóng ra 1ộmol ựường khử trong thời gian 1 phút ở các ựiều kiện của phương pháp phân tắch.
Công thức tắnh hoạt tắnh chitosanase
Hoạt tắnh chitosanase U/ml = X*3*103/(30*180*1)
X: Nồng ựộ glucosamine tắnh theo ựường chuẩn (mg/ml) 3: Tổng thể tắch dịch sau phản ứng
(1ml enzyme + 2ml dung dịch chitosan) 30: Thời gian phản ứng (phút)
180: Khối lượng phân tử glucosamine 1: Thể tắch ezyme trong phản ứng
3.3.2.4. Xác hàm lượng ựường khử COS bằng phương pháp quang phổ, sử dụng acid dinitrosalicylic (DNS) [26],[45].
Dung dịch chitosan sau khi phản ứng ựược bổ sung dung dịch DNS theo tỷ lệ 1:1 ựể phản ứng ở 1000C trong 5 phút, làm nguội nhanh, ly tâm loại bỏ cặn và ựo ựộ hấp thụ quang A tại bước sóng 575nm. Dựa và ựồ thị ựường chuẩn ta tắnh ựược hàm lượng ựường khử RS.
3.3.2.5. Xác ựịnh hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford [4]
Nguyên tắc:
Dựa vào sự thay ựổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein trong dung dịch acid. Dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 có màu da cam ựỏ. Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ với các protein tương tác với nhóm kị nước và các nhóm mang ựiện tắch dương trên phân tử protein. Trong môi trường của các gốc mang ựiện tắch dương, sự proton hoá không xảy ra và có màu xanh xuất hiện.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 46
Tắnh hàm lượng protein của mẫu thắ nghiệm theo ựường chuẩn
Hàm lượng protein = ( A595 Ờ 0,0226 )/0,0012 (ộg/ml)
3.3.2.6. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô
Nuôi cấy chủng Streptomyces griceus (NN2) trong môi trường hoạt hóa ở các thời ựiểm nhiệt ựộ và pH khác nhau. Tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc ựộ 6000 vòng/phút ở 40C. Enzyme chitosanase là enzyme ngoại bào nên loại bỏ kết tủa và thu lấy dịch trong.
Xác ựịnh hoạt tắnh enzyme và hàm lượng protein trong dịch trong Cô ựặc dung dịch enzyme thô
- Dung dịch enzyme thô chứa nồng ựộ protein rất thấp, do vậy ựể ựạt hiệu quả thu hồi cao ta có thể cô ựặc dịch thô enzyme trước khi tiến hành kết tủa bằng cồn hay muối. Dịch enzyme thô thu ựược chia ựều vào các bình thuỷ tinh rồi ựể hóa ựá qua ựêm. Sau ựó tiến hành cô ựặc dịch bằng phương pháp sấy thăng hoa. Phương pháp này không ảnh hưởng ựến hoạt tắnh enzyme do ựược thực hiện ở nhiệt ựộ thấp.
- Xác ựịnh hoạt tắnh và hàm lượng protein trong dung dịch enzyme sau khi ựã sấy ựông khô
3.3.2.7. Phương pháp thu nhận enzyme kỹ thuật
Tách tủa phân ựoạn protein bằng ethanol
- Tủa phân ựoạn bằng cồn ethylic lạnh. Cồn làm mất vỏ hydrat bao quanh các phân tử protein, làm cho các phân tử protein ựông tụ lại với nhau dưới dạng tủa. Làm lạnh cồn tuyệt ựối, làm lạnh dung dịch enzyme cần tủa.
- Tiến hành: Lấy 1 lượng dung dịch enzyme cần xác ựịnh ựã làm lạnh cho vào cốc thuỷ tinh, cho từ từ 1 lượng cồn xác ựịnh ựã làm lạnh vào dung dịch enzyme này, khuấy ựều, lại làm lạnh 15 - 30 phút. Sau ựó, ly tâm lạnh ở tốc ựộ 6000 vòng/phút trong 15phút, thu cặn tủa. đánh dấu phân ựoạn tủa 0 - 30%. Cặn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 47
thu ựược hoà tan trong ựệm phosphate pH 6,0 ta ựược dịch enzyme phân ựoạn 0 - 30%. Còn dịch trong thu ựược tiếp tục cho thêm cồn ựã làm lạnh ựể ựạt 40% cồn. Tiến hành tương tự như trên cho ựến phân ựoạn 80 - 90%. Các tiểu phần thu ựược tiến hành xác ựịnh riêng hoạt tắnh enzyme và hàm lượng protein. Qua kết quả trên ta sẽ xác ựịnh ựược hoạt tắnh enzyme cao nhất ở phân ựoạn nào.
Tách tủa phân ựoạn protein bằng muối amoni sulfate
- Bổ sung thêm amoni sulfate ở các phân ựoạn khác nhau vào dịch enzyme sau khi cô ựặc.
- Khối lượng amoni sulfate ựược tắnh theo công thức sau: M = a.V/ 1000
Trong ựó : V là thể tắch enzyme ựem kết tủa
a: giá trị tra bảng khối lượng ựược trình bày như ở phần phụ lục Thời gian kết tủa 30 phút, trên máy khuấy từ ở 00C. Chú ý trong quá trình cho muối vào phải cho từ từ tránh hiện tượng biến tắnh protein cục bộ. Sau ựó cho enzyme vào tủ lạnh ựể qua ựêm, ựem ly tâm ở 40C vận tốc 6000 vòng/phút trong 30 phút. Tủa thu ựược ựem hoà tan trong ựệm axetat 0.2M, pH = 5. Xác ựịnh hoạt ựộ enzyme ở các phân ựoạn bằng phương pháp DNS và hàm lượng protein theo phương pháp Brabford. Tìm ra phân ựoạn kết tủa có hoạt tắnh cao nhất.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 48