4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.2.2. Thu nhận enzyme thô
4.2.2.1. Nuôi cấy và thu nhận
Sau quá trình nuôi cấy xạ khuẩn Streptomyces griceus (chủng NN2) trong ựiều kiện nuôi cấy tối ưu, dịch nuôi cấy ựược ly tâm lạnh loại bỏ cặn và thu lại dịch chứa enzyme. Dịch enzyme thô thu ựược ựem thử hoạt tắnh enzyme bằng phương pháp quang phổ, sử dụng dinitrosalicylic acid (DNS). Hoạt tắnh của enzyme thô thu ựược là 0,6509 U/ml kết quả cũng phù hợp với một số tác giả ựã ựược công bố [11], [40].
4.2.2.2. Cô ựặc dung dịch enzyme thô
Dịch enzyme thô ựược cô ựặc bằng phương pháp sấy ựông khô ựể thu ựược chế phẩm enzyme thô.
Chúng tôi cô ựặc từ dịch enzyme thô có thể tắch 1000ml xuống còn 250ml (cô ựặc 4 lần) rồi xác ựịnh hoạt tắnh enzyme chitosanase của chế phẩm enzyme này. Kết quả ựược trình bày trong bảng 4.3
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 66
Bảng 4.3 Hoạt tắnh enzyme chitosanase trước và sau khi cô ựặc Dịch enzyme Hoạt tắnh tổng (U/ml) Protein tổng (mg/ml) Hoạt tắnh riêng (U/mg) Trước cô ựặc 0.65 0.295 2.203 Sau cô ựặc 2.41 1.073 2.246
Qua bảng 4.3 ta thấy hoạt tắnh của enzyme sau khi cô ựặc (2,41 U/ml) ựã tăng 3,7 lần so với trước khi cô ựặc (0,65 U/ml) và nồng ựộ protein sau khi cô ựặc (1,073mg/ml) tăng hơn 3.64 lần so với trước khi cô ựặc (0,295mg/ml). Tuy vậy, hoạt tắnh riêng hầu như không thay ựổi trước và sau khi cô ựặc. Kết quả này cho ta thấy cô ựặc bằng phương pháp sấy ựông khô là một phương pháp tốt ựáp ứng ựược yêu cầu tiếp theo của thắ nghiệm.
4.2.2.3. Tinh sạch enzyme chitosanse
Thực hiện tủa phân ựoạn enzyme bằng hai phương pháp là tủa bằng ethanol và tủa bằng muối ammoni sunfate. Nhằm so sánh hiệu quả tinh sạch enzyme chitosanse của hai phương pháp và ựưa ra ựược phương pháp tốt nhất ựể phục vụ cho các phần nghiên cứu tiếp theo. Các bước tiến hành thắ nghiện ựã trình bày trong phần phương pháp nghiên cứu (phần 3.3.2.7).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 67
đồ thị 4.2 Ảnh hưởng của nồng ựộ ethanol và nồng ựộ muối amoni sunfate tới hoạt tắnh riêng của chitosanase
Khảo sát hai phương pháp tủa phân ựoạn bằng ethanol và muối amoni sunfate thấy rằng cả hai phương pháp ựều có khả năng phân tách protein thành các phân ựoạn thể hiện hoạt tắnh chitosanase khác nhau. Do mỗi enzyme có một loại tác nhân kết tủa thắch hợp, khi ựó chế phẩm enzyme thu ựược sẽ có hoạt tắnh cao nhất.
đối với phương pháp tủa bằng ethanol, từ ựồ thị 4.2 trong các phân ựoạn ựầu 0 - 30% và 30 - 40%, ngoài protein của enzyme chitosanase kết tủa thì còn có một số enzyme tạp khác cũng kết tủa theo do ựó hàm lượng protein cao nhưng hoạt tắnh riêng của enzyme chitosanase lại thấp (0,8428 và 1,4965U/mg). Ở phân ựoạn 40 - 50% và 50 - 60% cồn, hoạt tắnh của enzyme
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 68
cao nhất ựạt 1,9152 và 2,2457(U/mg). Các phân ựoạn cồn cao hơn thì hoạt tắnh của enzyme giảm dần do chứa protein không có hoạt tắnh chitosanase và do lượng cồn lớn làm protein biến tắnh. Tuy nhiên, khi so sánh hiệu quả phân tách giữa các phân ựoạn là không cao, ựiều này cho thấy khả năng làm sạch cho ezyme chitosanase bằng tủa ethanol là không cao.
đối với phương pháp tủa phân ựoạn bằng muối ammoni sunfate: Từ
ựồ thị 4.2 trong các phân ựoạn tủa phân ựoạn có nồng ựộ muối 50 - 60% và 60 - 70% cho hoạt tắnh riêng của enzyme là cao nhất: 2,8591 và 3,088 (U/mg). Tuy nhiên hiệu quả giữa các phân ựoạn enzyme cao hơn, hoạt tắnh riêng giữa các phân ựoạn khác nhau rõ ràng.
Từ kết quả thắ nghiệm trên ta thấy, khi tủa enzyme bằng muối ammoni sunfate thì thu ựược chế phẩm enzyme có hoạt tắnh cao hơn là khi kết tủa bằng ethanol. Qua ựó chúng tôi thấy rằng phương pháp tủa muối ammoni sunfate tinh sạch enzyme chitosanase là phương pháp hiệu quả hơn phương pháp tủa bằng cồn ethanol.
Qua tham khảo những nghiên cứu về chọn lựa ựiều kiện thu nhận enzyme chitosanase bằng phương pháp tủa cồn và tủa muối ở các nồng ựộ khác nhau ựã công bố [4], [19] và kết quả nghiên cứu của những khóa luận trước, chúng tôi lựa chọn ựiều kiện thu nhận enzyme bằng muối ammoni sunfate ở nồng ựộ 50 - 70% là phù hợp.
Trên cơ sở các kết quả thu ựược, chúng tôi lựa chọn phương pháp tủa muối ựể tách enzyme chitosanase trong dịch enzyme thô, phân ựoạn ựược lựa chọn là 50 - 70% muối. Kết quả ựược trình bày ở bảng 4.4.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 69
Bảng 4.4 So sánh hoạt tắnh chitosanase tủa bằng muối ammoni sunfate trên phân ựoạn 50 - 70%
Phân ựoạn tủa (%) Thể tắch enzyme (ml) Hoạt tắnh tổng (U/ml) Protein tổng (mg/ml) Hoạt tắnh riêng (U/mg) 0-50 25 0.2696 0.4432 0.6083 50-70 25 0.7246 0.0859 8.435 70-80 25 0.2552 0.1168 2.1849
Ban ựầu 100(a) 6.326 1.3602 4.6507
a là thể tắch enzyme thô ban dầu
Như vậy, enzyme thu ựược trong phân ựoạn 50 - 70% muối ammoni sunfate cho hoạt tắnh riêng cao hơn rất nhiều so với hoạt tắnh của enzyme trong dịch thô ban ựầu. độ tinh sạch của quá trình tủa bằng muối ammoni sunphate là 1,8 lần so với enzyme thô ban ựầu.
4.2.2.4. Quy trình thu nhận enzyme chitosanase
Dựa trên cơ sở kết quả thu ựược, chúng tôi ựề xuất sơ ựồ quy trình nuôi cấy chủng NN2 ựể sinh tổng hợp chitosanase (sơ ựồ 4.1)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 70
Sơ ựồ 4.1 Quy trình nuôi cấy Streptomyces griseus (chủng NN2) ựể sinh tổng hợp chitosanase
Giống gốc Streptomyces griseus
(chủng NN2) - Hoạt hóa - Nhân giống Dịch trong Giống khởi ựộng Môi trường hoạt hoá 36-48h - Lọc, ly tâm lạnh 40C, 6000 vòng/phút loại sinh khối cặn Lên men (36 Ờ 48h, pH 6,
T 370C, MT3)
Dịch lên men thô ngoại bào
Tủa muối ở phân ựoạn 50% Li tâm lạnh 6000 vòng/phút Thời gian 20 phút
Loại bỏ
Dịch trong
Tủa phân ựoạn muối 50 - 70% Li tâm lạnh 10000 vòng/phút Thời gian 20 phút Tủa Tủa Loại bỏ Hoà tan bằng ựệm axetate 0.2M pH=5 Chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 71