4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.3.1. Xác ựịnh ảnh hưởng của ựơn yếu tố ựến sự hình thành ựường COS
4.3.1.1. Ảnh hưởng của pH ựến sự hình thành ựường COS
Tất cả enzyme ựều nhạy cảm với sự thay ựổi pH của môi trường phản ứng, trong ựó có một vùng pH mà hoạt ựộng của enzyme là cực ựại. Vùng pH này là kết quả của nhiều tham số: nhiệt ựộ, lực ion, nồng ựộ cơ chấtẦnghĩa là những yếu tố bên ngoài, cũng như bản chất của enzyme.
Quả vậy enzyme là protein do các axit amin trùng ngưng với nhau tạo nên. Trong số các gốc axit amin của phân tử enzyme có các nhóm ion hóa ựược, một số nhóm tham gia vào liên kết và ựịnh vị cơ chất, một số khác tham gia vào phản ứng, còn ựa phần gốc ựược dùng ựể duy trì hình thể của enzyme. Các gốc này cũng như cơ chất trong nhiều trường hợp, rất nhạy cảm với pH và thường có các trạng thái ion hóa khác nhau phụ thuộc vào giá trị của pH. Trong cấu tạo của enzyme có một nhóm ỜCOO- của trung tâm hoạt ựộng vốn cần thiết cho sự liên kết cơ chất, nếu giảm pH của môi trường dẫn ựến biến thành nhóm COOH thì nó sẽ mất khả năng gắn kết với cơ chất và enzyme sẽ bị mất hoạt tắnh. Ở pH tối ưu, protein enzyme thường có ựiện tắch tổng cực tiểu. Nói chung pH tối ưu của enzyme thường khá gần với ựiểm ựẳng iôn của protein.
Người ta ựã chứng minh rằng vận tốc phản ứng của enzyme thường phụ thuộc vào trạng thái iôn hóa của phức hợp enzyme Ờ cơ chất, trong khi hằng số ái lực lại phụ thuộc ựồng thời vào trạng thái iôn hóa của enzyme và của phức hợp enzyme Ờ cơ chất [7].
pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt ựến tốc ựộ phản ứng và ựộ bền của enzyme. đa số enzyme bền ở pH giữa 5 và 9. pH tối thắch của một số enzyme khoảng 7 nhưng một số enzyme pH tối thắch có thể quá thấp hoặc quá cao. đối với enzyme chitosannase chúng tôi tiến hành thắ nghiệm ở các khoảng pH từ 4,5 ựến 7,0 (tiến hành thắ nghiệm ựược trình bày ở phần 3.3.3.2)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 72
Sau khi tiến hành thắ nghiệm cho thuốc thử DNS vào và ựun sôi trong 5 phút. Sau ựó cho 1ml dung dịch K-Na tartrat 40% vào ựể ổn ựịnh màu, làm lạnh tới nhiệt ựộ phòng, ly tâm loại bỏ cặn tủa và ựi ựo ựộ hấp thụ quang ở bước sóng 575nm. Thu ựược kết quả ở ựồ thị 4.3
đồ thị 4.3 Ảnh hưởng pH ựến sự hình thành ựường COS
Từ ựồ thị 4.3 chúng tôi thấy hàm lượng ựường COS tạo ra do enzyme chitossanase thủy phân tăng dần tại các khoảng pH từ 4,5 ựến 6 và ựạt cực ựại tại pH = 6,5 với hàm lượng COS là 1,28mg/ml sau ựó giảm dần (tại pH=7 hàm lượng ựường chỉ ựạt 0,86mg/ml). điều này ựược giải thắch là do pH môi trường quá cao ảnh hưởng ựến trạng thái ion các gốc R của các gốc amino acid trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức ở trung tâm hoạt ựộng, ion hóa cơ chất, gây ra hiện tượng biến tắnh protein và làm mất hoạt tắnh của enzyme do ựó làm giảm vận tốc phản ứng.
Theo một số nghiên cứu ở nước ngoài [9], [14], [12], [40] thì pH tối ưu cho enzyme chitosanase hoạt ựộng là từ 4 ựến 8. pH tối ưu cho enzyme chitosanase hoạt ựộng của xạ khuẩn Streptomyces griceus HUT 6037 là pH = 6,
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 73
Streptomyces N174 có pH = 5,5 [9], 12], [14], [48], [40]. Như vậy kết quả pH = 6,5 là phù hợp với kết quả công bố của các tác giả khác.
Dựa vào kết quả trên chúng tôi chọn pH= 6,5 là pH tối ưu cho hoạt ựộng của enzyme chitosanase thu nhận từ xạ khuẩn Streptomyces griceus
(chủng NN2), ựồng thời lấy kết quả pH này áp dụng cho thắ nghiệm tiếp theo.
4.3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt ựộ ựến sự hình thành ựường COS
Tác ựộng của nhiệt ựộ ựến hoạt tắnh của enzyme là kết quả của hai hiện tượng: nhiệt làm hoạt hóa các phản ứng hóa học, nhiệt làm biến tắnh protein và làm vô hoạt hóa enzyme.
Vận tốc của phản ứng enzyme cũng như tất cả các phản ứng hóa học ựều bị ảnh hưởng do sự tăng lên của nhiệt ựộ. Với phản ứng enzyme thì sự tăng này lớn hơn nhưng không phải là vô hạn, thường chỉ ở một vùng nhiệt ựộ nào ựó. Nói chung nhiệt ựộ làm biến tắnh enzyme là từ 45 - 500C. Một số enzyme bền về nhiệt thì có thể hoạt ựộng ở nhiệt ựộ cao hơn nhiều (có thể lên tới 1000C).
Khi nhiệt ựộ tăng quá cao các nguyên tử của phân tử enzyme thu ựược một năng lượng lớn hơn nên có xu hướng chuyển ựộng nhanh hơn. Năng lượng mà chúng thu ựược có thể ựủ thắng các tương tác yếu vốn quyết ựịnh cấu trúc của các protein hình cầu, dẫn ựến sự biến ựổi hình thể protein và do ựó là giảm hoạt tắnh của enzyme [7].
Enzyme có bản chất là protein nên phụ thuộc rất nhiều vào yếu tố nhiệt ựộ, pH và một số chất có bản chất hóa học khác... Do ựó tốc ựộ phản ứng do enzyme xúc tác nói chung và enzyme chitosanase nói riêng tăng theo nhiệt ựộ nhưng trong một giới hạn xác ựịnh mà khi ựó enzyme vẫn chưa bị biến tắnh. Enzyme chitosanase là enzyme khá bền về nhiệt, khoảng nhiệt ựộ mà enzyme hoạt ựộng ựược là từ 30 - 700C. Tại nhiệt ựộ trên 700C enzyme mất hoàn toàn hoạt tắnh xúc tác (tiến hành thắ nghiệm ựược trình bày ở phần 3.3.3.2).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 74
đồ thị 4.4 Ảnh hưởng nhiệt ựộ ựến sự hình thành ựường COS
Từ ựồ thị 4.4 ta thấy hàm lượng ựường COS tăng trong khoảng nhiệt ựộ từ 450C ựến 500C sau ựó tăng nhanh trong khoảng nhiệt ựộ 55 - 600C. Tại nhiệt ựộ 600C hàm lượng ựường ựạt cực ựại 1,42mg/ml sau ựó hàm lượng COS giảm từ nhiệt ựộ 650C. Bắt ựầu ở nhiệt ựộ này thì enzyme chitosanase có hiện tượng biến tắnh protein và do ựó làm giảm hoạt tắnh của enzyme ảnh hưởng ựến tốc ựộ phản ứng tạo COS.
Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả ựã công bố cho rằng nhiệt ựộ tối thắch của enzyme chitosanase khoảng tù 500C ựến 700C [12], [14], [40], [48]. đặc biệt chitosannase của giống xạ khuẩn Streptomyces griseus HUT 6037 có nhiệt ựộ tối thắch là 600C, của Streptomyces N174 là 650C.
Dựa vào kết quả trên chúng tôi quyết ựịnh chọn nhiệt ựộ 600C là nhiệt ựộ tối thắch thủy phân chitosan thu COS. Kết quả trong thắ nghiệm này ựược áp dụng cho thắ nghiệm tiếp theo.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 75
4.3.1.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ E/S ựến sự hình thành ựường COS
Tỷ lệ enzyme cơ chất có ảnh hưởng rất lớn tới hiệu quả của quá trình thủy phân, ngoài ra chọn lựa tỷ lệ E/S còn liên quan ựến vấn ựề kinh tế. Tỷ lệ E/S phù hợp sẽ làm giảm chi phắ sản xuất mà vẫn thu ựược hiệu quả cao tăng lợi nhuận sản xuất (thắ nghiệm ựược tiến hành ở phần 3.3.3.2).
đồ thị 4.5 Ảnh hưởng tỷ lệ enzyme/cơ chất (E/S) ựến sự hình thành ựường COS
Qua ựồ thị 4.5 chúng tôi thấy hàm lượng ựường COS tăng nhanh trong khoảng E/S từ 0,02 ựến 0,12 (hàm lượng ựường ựạt từ 1,02mg/ml ựến 3,78mg/ml), ở giai ựoạn này khi tăng nồng ựộ enzyme chitosanase thì hoạt tắnh của enzyme cũng tăng tuyến tắnh. Ta biết enzyme chitosanase là một enzyme ngoại bào nên nồng ựộ enzyme có trong dịch lên men thường thấp vì vậy khi tăng nồng ựộ enzyme lên thì tốc ựộ phản ứng trong một ựơn vị thời gian tăng lên ựiều này có nghĩa là hoạt tắnh enzyme tăng lên. Bắt ựầu ở tỷ lệ E/S = 0,12 thì tốc ựộ phản ứng không tăng nữa và lượng ựường COS có tăng nhưng không ựáng kể. Tại thời ựiểm này nồng ựộ cơ chất trong dung dịch
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 76
enzyme cơ chất giảm và dần dần hết nên dù tăng nồng ựộ enzyme lên thì phản ứng cũng không xảy ra nữa. Như vậy việc tăng tỷ lệ E/S không làm thay ựổi nhiều hàm lượng COS tạo ra, do ựó tăng tỷ lệ E/S là không cần thiết. Mục ựắch của việc nghiên cứu tỷ lệ E/S ựể tìm tỷ lệ E/S thắch hợp ựể tiết kiệm ựược lượng enzyme trong nghiên cứu.
Từ phân tắch trên chúng tôi quyết ựịnh lấy tỷ lệ E/S = 0,12 là tỷ lệ tối thắch cho enzyme hoạt ựộng và sử dụng kết quả này cho thắ nghiệm tiếp theo.
4.3.1.4 Ảnh hưởng của thời gian ựến sự hình thành ựường COS
Thời gian liên quan trực tiếp ựến quá trình xúc tác của enzyme, mỗi một phản ứng từ khi bắt ựầu ựến khi kết thúc cần một khoảng thời gian nhất ựịnh. để phản ứng hết cần phải chọn thời gian phù hợp cho mỗi quá trình phản ứng thì mới ựem lại hiệu quả cao nhưng nếu ựể quá thời gian cần thiết thì hiệu quả không tăng lên mà gây lãng phắ về thời gian, ảnh hưởng ựến tốc ựộ sản xuất, hao phắ máy móc... (tiến hành thắ nghiệm ựược trình bày ở phần 3.3.3.2).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 77
Từ ựồ thị 4.6 ta thấy hàm lượng COS tạo ra tăng nhanh trong khoảng thời gian tù 8 giờ ựến 10 giờ (COS tăng từ 2,73mg/ml ựến 3,83mg/ml) sau ựó tiếp tục tăng trong thời gian 11h và 12h nhưng không ựáng kể. Tại thời ựiểm 11 giờ ựạt 3,86mg/ml và ở 12 giờ ựạt 3,84mg/ml. Kết quả này không có sự khác biệt nhiều so với khoảng thời gian 10 giờ là 3,83mg/ml.
Từ kết quả trên ựể tiết kiệm thời gian và chi phắ trong sản xuất mà vẫn thu ựược hàm lượng COS cao chúng tôi quyết ựịnh chọn thời gian 10 giờ là thời gian tối ưu ựể thu nhận ựường.
Dựa trên các kết quả thu ựược từ các thắ nghiệm trên cùng với một số nghiên cứu trước [9], [12], [14], [38], [40] chúng tôi lựa chọn ựược ựiều kiện tối thắch ựể thu nhận ựường chitosan oligosaccharide như sau:
Nồng ựộ cơ chất: 2% Tỷ lệ E/S = 0,12 pH = 6,5
Nhiệt ựộ 600C
Thời gian phản ứng 10 giờ