luận văn thạc sĩ tinh chế và phân tích đặc tính liên kết o glycan của lectin từ rong đỏ hydropuntia eucheumatoides

LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng Trƣởng phòng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời giúp tơi chọn đề tài tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi suốt q trình hồn thành luận văn Và xin chân thành cảm ơn Ths Đinh Thành Trung - Phòng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, ngƣời giúp tơi hồn thành tốt phần thực nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ, Phòng Đào tạo, Khoa Hóa học Q Thầy Cơ giáo dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi thực luận văn nhƣ hồn thành thủ tục cần thiết Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang giúp đỡ tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Quý Thầy Cô giáo Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trƣờng Đại học Nha Trang, Trƣờng Đại học Khánh Hòa dạy dỗ, cung cấp nhiều kiến thức bổ ích tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Và cuối cùng, xin cảm ơn Sở Giáo dục Đào tạo Tỉnh Khánh Hòa, Trƣờng THPT Chun Lê Q Đơn – Nha Trang tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa học sau đại học Học viện Khoa học Công nghệ Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019 Học viên Trần Thị Hải Yến LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi dƣới hƣớng dẫn, bảo Thầy hƣớng dẫn giúp đỡ cán phòng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Nha Trang, ngày 09 tháng 09 năm 2019 Học viên Trần Thị Hải Yến MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 12 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG BIỂN 12 1.2 TỔNG QUAN VỀ LECTIN 14 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 14 1.2.2 Sự phân bố lectin sinh giới 16 1.2.3 Vai trò sinh học lectin 18 1.3 LECTIN TỪ RONG BIỂN 19 1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển giới 19 1.3.1.1 Các phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển 19 1.3.1.2 Đặc tính liên kết carbohydrate lectin 21 1.3.1.3 Điểm đẳng điện hàm lƣợng acid amin lectin từ rong biển 23 1.3.1.4 Ảnh hƣởng pH nhiệt độ đến hoạt tính lectin từ rong biển 24 1.3.1.5 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt tính lectin rong biển 25 1.3.1.6 Hàm lƣợng carbohydrate lectin từ rong biển 25 1.3.1.7 Trọng lƣợng phân tử lectin từ rong biển 25 1.3.1.8 Cấu trúc lectin từ rong biển 26 1.3.1.9 Ứng dụng lectin từ rong biển 29 1.3.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển nƣớc 32 1.4 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN 33 1.4.1 Sắc ký trao đổi ion 33 1.4.2 Sắc ký lọc gel 33 1.4.3 Sắc ký lực 34 1.5 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ PROTEIN DỰA VÀO PHỔ KHỐI LƢỢNG 35 1.5.1 Nguyên tắc chung 35 1.5.2 Phƣơng pháp xác định phân tử khối protein 36 1.6 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ AXIT AMIN TRONG LECTIN 36 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 39 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Nguyên vật liệu 40 2.2.2 Hóa chất 40 2.2.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 41 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 42 2.3.1 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu % (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà nhóm máu ngƣời A, B, O) : 42 2.3.2 Phân tích hoạt tính lectin phƣơng pháp ngƣng kết hồng cầu (hồng cầu máu thỏ, cừu, gà nhóm máu ngƣời A, B, O) 43 2.3.3 Xác định hàm lƣợng protein 44 2.3.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm thực nghiệm: 46 2.3.5 Phân tích điều kiện tối ƣu để chiết lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 47 2.3.5.1 Phân tích tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết 48 2.3.5.2 Phân tích nồng độ ethanol chiết 48 2.3.5.3 Phân tích thời gian chiết 48 2.3.6 Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin từ dịch chiết 49 2.3.7 Tinh lectin phƣơng pháp sắc ký trao đổi ion DEAESepharose 50 2.3.8 Tinh lectin phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 51 2.3.9 Kiểm tra độ tinh xác định khối lƣợng phân tử lectin phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 52 2.3.10 Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng đặc tính lý, hóa đến lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 56 2.3.10.1 Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu 57 2.3.10.2 Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu 57 2.3.10.3 Phƣơng pháp phân tích ảnh hƣởng cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu 58 2.3.10.4 Phƣơng pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate lectin 58 2.3.11 Điều chế porcine stomach mucin đƣợc xử lý enzyme trypsin 60 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61 3.1 PHÂN TÍCH HOẠT TÍNH NGƢNG KẾT HỒNG CẦU THỎ, CỪU, GÀ VÀ CÁC NHÓM MÁU NGƢỜI A, B, O VỚI DỊCH CHIẾT TỪ RONG ĐỎ H eucheumatoides 61 3.2 PHÂN TÍCH CÁC ĐIỀU KIỆN ĐỂ CHIẾT LECTIN TỪ RONG H eucheumatoides 61 3.2.1 Tỷ lệ nguyên liệu dung môi chiết 61 3.2.2 Ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến trình chiết 63 3.2.3 Ảnh hƣởng thời gian chiết 64 3.3 TINH CHẾ LECTIN 65 3.3.1 Phân tích nồng độ ethanol thích hợp để kết tủa lectin 65 3.3.2 Tinh lectin sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 67 3.3.3 Tinh lectin sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200 68 3.3.4 Kiểm tra độ tinh xác định trọng lƣợng phân tử lectin phƣơng pháp điện di SDS-PAGE 69 3.3.5 Kết tổng hợp trình tinh lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 71 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH LÝ, HĨA CỦA LECTIN TỪ RONG ĐỎ H eucheumatoides 72 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 72 3.4.2 Ảnh hƣởng pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 74 3.4.3 Ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 75 3.4.4 Phân tích khả liên kết carbohydrate lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 76 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 88 4.1 KẾT LUẬN 88 4.2 KIẾN NGHỊ 88 TÀI LIỆU THAM KHẢO 89 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT HC Hồng cầu HTR Hoạt tính riêng HTTS Hoạt tính tổng số NKHC Ngƣng kết hồng cầu OD Optical Density Mật độ quang PBS Phosphate Buffered Saline Đệm muối photphat DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Sự phân bố lectin sinh giới 17 Bảng 1.2 Một số phƣơng pháp tinh chế lectin từ rong biển 19 Bảng 2.1 Các thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 41 Bảng 2.2 Các loại đƣờng đơn glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate lectin 59 Bảng 3.1 Phân tích hoạt tính ngƣng kết hồng cầu dịch chiết thơ từ rong đỏ H eucheumatoides với dạng hồng cầu khác 61 Bảng 3.2 Kết tinh lectin từ 300 gam rong thô H eucheumatoides 71 Bảng 3.3 Kết thí nghiệm ảnh hƣởng ion kim loại đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong H eucheumatoide 75 Bảng 3.4 Nồng độ đƣờng glycoprotein nhỏ có khả ức chế hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong H eucheumatoides 79 Bảng 3.5 Khả ức chế đƣờng glycoprotein lectin từ rong đỏ rong lục 85 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc bậc lectin từ rong đỏ EDA-1 EDA-2 từ rong Eucheuma denticulatum; ESA-2 từ rong Eucheuma serra; KSA-1 KSA-2 từ rong Kappaphycus striatum, KAA-1 KAA-2 từ rong Kappaphycus alvarezii , SfL-1 SfL-2 từ rong Solieria filiformis 27 Hình 1.2 Cấu trúc Man9GlcNAc2 28 Hình 1.3 Cấu trúc lõi Man3GlcNAc2 28 Hình 1.4 Cấu trúc lectin từ rong đỏ, carrageenophytes 29 Hình 1.5 Biểu đồ thể ứng dụng y sinh lectin từ rong biển 30 Hình 2.1 Hình ảnh rong Hydropuntia eucheumatoides 39 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi chiết:nguyên liệu đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng lectin 62 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng trình chiết lectin 63 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng lectin 64 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến khả kết tủa lectin 65 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tƣơng quan giá trị A280nm hoạt tính ngƣng kết hồng cầu theo thứ tự phân đoạn trình sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose 67 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn A280nm hoạt tính ngƣng kết hồng cầu phân đoạn trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 68 Hình 3.7 Kết điện di lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 69 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 73 Hình 3.9 Ảnh hƣởng pH lên hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 74 Hình 3.10 Các dạng cấu trúc lõi mở rộng O-glycan 77 Hình 3.11 Các dạng cấu trúc N-glycan 78 Hình 3.12 Cấu trúc số đƣờng đơn 82 Hình 3.13 Cấu trúc Fetuin Asialofetuin 82 Hình 3.14 Cấu trúc yeast mannan, porcine thyroglobulin porcine stomach mucin 84 99 84 Oliveira S.R.M, Nascimento A.E., Lima M.E.P., Leite Y.F.M.M., Benevides N.M.B., 2002, Purification and characterisation of a lectin from the red marine alga Pterocladiella capillacea (SG Gmel) Santel & Hommers Rev Brasil Bot 25:397–403 85 Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., Saker-Sampaio S., Costa F.H.F., Ramos M.V., 1999, A new isolation procedure and further characterisation of the lectin from the red marine alga Ptilota serrata J Appl Phycol 10:539–546 86 Boonsri N., Rudtanatip T., Withyachumnarnkul B., Wongprasert K., 2017, Protein extract from red seaweed Gracilaria fisheri prevents acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) infection in shrimp J Appl Phycol 29:1597–1608 Boyd WC, Almodovar LR, Boyd LG (1966) Agglutinins in marine algae for human erythrocytes Transfusion (Philadelphia) 6: 82–83 87 Okuyama S., Nakamura-Tsuruta S., Tateno H., Hirabayashi J., Matsubara K., Hori K., 2009, Strict binding specificity of small-sized lectins from the red marine alga Hypnea japonica for core (α-1, 6) fucosylated N-glycans Biosci Biotechnol Biochem 73:912–920 88 Chaves R.P., da Silva S.R., Nascimento Neto L.G., Carneiro R.F., Coelho da Silva A.L., Sampaio A.H., lopes de Sousa B., Cabral M.G., Videira P.A., Teixeira E.H., Nagano C.S., 2017, Structural charactrization of two isolectins from the marine red alga Solieria filiformis (Kutzing) P.W Gabrielson and their anticancer effect on MCF-7 breast cancer cells Int J Biol Macromol http://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2017.09.116 89 Hori K., Ikegam S., Miyazawa K., Ito K., 1988a, Mitogenic and antineoplastic isoagglutinins from the red alga Soleria robusta Phytochemistry 27:2063-2067 100 90 Melo F.R., Norma M.B., Benevides N.M.B., Pereira M.G., Holanda M.L., Mendes F.N.P., Oliveira S.R.M., Freitas L.P., Silva L.M.C.M., 2004, Purification and partial characterisation of a lectin from the red marine alga Vidalia obtusiloba C Agardh Rev Bras Bot 27:263–269 91 Mo H., Goldstein I.J., 1994, Isolation and characterization of a Forssman antigen-binding lectin from velvet bean (Mucuna derrigiana) seeds Glycoconj J 11:424-431 92 Hori K., Miyazawa K., Ito K., 1990, Some common properties of lectins from marine algae Hydrobiologia 204-205:561–566 93 Okamoto R., Hori K., Miyazawa K., Ito K., 1990, Isolation and characterization of a new hemagglutinin from the red alga Gracilaria bursapastoris Experientia 46:975–977 94 Benevides N.M.B., Leite A.M., Freitas A.L.P., 1996, Atividade hemagglutinante na alga vermelha Solieria filiformis R Bras Fisiol Veg 8:117-122 95 Calvete J.J., Costa F.H.F., Saker-Sampio S., Murciano M.P.M., Nagano C.S., Cavada B.S., Grangeiro T.B., Ramos M.V., Jr C.B., Silveira S.B., Freitas B.T., Sampio A.H., 2000, The amino acid sequence of the agglutinin isolated from the red marine algae Bryothamnion triquetrum defines a novel lectin structure Cell Mol Life Sci 57:343-350 96 Anam C., Praseptiangga D., Nugraheni M.A., Nurhayati T., Fajarningsih N.D., Zilda D.S., Chasanah E., Yunus A., 2017a, Preliminary characterization of crude lectin fraction of the red alga Acrocystis nana from wediombo beach of the southern coast of Java island, Gunung kidul, Yogyakarta, Indonesia IOP Conf Ser: Mater Sci Eng 193:012016 101 97 Kakita H., Fukuoka S., Obika H., Li Z.R., Kamishima H., 1997, Purification and properties of a high molecular weight hemagglutinin from the red alga Gracilaria verrucosa Bot Mar 40:241-247 98 Rogers D.J., Hori K., 1993, Marine algal lectins: new developments Hydrobiologia 260/261:589–593 99 Moulaei T., Shenoy S.R., Giomarelli B., Thomas C., McMahon J.B., Dauter Z., O’Keefe B.R., Wlodawer A., 2010, Monomerization ofviral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIVactivity Structure 18:1104– 1115 100 Moulaei T., Alexandre K.B., Shenoy S.R., Meyerson J.R., Krumpe L.R., Constantine B., Wilson J., Buckheit R.W.Jr, McMahon J.B., Subramaniam S., Wlodawer A., O’Keefe B.R., 2015, Griffithsin tandemers: flexible and potent lectin inhibitors of the human immunodeficiency virus Retrovirology 12:6 101 Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., Saker-Sampaio S., Nascimento K.S., Nagano C.S., Farias W.R.L., 2002, New affinity procedure for the isolation and further characterization of the blood group B specific lectin from the red marine alga Ptilota phumosa J Appl Phycol 14 :489-495 102 Nascimento A.S.F., Serena S., Beloqui A., Arda A., Sampaio A.H., Walcher J., Ott.D., Unverzagt G., Reichardt N.C., Jimenez-Barbero J., Nascimento K.S., Imberty A., Cavada B.S., Varrot A., 2015, Algal lectin binding to core (α1-6) fucosylated N-glycans: structural basis for specificity and production of recombinant protein Glycobiol 6:607–616 103 Ziolkowska N.E., Keefe B.R., Mori T., Zhu C., Giomarelli B., Vojdani F., Palmer K.E., McMhon J., Wlodawer A., 2006, Domainswapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its 102 mode of carbohydrate binding Structure 14:1127-1135 104 Ziolkowska N.E., Shenoy S.R., O’keefe B.R., Wlodawer A., 2007a, Crystallographic studies of the complexes of antiviral protein griffithsin with glucose and N-acetylglucosamine Prot Sci 16:1485– 1489 105 Ziolkowska N.E., Shenoy S.R., O’Keefe B.R., McMohan J.B., Palmer K.E., Dwek R.A., Wormald M.R., Wlodawer A., 2007b, Crystallographic, thermodyanamic, and molecular modelling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin Proteins: Struct Funct Bioinf 67:661–670 106 Barre A., Simplicien M., Benoist H., Van Damme Els.J.M., Rougé P., 2019, Mannose-specific lectins from marine algae: Diverse structure scaffolds associated to common virucidal and anti-cancer properties 107 Le Dinh Hung, Hirayama M., Hori K., 2016, Cloning and characterizing cDNA sequences coding high-mannose N-glycan binding lectins from cultivated red algae Eucheuma denticulatum and Kappaphycus striatum Vietnam J Biotechnol 14: 327-336 108 Whitley M.J., Furey W., Kollipara S., Gronenborn A.M., 2013, Burkholderia oklahomensis agglutinin is a canonical two-domain OAA-family lectin: structure, carbohydrate binding, and anti-HIV activity FEBSJ 280, 2056-2067 109 Huskens D., Schols D., 2012, Algal lectins as potential HIV microbicide candidates Mar Drugs 10: 1476-97 110 Parveen Bansal, 2013, Algal lectins as promising biomolecules for biomedical research 111 Neves S.A., Freitas A.L.P., Souza B.W.S., 2007, Antinociceptive properties in mice of a lectin isolated from the marine alga Amansia multifida Lamouroux Braz J Med Biol Res 40:127- 34 103 112 Viana G.S.B., Freitas A.L.P., Lima M.M.L., 2002, Antinociceptive activity of sulfated carbohydrates from the algae Bryothamnion seafortii (Turner) Kutz And B Triquetrum (S.G Gmel) M Howe Braz J Med Biol Res 35: 713-22 113 Vanderlei E.S.O., Patoilo K.K.N.R., Lima NA., 2010, Antinociceptive and anti-inflamatory activities of lectin from the marine green alga Caulerpa cupressoides Int Immunopharmacol 10:1113-8 114 Karasaki Y., Tsukamoto S., Mizusaki K., 2001, Agarlic lectin exerted an antitumor activity and induced apoptosis in human tumor cells Food Res Int 34:7-13 115 Pinto V.P.T., Debray H., Dus D., Teixeira E.H., de Oliveira T.M., Carneiro V.A., Teixeira A.H., Filho G.C., Nagano C.S., Nascimento K.N., Alexandre H., Sampaio A.H., Cavada B.S., 2009, Lectins from the red marine algal species Bryothamnion seaforthii and Bryothamnion triquetrum as tools to differentiate human colon carcinoma cells Adv Pharmacol Sci 2009: 862162 116 Anam C., Chasanah E., Perdhana B.P., Fajarningsih N.D., Yusro N.F., Sari A.M., Nursiwi A., Praseptiangga D., Yunus A., 2017b, Cytotoxicity of crude lectins from red macro algae from the southern coast of Java island, Gunung Kidul Regency, Yogyakarta, Indonesia IOP Conf Ser: Mater Sci Eng 193:012017 117 Perdhana B.P., 2017, Cytotoxicity and antibacterial effects of crude lectin fraction bioactive compound of red macroalgae from the Southern Coast of Java island, Gunungkidul regency Dissertation, Sebelas Maret University, Surakarta, Yogyakarta 118 Triveleka L.A., Vagias C., Roussis V., 2003, Natural products with anti-HIV activity from marine organism Curr Top Med 3:1512-35 104 119 Barrientos L.G., O’Keefe B.R., Bray M., 2003, Cyanovirin-N binds to the several glycoprotein gp (1, 2) and inhibits infectivity of Ebola virus Antivir Res 58:47-56 120 Bewley C.A., Gustafson K.R., Boy M.R., 1998, Solution structure of cyanovirin-N, a potent HIV-inactivating protein Nature 15:571-8 121 Dey B., Lerner D.L., Lusso P., 2000, Multipe antiviral activities of cianovirin-N: Blocking of human immunodeficiency virus type gp 120 interaction with CD4 and coreceptor and inhibition of diverse enveloped viruses J Virol 74:4562-9 122 Le Dinh Hung, Ngo Thi Duy Ngoc, Kanji Hori (2013) Isolation and characterization of novel lectins from the red alga Gracilaria salicornia Vietnam J Biotechnol 11(4): 743 – 753 123 Le Dinh Hung, Tran Thi Hai Yen, Dinh Thanh Trung, 2018a, Characterization of O-glycan binding lectin from the red alga Hydropuntia eucheumatoides Vietnam J Biotechnol 16(4): 687-696 124 Le Dinh Hung, Bui Minh Ly, Vo Thi Hao, Dinh Thanh Trung, Vo Thi Dieu Trang, Phan Thi Hoai Trinh, Ngo Thi Duy Ngoc, Thai Minh Quang, 2018b, Purifcation, characterization and biological effect of lectin from the marine sponge Stylissa flexibilis (Lévi, 1961) Com Biochem Physiol Part B 216: 32 – 38 125 Le Dinh Hung, Le Thi Hoa, Le Nhu Hau, Dinh Thanh Trung, 2019, The lectin accumulation, growth rate, carrageenan yield, and quality from the red alga Kappaphycus striatus cultivated at Camranh Bay, Vietnam J Appl Phycol 31: 1991 – 1998 126 Terada R., Lewmanomont K., Chirapart A., Kawaguchi S., 2004, Gracilaria and related Genera (Gracilariales, Rhodophyta) from the Gulf of Thailand and Adjacent Waters Proc Sem Coast Oceanogr, 1st: 144-159 105 127 Nguyễn Đình Triệu, 2006, Các phƣơng pháp vật lý ứng dụng hóa học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội, tr.124-149 128 Edman P., Högfeldt Erik, Sillén Lars Gunnar, Kinell Per-Olof, 1950, Method for determination of the amino acid sequence in peptides Acta Chem Scand 4: 283– 293 doi:10.3891/acta.chem.scand.04-0283 129 Lê Nhƣ Hậu, 2007, Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Quốc gia "Biển Đông-2007", Nha Trang, tr 527-534 130 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., 1951, Protein measurement with the Folin phenol reagent J Biol Chem 193: 265–275 131 Robert K Scopes, 1982, Protein Purification, Springer-Verlag, New York Heidelberg Berlin, page 58 132 LaemmLi U.K., 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature 227: 680–685 133 Xiong C., Li W., Liu H., Zhang W., Dou J., Bai X., Du Y., Ma X., 2006, A normal mucin binding lectin from the sponge Craniella australiensis Comp Biochem Physiol C 143, 9–16 134 Pamela Stanley, Naoyuki Taniguchi and Markus Aebi, 2017, Essentials of Glycobiology Chapter 8O-Glycans 135 Pamela Stanley, Naoyuki Taniguchi and Markus Aebi, 2017, Essentials of Glycobiology Chapter 9N-Glycans 136 Tsuji T., Yamamoto K., Irimura T., Osawa T., 1981, Structure of carbohydrate unit A of porcine thyroglobulin J Biochem 195: 691699 137 Yamamoto K., Tsuji T., Irimura T., Osawa T., 1981, The structure of carbohydrate unit B of porcine thyroglobulin J Biochem 195: 70-713 106 138 Wopereis S., Lefeber D.J., Morava E., Wevers R.A., 2006, Mechanisms in protein O-glycan biosynthesis and clinical and molecular aspects of protein O-glycan biosynthesis 139 Van Halbeek H., Dorland L., Vliegenthart J.F.G., Kochetkov K., Arbatsky N.P., Derevitskaya V.A., 1982, Characterization of the primary structure and the microheterogeneity of the carbohydrate chains of porcine blood-goup H substance by 500-MHz 1H-NMR spectroscopy Eur J Biochem 127:21-29 140 Karlsson N.G., Nordman H., Karlsson H., Carlstedt I., Hansson G.C., 1997, Glycosylation differences between pig gastric mucin populations: A comparative study of the neutral oligosaccharides using mass spectrometry J Biochem 326: 911-917 141 Nagano C.S., del Sol F.G., Cavada B.S., Nascimento K.S.D., Nunes E.V., Sampaio A.H., Calvetea J.J., 2005, Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of HML, a lectin from the red marine alga Hynea musciformis Acta Cryst F 61:997-999 PHỤ LỤC Bảng Phụ lục 1: Giá trị mật độ quang OD tƣơng ứng với nồng độ BSA (µg/mL) Nồng độ BSA (µg/mL) OD750 nm 20 40 80 120 160 200 0.053 0.112 0.209 0.309 0.401 0.478 Đƣờng chuẩn protein theo phƣơng pháp Lowry Bảng Phụ lục 2: Giá trị Rf lgM protein thang chuẩn Khối lƣợng phân tử M (Da) 66000 45000 36000 29000 24000 20100 14200 Khoảng cách di chuyển vạch Protein (cm) 0.7 1.0 1.3 1.7 2.0 2.5 3.3 Rf Lg M 0.12 0.17 0.22 0.28 0.33 0.42 0.55 4.82 4.65 4.56 4.46 4.38 4.30 4.15 Đồ thị tƣơng quan lgM Rf protein thang chuẩn Bảng Phụ lục 3: Kết phân tích ảnh hƣởng tỷ lệ ngun liệu:dung mơi chiết (w/v) đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng lectin từ rong đỏ H eucheumatoides Tỷ ệ HA (HU/mL) Protein tổng (mg) HTTS (HU) HTR (HU/mg) 1:2 1024 13,75 11264 819,20 1:3 1024 18,69 21504 1150,56 1:4 1:5 1024 512 19,84 25,01 31744 20992 1600,00 839,34 1:6 512 27,03 20480 757,68 1:7 256 26,23 15616 595,35 1:8 128 30,53 9088 297,67 Bảng Phụ lục 4: Kết phân tích ảnh hƣởng nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng lectin từ rong đỏ H eucheumatoides Nồng độ ethanol (%) HA (HU/mL) HTTS (HU) Protein tổng (mg) HTR (HU/mg) 1024 6451,2 6,00 1075,20 10 1024 6860,8 6,21 1104,79 20 30 1024 512 6553,6 3174,4 5,46 4,14 1200,29 767,76 40 256 1664,0 3,79 439,05 Bảng Phụ lục 5: Kết phân tích ảnh hƣởng thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng lectin từ rong đỏ H eucheumatoides Thời gian HA (giờ) (HU/mL Protein tổng (mg) HTTS (HU) HTR (HU/mg) 256 14,2 5120 360,56 512 15,2 10240 673,68 1024 24,9 20480 822,49 1024 25,8 20480 793,80 10 1024 28,1 20480 728,83 12 1024 29,9 20480 684,95 Bảng Phụ lục 6: Kết phân tích nồng độ ethanol đến khả kết tủa lectin từ rong đỏ H eucheumatoides Nồng độ ethanol (%) HA (HU/mL 50 HTTS (HU) 1024 Protein tổng (mg) 0,89 1024 HTR (HU/mg) 1150,56 60 2048 1,13 2048 1812,39 70 8192 1,72 8192 4662,79 80 16384 3,28 16384 4995,12 Bảng Phụ lục 7: Kết đo A280 nm hoạt tính ngƣng kết hồng cầu phân đoạn sau sắc ký trao đổi ion DEAE-sepharose Thứ tự phân đoạn A280nm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 0.003 0.048 0.062 0.064 0.062 0.054 0.045 0.036 0.03 0.024 0.02 0.019 0.018 0.018 0.019 0.019 0.018 0.017 0.1017 0.016 0.014 0.012 0.011 0.013 0.015 0.013 Hoạt tính Thứ tự ngƣng phân kết hồng đoạn cầu 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 A280nm 0.011 0.008 0.008 0.009 0.01 0.003 0.016 0.02 0.094 0.834 0.407 0.141 0.063 0.037 0.029 0.024 0.022 0.018 0.016 0.014 0.016 0.016 0.014 0.014 0.014 0.013 0.01 Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu 0 0 0 0 256 2048 1024 128 16 0 0 0 0 0 Bảng Phụ lục 8: Kết đo A280 nm hoạt tính ngƣng kết hồng cầu phân đoạn sau sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 Thứ tự phân đoạn A280nm 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 0.016 0.003 0 0 0 0 0 0 0 0 0.009 0.033 0.027 0.025 0.026 0.019 0.012 Hoạt tính Thứ tự ngƣng phân kết hồng đoạn cầu 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 16 50 64 51 128 52 A280nm 0.007 0.012 0.026 0.034 0.038 0.04 0.038 0.028 0.018 0.012 0.012 0.011 0.012 0.011 0.009 0.008 0.004 0.002 0.003 0.001 0.001 0.001 0.002 0.003 0.002 0.004 Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu 256 256 512 512 512 512 256 128 32 4 2 0 0 0 0 0 Bảng Phụ lục 9: Kết xét ảnh hƣởng nhiệt độ đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides Nhiệt độ (oC) Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu (HU/mL) 30 27 40 27 50 27 60 27 70 23 80 2o 90 2o 100 2o Bảng Phụ lục 10: Kết xét ảnh hƣởng pH đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides pH Hoạt tính ngƣng kết hồng cầu (HU/mL) 27 27 27 27 27 27 27 10 27 ... kim loại đến hoạt tính ngƣng kết hồng cầu lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 75 3.4.4 Phân tích khả liên kết carbohydrate lectin từ rong đỏ H eucheumatoides 76 CHƢƠNG KẾT LUẬN... ta rong đƣợc thu hoạch tự nhiên Nha Trang Ninh Thuận, chƣa có cơng bố lectin từ lồi rong Trên sở tơi tiến hành thực đề tài Tinh chế phân tích đặc tính liên kết O- glycan lectin từ rong đỏ Hydropuntia. .. ion sắc ký lọc gel + Phân tích tính chất lectin từ rong đỏ H eucheumatoides, bao gồm: * Phân tích đặc tính liên kết O- glycan phƣơng pháp ức chế ngƣng kết hồng cầu 11 * Xác định khối lƣợng phân