luận văn thạc sĩ tinh chế và phân tích các đặc tính của lectin từ rong biển betaphycus gelatinus

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Thị Đoan Thục TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Nha Trang - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Thị Đoan Thục TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Lê Đình Hùng Nha Trang – 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi bảo thầy hướng dẫn giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu Phòng Cơng nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa công bố Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Nha Trang, ngày 25 tháng 09 năm 2019 Chữ ký học viên Lê Thị Đoan Thục LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng (Trưởng phòng Cơng nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang), người tận tình dìu dắt hướng dẫn tơi suốt q trình hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ths Đinh Thành Trung - Phòng Cơng nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu Ứng dụng Cơng nghệ Nha Trang, người giúp tơi hồn thành tốt phần thực nghiệm Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học cơng nghệ, khoa Hóa học Phòng Đào tạo tạo điều kiện thuận lợi để thực luận văn hoàn thành thủ tục cần thiết Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo cán công tác Viện Nghiên cứu Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trường Đại học Nha Trang, Trường Đại học Khánh Hòa giảng dạy, hỗ trợ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân bạn bè nhiệt tình động viên, giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thiện luận văn Và cuối cùng, xin cảm ơn Sở Giáo dục Đào tạo Khánh Hòa, trường THPT Lý Tự Trọng – Nha Trang tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa học sau đại học Học viện Khoa học Công nghệ Xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 25 tháng 09 năm 2019 Học viên Lê Thị Đoan Thục MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục ký hiệu chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN 10 1.1 Tổng quan lectin 10 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 10 1.1.2 Phân bố lectin sinh giới 11 1.1.2.1 Sự phân bố lectin giới thực vật 11 1.1.2.2 Sự phân bố lectin giới động vật 12 1.1.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật 12 1.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển giới 13 1.2.1 Một số tính chất lý, hóa sinh học lectin từ rong biển 13 1.2.1.1 Tính tan kết tủa 13 1.2.1.2 Đặc tính liên kết carbohydrate lectin 13 1.2.1.3 Điểm đẳng điện hàm lượng axit amin 15 1.2.1.4 Trọng lượng phân tử 15 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính lectin 15 1.2.2.1 Ảnh hưởng pH 15 1.2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ 16 1.2.2.3 Ảnh hưởng ion kim loại 16 1.2.2.4 Hàm lượng carbohydrate 16 1.2.3 Cấu trúc lectin từ rong đỏ 20 1.2.4 Hoạt tính sinh học lectin từ rong biển 21 1.2.4.1 Kháng virus chống suy giảm miễn dịch người (HIV) 23 1.2.4.2 Kháng virus viêm gan C 23 1.2.4.3 Kháng virus herpes simplex 23 1.2.4.4 Kháng virus cúm 23 1.2.4.5 Kháng virus coronavirus 24 1.2.4.6 Kháng ung thư 24 1.2.4.7 Kháng vi khuẩn 24 1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển nước 25 1.4 Các phương pháp tinh chế lectin từ rong biển 25 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, địa điểm thời gian nghiên cứu 28 2.2 Nguyên vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 29 2.2.1 Nguyên vật liệu 29 2.2.2 Hóa chất 29 2.2.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 29 2.3 Phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu % 30 2.3.2 Phân tích hoạt tính lectin phương pháp ngưng kết hồng cầu 30 2.3.3 Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry 31 2.3.4 Bố trí thí nghiệm tổng quát 32 2.3.5 Xác định điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinus 34 2.3.5.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết 34 2.3.5.2 Khảo sát nồng độ dung môi chiết 35 2.3.5.3 Khảo sát thời gian chiết 36 2.3.6 Khảo sát nồng độ tác nhân tủa thích hợp để thu tủa protein-lectin 37 2.3.7 Tinh lectin phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAFSepharose 37 2.3.8 Tinh lectin phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S–200 38 2.3.9 Kiểm tra độ tinh xác định khối lượng phân tử lectin phương pháp điện di SDS-PAGE 38 2.3.10 Phân tích yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính lý, hóa lectin từ rong biển B gelatinus 41 2.3.10.1 Phương pháp phân tích ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu 41 2.3.10.2 Phương pháp phân tích ảnh hưởng pH đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu 41 2.3.10.3 Phương pháp phân tích ảnh hưởng cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu 42 2.3.10.4 Phương pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate lectin 42 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu dịch chiết từ rong đỏ Betaphycus gelatinus 45 3.2 Các điều kiện để chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinus 45 3.2.1 Tỷ lệ dung môi chiết 45 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến trình chiết 47 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian chiết 48 3.3 Tinh chế lectin 49 3.3.1 Khảo sát nồng độ ethanol để kết tủa lectin 49 3.3.2 Tinh lectin sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 50 3.3.3 Tinh lectin sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 51 3.3.4 Phân tích độ tinh xác định trọng lượng phân tử lectin phương pháp điện di SDS-PAGE 52 3.3.5 Kết tổng hợp trình tinh lectin từ rong Betaphycus gelatinus 53 3.4 Kết xác định đặc tính lý, hóa lectin từ rong B gelatinus 54 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính NKHC lectin 54 3.4.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính NKHC lectin 55 3.4.3 Ảnh hưởng ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC lectin 56 3.4.4 Khả liên kết carbohydrate lectin 57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tên đầy đủ CP DC DCT HC HTR HTTS NKHC A MAC Chế phẩm Dịch chiết Dịch chiết thô Hồng cầu Hoạt tính riêng Hoạt tính tổng số Ngưng kết hồng cầu Độ hấp thụ nồng độ nhỏ nhất gây ngưng kết hồng cầu Kỹ thuật điện di gel polyacrylamide có diện SDS SDS-PAGE APS EDTA PBS TEMED Dung dịch đệm phosphate chứa muối natri clorua Tiếng Anh Absorption minimum agglutination concentration Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis Ammonium persulfate Ethylene diamine tetraacetic acid Phosphate buffer saline N,N,N',N'-Tetramethyl ethylenediamin DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh lectin từ rong biển 16 Bảng 1.2 Cấu trúc số lectin từ rong biển 21 Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học lectin từ rong biển 22 Bảng 1.4 Các phương pháp tinh chế lectin 26 Bảng 2.1 Các thiết bị chính sử dụng thí nghiệm 29 Bảng 2.2 Các loại đường monosaccarit glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate lectin 42 Bảng 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu dịch chiết thô từ rong đỏ B gelatinus với dạng hồng cầu khác 45 Bảng 3.2 Kết tinh lectin từ rong Betaphycus gelatinus từ 400 gam rong thô 53 Bảng 3.3 Ảnh hưởng ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC lectin từ rong Betaphycus gelatinus 57 Bảng 3.4 Nồng độ đường glycoprotein nhỏ nhất có khả ức chế hoạt tính NKHC lectin từ rong Betaphycus gelatinus 58 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 2.1 Rong B gelatinus 28 Hình 2.2 Qui trình nghiên cứu tổng quát dự kiến 33 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ ngun liệu/ dung mơi chiết thích hợp 34 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung mơi chiết thích hợp 35 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết thích hợp 36 Hình 3.1 Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi chiết đến HTTS HTR lectin46 Hình 3.2 Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến HTTS HTR lectin 47 Hình 3.3 Ảnh hưởng thời gian chiết đến HTTS HTR lectin 48 Hình 3.4 Ảnh hưởng nồng độ % ethanol đến HTTS, HTR hiệu suất thu hồi lectin 49 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn tương quan giá trị A 280 nm hoạt tính NKHC theo thứ tự phân đoạn trình sắc ký trao đổi ion DEAE – Sepharose 50 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (  = 280nm) hoạt tính NKHC phân đoạn trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 51 Hình 3.7 Điện di lectin từ rong đỏ B.gelatinus Dùng gel polyacrylamide 12,5 % (SDS –PAGE) Các dãi protein nhuộm với Coomassie Brilliant blue R-250 52 Hình 3.8 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính NKHC lectin từ rong B gelatinus 54 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính NKHC lectin từ rong B gelatinus 55 Hình 3.10 Lectin từ rong đỏ B gelatinus liên kết với gốc đường mannose thể hình chữ nhật 60 69 Okamoto R., Hori K., Miyazawa K., Ito K., (1990), Isolation and characterization of a new hemagglutinin from the red alga Gracilaria bursapastoris,Experientia, 46, pp 975–977 60 Ainouz I.L., Sampaio A.H., Freitas A.L.P., Benevides N.M.B.B., Mapurunga S., (1995), Comparative study on hemagglutinins from the red algae Bryothamnion seaforthii and Bryothamnion triquetrum,R Bras Fisiol Veg, 7, pp 15–19 61 Kawakubo A., Makino H., Hirohara H., Hori K., (1997), The marine red alga Eucheuma serra J Agardh, a high yielding source of two isolectins, Journal of Applied Phycology, 9, pp 331-338 62 Nagano C.S., Moreno F.B.M.B., Bloch C., Prates M.V., Calvete J.J., Sampaio S.S., Farias W.R.L., Tavares T.D., Nascimento K.S., Grangeiro T.B., Cavada B.S., Sampaio A.H., (2002), Purification and characterization of a new lectin from red marine alga Hypnea musciformis Protein Pept Lett, 9, pp 159–165 63 Mori T., O’Keefe B.R., Sowder R.C., Bringans S., Gardella R., Berg S., Cochran P., Turpin J.A., Buckheit R.W., McMahon J.B., Boyd M.R., (2005), Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV in activating protein, from the red alga Griffithsia spp J Biol Chem, 280, pp 9345–9353 64 Moulaei T., Shenoy S.R., Giomarelli B., Thomas C., McMahon J.B., Dauter Z., O’KeefeB.R., Wlodawer A., (2010), Monomerization ofviral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIVactivity Structure,18, pp 1104– 1115 65 Moulaei T., Alexandre K.B., Shenoy S.R., Meyerson J.R., Krumpe L.R., Constantine B., Wilson J., Buckheit R.W Jr., McMahon J.B., Subramaniam S., Wlodawer A., O'Keefe B.R., (2015),Griffithsin tandemers: flexible and potent lectin inhibitors ofthe human immunodeficiency virus, Retrovirology, 12, p6 66 Molchanova V., Chernikov O., Chikalovets I., Lukyanov P., (2010), Purification and partial characterization of the lectin from the marine alga Tichocarpus crinitus (Gmelin) Rupr (Rhodophyta),Botanica Marina, 53, pp 69–78 59 70 Kamiya H., Ogata K., Hori K., (1982), Isolation and characterization of a new agglutinin inthe red alga Palmaria palmata(L) O Kuntze, Botanica Marina, 25, pp 537–540 68 Sampaio A.H., Rogers D.J., Barwell C.J., Saker-Sampaio S., Nascimento K.S., Nagano C.S., Farias W.R.L., (2002), New affinity procedure for the isolation and further characterization of the blood group B specific lectin from the redmarine alga Ptilotaplumosa JAppl Phycol, 14, pp 489–495 69 Shiomi K., Yamanaka H., Kikuchi T., (1981), Purification and physiochemical properties of a hemagglutinin (GVA-1) in the red alga Gracilaria verrucosa, Nippon Suisan Gakkaishi, 47, pp 1079–1084 70 Le Dinh Hung, Hori K., Huynh Quang Nang, Tran Kha, Le Thi Hoa, (2009c),Seasonal changes in growth rate, carrageenan yield and lectin content in the red alga Kappaphycus alvarezii cultivated in Camranh Bay, Vietnam,J Appl Phycol,21, pp 265-272 71 Shiomi K., Kamiya H., Shimizu Y., (1979), Purification and characterization of an agglutinin in the red alga Agardhiella tenera, Biochim Biophys Acta, 576, pp 118–127 72 Kamiya H., Shiomi K., Shimizu Y., (1980), Marine biopolymers with cell specificity-III in the red algae Cystoclonium purpureum: isolation and characterization, J Nat Prod, 43, pp 136–139 73 Boonsri N., Rudtanatip T., Withyachumnarnkul B., Wongprasert K., (2017), Protein extract from red seaweed Gracilaria fisheri prevents acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) infection in shrimp, J Appl Phycol, 29, pp 1597–1608 74 Kawakubo A., Makino H., Ohnishi J., et al, (1999), Occurrence of highly yielded lectins homologous within genus Eucheuma,J Appl Phycol, 11, pp 149–56 75 Kakita H., Fukuoka S., Obika H., Li Z.R., Kamishima H., (1997), Purification and properties of a high molecular weight hemagglutinin from the red alga Gracilaria verrucosa, Bot Mar, 40, pp 241–247 67 71 Kakita H., Fukuoka S., Obika H.,Kamishima H., (1999), Isolation and characterisation of a fourth hemagglutinin from the red alga, Gracilaria verrucosa, from Japan, J Appl Phycol, 11, pp 49–56 77 Rogers D.J., Fish B., Barwell C.J., (1990), Isolation and properties of lectins from two red marine algae: Plumaria elegans and Ptilota serrata In: BogHansen TC, Freed DLJ (eds) Lectins: biology, biochemistry, clinical biochemistry St Louis, Sigma Chemical Company, pp 49–52 78 Ram Sarup Singh & Amandeep Kaur Walia, (2018), Lectins from red algae and their biomedical potential,J Appl Phycol, 30, pp 1833-1858 DOI 10.1007/s10811-017-1338-5 79 Ziolkowska N.E., Keefe B.R., Mori T., Zhu C., Giomarelli B., Vojdani F., Palmer K.E., McMhon J., Wlodawer A., (2006), Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding Structure, 14, pp 1127–1135 80 Ziolkowska N.E., Shenoy S.R., O’Keefe B.R., McMohan J.B., Palmer K.E., Dwek R.A., Wormald M.R., Wlodawer A., (2007b), Crystallographic, thermodyanamic, and molecular modelling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin, Proteins: Struct Funct Bioinf, 67, pp 661–670 81 Ziolkowska N.E., Shenoy S.R., O’Keefe B.R., Wlodawer A., (2007a), Crystallographic studies of the complexes of antiviral protein griffithsin with glucose and N-acetylglucosamine, Protein Science, 16, pp 1485–1489 82 Anam C., Chasanah E., Perdhana B.P., Fajarningsih N.D., Yusro N.F., Sari A.M., Nursiwi A., Praseptiangga D.,Yunus A., (2017b), Cytotoxicity of crude lectins from red macro algae from the southern coast of Java island, Gunung Kidul Regency, Yogyakarta, Indonesia IOP Conf Ser: Mater Sci Eng, 193:012017 83 Neves S.A., Freitas A.L.P., Souza B.W.S., (2007), Antinociceptive properties in mice of a lectin isolated from the marine alga Amansia multifida Lamouroux Braz J Med Biol Res, 40, pp 127- 34 84 Conrado F.M.,Furtado L.E.T.A., Teixeira A.H.,Coutinho N.L.P.,Sampaio A.H., Cavada B.S., Bezerra M.M., Silva A.A.R., Barbosa F.C.B.B., Chaves 76 72 H.V., Filho G.C., Pinto V.P.T., (2012),Erythrina velutina and Bryothamnion seaforthii lectins binding to proteins of primary central nervous system tumors, Journal of Cancer Research and Experimental Oncology, 41, pp 21– 26 85 Nascimento-Neto L.G., Carneiro R.F., da Silva S.R., da Silva B.R., Arruda F.V.S., Carneiro V.A., Nascimento K.S., Saker-Sampaio S., da Silva V.A Jr., Porto A.L.F., Cavada B.S., Sampaio A.H., Teixeira E.H., Nagano C.S., (2012), Characterization of isoforms of the lectin isolated from the red algae Bryothamnion seaforthii and its pro-healing effect, Mar Drugs, 10, pp 1936–1954 86 Nascimento A.S.F., Serena S., Beloqui A., Arda A., Sampaio A.H.,Walcher J., OttD., Unverzagt G., Reichardt N-C., Jimenez-Barbero J., Nascimento K.S., Imberty A.,Cavada B.S., Varrot A., (2015), Algal lectin binding to core (α1-6) fucosylated N-glycans: structural basis for specificity and production of recombinant protein,Glycobiol, 6, pp 607–616 87 Liao W.R., Lin J.Y., Shieh W.Y., Jeng W.L., Huang R., (2003), Antibiotic activity of lectins from marine algae against marine vibrios, J Ind Microbiol Biotech, 30, pp 433–439 88 Barton C, Kouokam JC, Hurst H, Palmer KE (2016) Pharmaco kinetics of the antiviral lectin griffithsin administered by different routes indicates multiple potential uses,Viruses, 8, p12 89 Kouokam J.C., Lasnik A.B., Palmer K.E., (2016), Studies in a murine model confirm the safety of Griffithsin and advocate its further development as a microbicide targeting HIV-1 and other enveloped viruses,Viruses, 8, p 311 90 Nixon B., Stenfanidor M., Mesquitai M.M., Fakioglu E., Segarra T., Rohan L., Halford W., Palmer K.E., Herold B.C., (2013),Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread,J Virol, 87, pp 6257–6269 91 Levendosky K., Mizenina O., Martinelli E., Jean-Pierre N., Kizima L., Rodriguez A., Kleinbeck K., Bonnaire T., Robbiani M., Zydowsky T.M., O’Keefe B.R., Fernández-Romero J.A., (2015),Griffithsin and carrageenan 73 combination to target HSV-2 and HPV,Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 59, pp 7290–7298 92 Meuleman P., Albecka A., Belouzard S., Vercauteren K., Verhoye L., Wychowski C., Roels G.L., Palmer K.E., Dubuisson J., (2011), Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus,Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 55, pp 5159–5162 93 Takebe Y., Saucedo C.J., Lund G., Uenishi R., Hase S., Tsuchiura T., Kneteman N., Ramessar K., Tyrrell D.L., Shirakura M., Wakita T., McMahon J.B., O'Keefe B.R., (2013), Antiviral lectins from red and blue-green algae show potent in vitro and in vivo activity against hepatitis C virus, PLoS One, 8, pp e64449 94 O’Keefe B.R., Giomarelli B., Barnard D.L., Shenoy S.R., Chan P.K.S., McMahon J.B., Palmer K.E., Barnett B.W., Meyerholz D.K., WohlfordLenane C.L., McCray P.B., (2010), Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein Griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae,Journal of Virology,84, pp 2511–2521 95 Perdhana B.P., (2017), Cytotoxicity and antibacterial effects of crude lectin fraction bioactive compound of red macroalgae from the Southern Coast of Java island, Gunungkidul regency Dissertation, Sebelas Maret University, Surakarta, Yogyakarta 96 Nascimento K.S., Nagano C.S., Nunes E.V., Rodrigues G.V., Calvete J.J.,Saker S., Sampaio W.R.L., Farias S.A.H., (2006), Isolation and characterization of a new agglutinin from red marine alga Hypnea cervicornis J Agardh,Biochem Cell Biol, 84, pp 49–54 97 Okuyama S., Nakamura-Tsuruta S., Tateno H., Hirabayashi J., Matsubara K., Hori K., (2009), Strict binding specificity of small-sized lectins from the red marine alga Hypnea japonica for core (α-1, 6) fucosylated N-glycans, Biosci Biotechnol Biochem, 73, pp 912–920 98 Melo V.M.M., Medeiros D.A., Rios E.J.B., Castelar L.L.M., Carvalho A de F.F.U., (1997), Antifungal properties of proteins (agglutinins) from the red alga Hypnea musciformis (Wulfen) Lamouroux, Bot Mar, 40, pp 281–284 74 Silva L.M.C.M., Lima V., Holanda M.L., Pinheiro P.G., Rodrigues J.A.G., Lima M.E.P., Benevides N.M.B., (2010), Antinociceptive and antiinflammatory activities of lectin from marine red alga Pterocladiella capillacea,Biol Pharm Bull, 33, pp 830–835 100 Abreu T.M., Silva L.M.C.M., Vanderlei E.S.O., de Melo C.M.L., Pereira V.R.A., Benevides N.M.B., (2012), Cytokine production induced by marine algae lectins in BALB/c mice splenocytes,Protein Pept Lett, 19, pp 975–981 101 Abreu T.M., Ribeiro N.A., Chaves H.V., Jorge R.J., Bezerra M.M., Monteiro H.S., Vasconcelos I.M., Mota ÉF., Benevides N.M., (2016), Antinociceptive and anti-inflammatory activities of the lectin from marine red alga Solieria filiformis,Planta Med, 82, pp 596–605 102 Holanda M.L., Melo V.M.M., Silva L.M.C.M., Amorim R.C.N., Pereira M.G., Benevides N.M.B., (2005), Differential activity of a lectin from Solieria filiformis against human pathogenic bacteria Braz J Med Biol Res, 38, pp 1769–1773 103 Neumann G., Kawaoka Y., (2011), The first influenza pandemic of the new millennium,Influenza Other Respir Viruses, 5, pp 157–166 104 Millet J.K., Seron K., Labitt R.N., Danneels A., Palmer K.E., Whittaker G.R., Dubuisson J., Belouzard S., (2016), Middle East respiratorysyndrome corona virus infection is inhibited by griffithsin,Antivir Res, 133, pp 1–8 105 Link M.P., Goorin A.M., Horowitz M., Meyer W.H., Belasco J., Baker A., Ayala A., Shuster J., (1991), Adjuvant chemotherapy of high-grade osteosarcoma of the extremity: updated results of the multi institutional osteosarcoma study,Clin Orthop Relat Res, 270, pp 8–14 106 Stastny J.J., Gupta T.K., (1994), Isolation and analysis of lectin-reactive sarcoma-associated membrane glycoproteins,Anticancer Res, 14, pp 587– 591 107 Vasconcelos M.A., Arruda F.V.S., Carneiro V.A., Silva H.C., Nascimento K.S., Sampaio A.H., Cavada B., Teixeira E.H., Henriques M., Pereiro M.O., (2014), Effect of algae and plant lectins on planktonic growth & biofilm formation in clinically relevant bacteria and yeasts,Biomed Res Int, 2014, p 365272 99 75 108 Nang H.Q., Dinh N.H., (1998), The seaweed resources of Vietnam In: Critchley AT, Ohno M (eds) Seaweed resources of the world, JICA, Japan, pp 62–69 109 Dinh Thanh Trung, Vo Thi Dieu Trang, Ngo Thi Duy Ngoc, Phan Thi Hoai Trinh, Tran Thi Hai Yen, Le Dinh Hung, (2017), Haemagglutination activity of the extracts from some Vietnam marine invertebrates,Vietnam J Biotechnol, 15(4), pp 691 – 701 110 Le Dinh Hung, Ngo Thi Duy Ngoc, Kanji Hori (2013) Isolation and characterization of novel lectins from the red alga Gracilaria salicornia Vietnam J Biotechnol 11(4): 743 - 753 111 Le Dinh Hung, Tran Thi Hai Yen, Dinh Thanh Trung (2018a) Characterization of O-glycan binding lectin from the red alga Hydropuntia eucheumatoides Vietnam J Biotechnol 16(4): 687-696 112 Le Dinh Hung, Bui Minh Ly, Vo Thi Hao, Dinh Thanh Trung, Vo Thi Dieu Trang, Phan Thi Hoai Trinh, Ngo Thi Duy Ngoc, Thai Minh Quang (2018b) Purifcation, characterization and biological effect of lectin from the marine sponge Stylissa flexibilis (Lévi, 1961) Com Biochem Physiol Part B 216: 32 - 38 113 Le Dinh Hung, Hirayama M., Hori K., (2016), Cloning and characterizing cDNA sequences coding high-mannose N-glycan binding lectins from cultivated red algae Eucheuma denticulatum and Kappaphycus striatum,Vietnam J Biotechnol,14, pp 327-336 114 Le Dinh Hung, Le Thi Hoa, Le Nhu Hau, Dinh Thanh Trung, (2019), The lectin accumulation, growth rate, carrageenan yield, and quality from the red alga Kappaphycus striatus cultivated at Camranh Bay, Vietnam,J Appl Phycol, 31, pp 1991 - 1998 115 Hori K., Matsubara K., Miyazawa K., (2000), Primary structures of two hemagglutinins from the marine red alga, Hypnea japonica,Biochim Biophys Acta, 1474, pp 226–236 116 Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J., (1951), Protein measurement with the Folin phenol reagent, J Biol Chem, 193, pp 265–275 76 117 LaemmLi U.K., (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 Nature, 227, pp 680–685 118 Zacharius R.M., Zell T.E., Morrison J.H., Woodlock J.J., (1969), Glycoprotein staining following electrophoresis on acrylamide gels, Anal Biochem, 30, pp 148–152 119 Xiong C., Li W., Liu H., Zhang W., Dou J., Bai X., Du Y., Ma X., (2006), A normal mucin binding lectin from the sponge Craniella australiensis Comp Biochem Physiol C, 143, pp 9–16 120 Trương Văn Châu (2004), Một số tính chất hóa sinh Lectin mít na, Tạp chí khoa học-ĐHSP Hà Nội, 4, pp.83-87 121 Mu J., Hirayama M., Sato Y., Morimoto K., Hori K., (2017), A novel high-mannose specific lectin from the green alga Halimeda renschii exhibits a potent anti-influenza virus activity through high-affinity binding to the viral hemagglutinin,Mar Drugs doi:10.3390/md15080255 122 Tsuji T., Yamamoto K., Irimura T., Osawa T., (1981), Structure of carbohydrate unit A of porcine thyroglobulin,J Biochem, 195, pp 691-699 123 Yamamoto K., Tsuji T., Irimura T., Osawa T., (1981), The structure of carbohydrate unit B of porcine thyroglobulin,J Biochem, 195, pp 701-713 124 Sato Y., Hirayama M., Morimoto K., et al, (2011b), High mannosebinding lectin with preference for the cluster of a 1–2 mannose from green alga Boodlea coacta is a potent entry inhibitor of HIV-1 and influenza viruses,J Biol Chem, 286, pp 19446–58 PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry Bảng Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) Nồng độ BSA (µg/mL) OD1 20 40 60 80 100 120 0,094 0,164 0,225 0,264 0,325 0,383 OD750 OD2 OD3 OD 0,099 0,161 0,229 0,265 0,321 0,385 0,097 0,165 0,226 0,261 0,321 0,384 0,097 0,163 0,227 0,263 0,322 0,384 Hình Đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry PHỤ LỤC B: Xác định trọng lượng phân tử protein phương pháp điện di SDS-PAGE Bảng Giá trị Rf lg M protein thang chuẩn Trọng lượng phân tử M(Da) 116000 97400 69000 55000 36500 29000 20100 14300 6500 Khoảng cách di chuyển vạch protein D (cm) Rf lg M 0.3 0.5 0.9 1.5 2.1 2.8 3.7 4.4 5.3 0.05 0.083 0.15 0.25 0.35 0.467 0.617 0.733 0.883 5.064 4.989 4.839 4.740 4.562 4.462 4.303 4.155 3.813 Hình Đồ thị tương quan lgM Rf protein thang chuẩn PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT LECTIN TỪ RONG BETAPHYCUS GELATINUS Bảng Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi chiết đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng lectin Tỷ lệ chiết Thể tích (ml) HTTS (HU) Protein tổng HTR số (mg) (HU/mg) 1:3 1:4 2,5 3,2 10 14 2,34 2,93 4,278 4,372 1:5 1:6 4,2 5,4 16,8 10,8 2,21 1,59 7,619 6,780 Bảng Ảnh hưởng nồng độ ethanol đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng lectin Nồng độ Ethanol Thể tích (ml) HTTS (HU) Protein tổng số (mg) HTR (HU/mg) 0% 10% 5 540 640 2,360 2,660 228,8 240,6 20% 30% 40% 5 640 320 113 2,420 1,86 1,46 264,5 172,0 77,40 Bảng Ảnh hưởng thời gian chiết (giờ) đến hoạt tính tổng số hoạt tính riêng lectin Thời gian (giờ) Thể tích (ml) HA HTTS (HU/ml) (HU) Protein tổng số (mg) MAC HTR (mg/HU) (HU/mg) 6 32 64 6,56 7,36 0,034 0,019 192 384 29,26 52,2 6 64 64 384 384 11,33 14,91 0,030 0,039 33,9 25,8 PHỤ LỤC D: KẾT QUẢ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH KẾT TỦA LECTIN TỪ RONG BETAPHYCUS GELATINUS Bảng Ảnh hưởng nồng độ % ethanol đến hoạt tính tổng số, hoạt tính riêng hiệu suất thu hồi lectin Nồng độ % Ethanol Hoạt tính tổng Hoạt tính riêng Hiệu suất thu số (HU) (HU/mg) hồi (%) 70% 32 11,236 12,5 80% 90% 64 16 17,520 3,076 25 6,25 DC lectin thô 256 89,199 100 PHỤ LỤC E: KẾT QUẢ SẮC KÝ Kết sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose Bảng Kết A280 nm hoạt tính ngưng kết hồng cầu phân đoạn sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose Phân đoạn A 280nm HA Phân đoạn A 280 nm 0 0.021 0.027 0.018 0.019 0.023 0 0 0 0 33 34 35 36 37 38 39 40 0 0 0 0 HA 0 0 0 0 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 0.026 0.013 0.007 0.004 0.001 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 0 0 0.073 0.748 0.205 0.040 0.012 0.004 0.001 0.001 0 0 0 0 0 0 0 0 16 64 16 0 0 0 0 0 0 0 Kết sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 Bảng Kết A280 nm hoạt tính ngưng kết hồng cầu phân đoạn sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 Phân đoạn A280 nm HA Phân đoạn A280 nm HA 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 0.008 0.001 0.001 0 0 0 0 0 0 0 0 0.005 0.012 0.010 0.009 0.007 0.006 0.008 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 0.013 0.020 0.032 0.042 0.047 0.054 0.063 0.069 0.072 0.071 0.066 0.058 0.050 0.042 0.036 0.031 0.025 0.018 0.014 0.008 0.008 0.005 0.004 0.001 0 0 4 8 8 8 8 4 0 0 0 0 0 PHỤ LỤC F:KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH LÝ, HĨA CỦA LECTIN Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu lectin từ rong B gelatinus Nhiệt độ (0C) 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu % HU/ml 100 100 100 100 100 50 0 25 25 25 25 25 24 0 Bảng 10 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu lectin từ rong B gelatinus pH 10 Hoạt tính ngưng kết hồng cầu % HU/mL 100 100 100 100 100 100 100 100 25 25 25 25 25 25 25 25 ... cứu đề tài: Tinh chế phân tích đặc tính lectin từ rong biển Betaphycus gelatinus Mục tiêu đề tài: Dựa kết phân tích đặc tính hoạt tính ngưng kết hồng cầu lectin từ rong biển B gelatinus hướng... DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Lê Thị Đoan Thục TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS. .. MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh lectin từ rong biển 16 Bảng 1.2 Cấu trúc số lectin từ rong biển 21 Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học lectin từ rong biển 22 Bảng 1.4 Các