Ly trích, khảo sát hàm lượng và phân tích đặc tính sinh, hóa, lý của tinh dầu sả (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf)”

  BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP LY TRÍCH, KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH SINH, HĨA, LÝ CỦA TINH DẦU SẢ (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện: HUỲNH NGUYỄN TRƯỜNG AN Niên khóa: 2011- 2013 Tháng 12/2013   BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP LY TRÍCH, KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH SINH, HĨA, LÝ CỦA TINH DẦU SẢ (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf) Hướng dẫn khoa học TS HUỲNH VĂN BIẾT Sinh viên thực HUỲNH NGUYỄN TRƯỜNG AN ThS LÊ VĂN HUY Tháng 12/2013   LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm, ban chủ nhiệm môn công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học Môi Trường trường Đại học Nông Lâm tồn thể q thầy giảng dạy truyền đạt kiến thức cho em thời gian em theo học trường TS Huỳnh Văn Biết tận tình hướng dẫn cho em suốt trình thực đề tài hồn thành khóa luận tốt nghiệp Thạc sĩ Lê Văn Huy, kỹ sư nhân viên phòng thực hành hóa dược tận tình giúp đỡ, hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành tốt cơng việc q trình thực đề tài Cảm ơn toàn thể bạn lớp LT11SH, bạn thực tập Viện Công Nghệ Sinh Học Mơi Trường góp ý, chia sẻ kinh nghiệm, khó khăn với tơi q trình học tập thực đề tài tốt nghiệp Cuối xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ nuôi dưỡng, ủng hộ, động viên, tạo điều kiện tốt cho ngày hôm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2013 Huỳnh Nguyễn Trường An i      TĨM TẮT Đề tài: “Ly trích, khảo sát hàm lượng phân tích đặc tính sinh, hóa, lý tinh dầu sả (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf)” thực nhằm mục đích hiểu rõ thành phần hóa học, hoạt tính hóa sinh tinh dầu sả để phát triển, ứng dụng lĩnh vực hóa mỹ phẩm thực phẩm Tinh dầu sả ly trích từ sả tươi phương pháp lôi nước có hàm lượng 0,8 % Một số thành phần tinh dầu sả phân tích kỹ thuật sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS như: Myrcene (10,81 %), Neral (32,39 – 40,34 %), Geraniol (7,04 %) Đề tài lần ghi nhận diện chất là: Geranic acid (0,07 %), Phenol (0,15 %), Perillene (0,08 %), Cyclohexan (1,01 %), Bicyclo (0,86 %), Junipene (0,13 %), Thujone (1,49 %) có mặt thành phần tinh dầu sả Áp dụng tiêu chuẩn Việt Nam với số hiệu 8444: 2010, 8450: 2010, 8451: 2010, 8460: 2010, việc xác định đặc tính hóa lý tinh dầu sả tương ứng với tiêu trị số tỷ trọng, trị số axit, trị số ester đánh giá cảm quan tinh dầu Kết nghi nhận tinh dầu sả có giá trị: tỷ trọng 0,87; trị số axit 4,77; trị số ester 11,69 Tinh dầu sả tồn trạng thái lỏng, màu vàng suốt, có mùi thơm đặc trưng sả có vị the cay Về hoạt tính hóa sinh, thử nghiệm khả kháng khuẩn E coli, S aureus kháng nấm A flavus, A niger tinh dầu sả Kết nhận cho thấy nồng độ tinh dầu 1/10 pha lỗng dung mơi DMSO, tinh dầu sả có khả ức chế phát triển E coli, S aureus, A flavus A niger Trong thí nghiệm khảo sát hoạt tính chống oxy hóa, giá trị IC50 cho thấy nồng độ tinh dầu sả có khả ức chế 50% gốc tự DPPH 13,77 mg/ml   ii      SUMMARY   Thesis: “Extraction, determination of content, and analysis of biocharacteristics as well as physico – chemical properties of lemongrass essential oil (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf)" was performed The aim of this study is to determine the chemical composition, biochemical activity of lemongrass essential oils in order to develop applications in the field of cosmetics and food Lemongrass essential oil was extracted from fresh lemongrass leaves by the hydrodistillation method The fresh weight oil content was 0.8 % Gas chromatography - Mass Spectrometry (GCMS) analysis showed that lemongrass oil contained the following main compounds: Myrcene (10.81%), Neral (32.39 to 40.34%), Geraniol (7.04%) This research also detected the list of compounds that had not been found in the component of lemongrass oil: Geranic acid (0,07 %), Phenol (0,15 %), Perillene (0.08 %), Cyclohexan (1.01 %), Bicyclo (0.86 %), Junipene (0.13 %), Thujone (1.49 %) The specific gravity, acid value, ester value, and sensory evaluation of the lemongrass oil were determined as described in the Vietnamese Standards such as: 8444: 2010, 8450: 2010, 8451: 2010, 8460: 2010, respectively The Results of these studies are as follows: specific gravity 0.87; acid value 4.77; ester value 11.69 Lemongrass essential oil exists in the liquid state, transparent yellow, has unique aroma, and tastes the spiciness of lemongrass   These antibacterial and antifungal capacity of lemongrass oil were determine The result demonstrated that lemongrass essential oil possessed the ability to inhibit the growth of bacterial E coli, S aureus and fungus A flavus, A niger at the concentration of 10 % of essential oil dissolved in DMSO The antioxidant capacity of lemongrass oil was determined by DPPH radical scavenging method The IC50 value of antioxidant capacity was 13.77 mg/ml.      iii      MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn i Tóm tắt ii Summary iii Mục lục iv Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix Chương MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Yêu cầu đề tài 1.3 Nội dung thực Chương TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu chung sả 2.1.1 Đặc điểm thực vật 2.1.2 Các loài đặc trưng chi sả 2.1.3 Công dụng tinh dầu sả 2.1.4 Kỹ thuật trồng sả 2.2 Tinh dầu sả 2.2.1 Khái niệm tinh dầu sả 2.2.2 Tổng quan thành phần hóa học đặc tính tinh dầu sả 2.2.3 Phương pháp chiết xuất tinh dầu sả 2.2.3.1 Nguyên tắc chiết xuất tinh dầu 2.2.3.2 Nguyên tắc chiết xuất nước 2.2.4 Các nghiên cứu ứng dụng tinh dầu sả 2.2.4.1 Các nghiên cứu nước 2.2.4.2 Các cơng trình nghiên cứu giới 2.3 Phương pháp sắc ký khí 2.3.1 Phương pháp sắc ký khí GC iv      2.3.2 Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 2.4 Tổng quan vi sinh vật 2.4.1 Escherichia coli 2.4.2 Staphylococcus aureus 10 2.4.3 Giới thiệu Aspergillus 10 2.4.3.1 Aspergillus flavus 10 2.4.3.2 Aspergillus niger 10 2.5 Thử nghiệm khả chống oxy hóa tinh dầu sả DPPH 11 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13 3.1 Thời gian địa điểm tiến hành 13 3.2 Vật liệu, hóa chất thiết bị 13 3.2.1 Vật liệu 13 3.2.2 Chủng vi sinh vật 13 3.2.3 Hóa chất 13 3.2.4 Thiết bị dụng cụ 13 3.3 Nội dung nghiên cứu 14 3.3.1 Chiết xuất tinh dầu sả phương pháp lôi nước 14 3.3.2 Xác định hàm lượng tinh dầu ly trích 14 3.3.2.1 Ảnh hưởng nguyên liệu mẫu đến hàm lượng tinh dầu 14 3.3.2.2 Ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng tinh dầu 15 3.3.3 Tính chất vật lý 15 3.3.3.1 Xác định trị số tỷ trọng 15 3.3.3.2 Xác định trị số axit 16 3.3.3.3 Xác định trị số ester 17 3.3.4 Đánh giá cảm quan tinh dầu thành phẩm 18 3.3.4.1 Xác định màu sắc 18 3.3.4.2 Xác định mùi 18 3.3.4.3 Xác định vị 18 3.3.5 Phân tích thành phần chất tinh dầu sả 18 3.3.6 Chỉ tiêu hóa sinh 19 3.3.6.1 Khảo sát khả kháng khuẩn tinh dầu sả 19 3.3.6.2 Khảo sát khả kháng nấm tinh dầu sả 20 v      3.3.6.3 Khảo sát khả chống oxy hóa tinh dầu sả DPPH 20 3.4 Phương pháp xử lý số liệu 22 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 4.1 Hàm lượng tinh dầu 23 4.1.1 Ảnh hưởng nguyên liệu 23 4.1.2 Ảnh hưởng thời gian 24 4.2 Tính chất vật lý tinh dầu sả 25 4.2.1 Tỷ trọng 25 4.2.2 Trị số axit 26 4.2.3 Trị số ester 27 4.3 Đánh giá cảm quan tinh dầu sả thành phẩm 27 4.4 Thành phần hóa học tinh dầu sả 28 4.5 Chỉ tiêu hóa sinh tinh dầu sà 33 4.5.1 Khả kháng khuẩn 33 4.5.2 Khả kháng nấm 36 4.5.3 Khảo sát khả chống oxy hóa tinh dầu sả DPPH 37 4.5.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa 37 4.5.3.2 Kết IC50 40 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 42 5.1 Kết luận 42 5.3 Đề nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC vi      DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT   AV: Acid value Ctv: Cộng tác viên CFU: Đơn vị khuẩn lạc (Colony – Forminh Unit) DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DMSO: Dimethylsulfuoxid EV: Ester value HTCO: Hoạt tính chống oxy hóa IC50: Inhibitory Concention 50 MeOH: Methanol TSB: Trypticase Soy both TSA: Trypticase Soy Agar TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam OD: Optical Density PGA: Potato Glucose Agar                   vii      DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Phần trăm hàm lượng chất tinh dầu sả Cymbopogon citratus Bảng 3.1 Khảo sát yếu tố thời gian ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu ly trích 15 Bảng 3.2 Phiếu khảo sát đánh giá cảm tinh dầu sả thành phẩm 18 Bảng 3.3 Cách pha thử nghiệm DPPH 21 Bảng 4.1 Kết ảnh hưởng nguyên liệu đến hàm lượng tinh dầu 23 Bảng 4.2 Kết ảnh hưởng thời gian đến hàm lượng tinh dầu ly trích mẫu mẫu củ 24 Bảng 4.3 Kết khối lượng bình định mức, nước tinh dầu 26 Bảng 4.4 Kết trị số axit tinh dầu sả 26 Bảng 4.5 kết trị số ester tinh dầu sả 27 Bảng 4.6 Kết khảo sát ý kiến tiêu đánh giá cảm quan tinh dầu sả .27 Bảng 4.7 Thành phần hóa học tinh dầu sả 32 Bảng 4.8 Kết đường kính vòng kháng khuẩn tinh dầu sả 33 Bảng 4.9 Kết đường kính vòng kháng nấm tinh dầu sả 35 Bảng 4.10 Giá trị OD, % HTCO Vitamin C tinh dầu sả 39 viii      a   d   b   c   Hình 4.12 Hình quan sát vòng kháng nấm Aspergillus flavus tinh dầu sả sau ngày nồng độ (a) 1/2, (b) 1/4, (c) 1/8, (d) 1/10 4.5.3 Khảo sát khả chống oxy hóa tinh dầu sả DPPH 4.5.3.1 Hoạt tính chống oxy hóa tinh dầu sả Hình 4.13 Thử nghiệm phản ứng tiếp nhận gốc DPPH tự vitamin C tương ứng nồng độ   (1): 0,31 mg/ml; (2): 0,25 mg/ml; (3): 0,22 mg/ml; (4): 0,13 mg/ml; (5): 0,11 mg/ml; (6): 0,09 mg/ml;( 7): 0,04 mg/ml;( 8): 0,02 mg/ml 37      Hình 4.14 Thử nghiệm phản ứng tiếp nhận gốc DPPH tự tinh dầu sả tương ứng nồng độ (1): 54,37 mg/ml; (2): 43,5 mg/ml; (3): 27,3 mg/ml; (4): 21,81 mg/ml; (5): 13,63 mg/ml;( 6): 10,9 mg/ml;( 7): 8,73 mg/ml;( 8): 5,43 mg/ml Thí nghiệm phát có chuyển đổi màu sắc từ ống nghiệm số đến số màu vàng sang màu tím tương ứng với giảm dần nồng độ mẫu cần khảo sát Trong trình phản ứng mẫu DPPH nồng độ chất giảm lần so với nồng độ gốc ban đầu tổng thể tích phản ứng ml pha loãng mẫu MeOH Đối với Vitamin C, kết đo giá trị OD (độ hấp thu quang học) bước sóng 517 nm (bảng 4.10) cho thấy nồng độ Vitamin C giảm dần từ 0,31 mg/ml – 0,04 mg/ml OD lại tăng từ 0,06 - 0,43 dẫn đến % hoạt tính chống oxy hóa giảm dần 0,87  –  0,11 Kết thể tương tự thực đo giá trị OD tinh dầu sả, nồng độ tinh dầu giảm từ 27,3 mg/ml – 8,725 mg/ml OD tăng từ 0,21 – 0,26 % hoạt tính chống oxy hóa giảm dần từ 0,58 – 0,47.  38      Bảng 4.10 Giá trị OD, % HTCO Vitamin C tinh dầu sả Tên ống Nồng độ (mg/ml) nghiệm Vitamin C OD ( λ = 517 nm) Tinh dầu sả Vitamin C % HTCO Tinh dầu Vitamin sả C Tinh dầu sả 0,31 54,37 0,06 0,24 0,87 0,50 0,26 43,5 0,12 0,22 0,76 0,55 0,22 27,3 0,19 0,21 0,61 0,57 0,13 21,81 0,33 0,22 0,32 0,54 0,11 13,63 0,34 0,24 0,29 0,51 0,09 10,9 0,38 0,25 0,22 0,48 0,04 8,73 0,43 0,26 0,11 0,47 0,02 5,43 0,41 0,25 0,14 0,30 control 0 0 0,49 Dựa kết xây dựng phương trình tuyến tính thể mối tương quan nồng độ Vitamin C tinh dầu sả với hoạt tính chống oxy hóa sử dụng DPPH nồng độ 70 µM HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA (%) VITAMIN C 100 80 60 40 y = 292.1x ‐ 2.392 R² = 0.999 20 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 NỒNG ĐỘ (mg/ml) Hình 4.15 Đồ thị biểu mối quan hệ % HTCO nồng độ Vitamin C DPPH 70 µM Kết hình 4.15 cho thấy rằng, phương trình tuyến tính nồng độ 0,31 mg/ml; 0,26 mg/ml; 0,22 mg/ml; 0,11 mg/ml; 0,09 mg/ml; 0,04 mg/ml sử dụng 39      DPPH 70 µM Từ đây, tính số IC50 vitamin C dựa vào phương trình tuyến tính Sử dụng DPPH nồng độ 70 µM cho việc khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tinh dầu sả dựa vào đồ thị hình 4.16 nhận thấy phương trình tuyến tính tăng dần từ nồng độ tinh dầu sả 8,73 mg/ml; 10,9 mg/ml; 13,63 mg/ml; 21,81 mg/ml đến 27,3 mg/ml Để biết xác khả kháng oxy hóa tinh dầu sả, ta tính số IC50 dựa vào phương trình tuyến tính hình 4.16 so sánh với IC50 vitamin C HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA (%) TINH DẦU SẢ 70 60 50 40 30 20 10 y = 0.541x + 42.55 R² = 0.991 10 15 20 25 30 NỒNG ĐỘ (mg/ml) Hình 4.16 Đồ thị biểu mối quan hệ % HTCO nồng độ tinh dầu sả DPPH 70 µM 4.5.3.2 Kết IC50 Dựa vào kết hình 4.16 cho thấy phương trình tuyến tính biểu mối quan hệ % HTCO nồng độ tinh dầu sả y = 0,0054x + 0,4256 Suy giá trị IC50 = 13,77 mg/ml Đối với Vitamin C, để tính kết IC50 theo phương pháp hồi qui tuyến tính dễ dàng so sánh với IC50 tinh dầu sả Dựa vào biểu mối quan hệ % HTCO nồng độ Vitamin C, có phương trình tuyến tính sau: y = 2,9217x – 0,0239 (hình 4.15) Suy giá trị IC50 = 0,1789 mg/ml Kết IC50 cần xác định để có thề so sánh hoạt tính chống oxy hóa mẫu với Mẫu có giá trị IC50 thấp có hoạt tính chống oxy hóa mạnh 40      IC 50 (mg/ml) 16 14 12 10 13.77 0.1789 Vitamin C Tinh dầu sả Hình 4.17 So sánh IC 50 vitamin C tinh dầu sả  Kết hình 4.17 cho thấy IC50 vitamin C 0,1789 mg/ml thấp hẳn IC50 tinh dầu sả 13,77 mg/ml chứng tỏ hoạt tính chống oxy hóa Vitamin C mạnh tinh dầu sả Vậy nồng độ tinh dầu sả cần để ức chế 50% gốc tự DPPH 70 µM 13,77 mg/ml khoảng thời gian 30 phút độ hấp thu quang học 517 nm Tham chiếu với kết nghiên cứu Soares ctv, 2013 cho rằng, tinh dầu sả có giá trị IC50 = 55,7 µg/ml Chứng tỏ tinh dầu sả có khả chống oxy hóa 41      Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ   5.1 Kết luận   Tinh dầu sả ly trích từ mẫu sả tươi, sử dụng phương pháp lơi sau có hàm lượng 0,8 % Tinh dầu sả trạng thái lỏng, màu vàng nhạt, suốt, có mùi hương đặc trưng lồi sả Cymbopogon citratus với tiêu hóa lý tỷ trọng: 0,87; trị số axit: 4,77; trị số ester: 11,69 Sử dụng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC- MS, xác định có 20 chất thành phần hóa học tinh dầu sả, có số chất Myrcene (10,81%), Neral (32,39 – 40,34 %), Geraniol (7,04%) Nghiên cứu ghi nhận diện chất Geranic acid (0,07 %), Phenol (0,15 %), Perillene (0,08 %), Cyclohexan (1,01 %), Bicyclo (0,86 %), Junipene (0,13 %), Thujone (1,49 %) Khảo sát hoạt tính hóa sinh tinh dầu sả cho thấy rằng: tinh dầu sả nồng độ 1/10 pha lỗng DMSO có khả kháng khuẩn E coli, S aureus, kháng nấm A flavus, A niger với đường kính vòng kháng tương ứng 0,86  0,15 cm, 1,03  0,15 cm, 0,73  0,06 cm, 0,6  0,1 cm Tinh dầu sả có hoạt tính chống oxy hóa DPPH nồng độ 70 µM giá trị IC50 = 13,77mg/ml pha loãng dung môi MeOH 5.2 Đề nghị Mở rộng đề tài ly trích tinh dầu từ mẫu sả khác sả phơi khô sấy khô  để khảo sát hàm lượng tinh dầu tối ưu yếu tố ảnh hưởng đến q trình ly trích tinh dầu.  Thử nghiệm khả kháng lại lồi trùng vi sinh vật khác tinh dầu sả, nhằm phục vụ cho mục đích sản xuất sản phẩm mang nhiều hiệu kinh tế ứng dụng sống       42      TÀI LIỆU THAM KHẢO   Tài liệu tiếng Việt Nguyễn Văn Bá, Cao Ngọc Diệp, Nguyễn Văn Thành 2005 Giáo trình nấm học Trường đại học Cần Thơ, viện nghiên cứu phát triển Công Nghệ Sinh học.  Nguyễn Tiến Dũng 2007 Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm Đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh.  Đỗ Tất Lợi 2004 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học.  Nguyễn Ngọc Hải Nguyễn Thị Kim Loan 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà xuất Nông Nghiệp.  Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh.  Lê Ngọc Thạch 2003 Tinh dầu Nhà xuất đại học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh   Hà Duyên Từ 2006 Kỹ thuật phân tích cảm quan Nhà xuất khoa học kỹ thuật Hà Nội   Nguyễn Thị Thẩm Phan Thị Sửu 1990 Nghiên cứu tách chiết geraniol từ tinh dầu sả Palmarosa Đề tài cấp nhà nước 64C – 03 - 06 Bộ nông nghiệp công nghiệ thực phẩm Viện Công Nghiệp Thực Phẩm.  Tài liệu tiếng Anh Ansari MA, Razdan PK 1995 Relative efficacy of various oils in repelling mosquites Indian J Malariol.32 pp:104-111.  10 Akhila A 2010 Essential oil – bearing grasses, Taylor and Francis Group, LLC New York pp: 25 – 34 11 Cheel J., Theoduloz C., Rodriauez J., Guillermo S.H 2005 Free radical scavengers and antiocidants from lemongrass (Cymbopogon citratus (DC) Stapf) Instituto de Quı´mica de Recursos Naturales and Laboratorio de Cultivo Celular, Chile 12 Gbenou Joachin D., Ahounou Judith F., Akakpo Huguette B., Laleye Anatole, Yayi Ele´onore, Gbaguidi Fernand, Baba-Moussa Lamine, Darboux Raphael, 43      Dansou Pierre, Moudachirou Mansourou, Kotchoni Simeon O 2012 Phytochemical composition of cymbopogon citratus and eusealyptus citriodora essential oil and their anti_inflammatory and analysis properties on Wistar rats Springer Science and Business Media Dordrecht 13 Hüsnü Baser Can K., Gerhard Buchbauer 2010 Handbook of ESSENTIAL OILS Science, Technology, and Applications Taylor and Francis Group, LLC New York, pp: 91 – 93 14 Hamza I S., Ahmed Sundus H, Aoda Hussaine 2009 Study the antimicrobial activity of Lemon grass leaf extracts Ministry of science& Technology pp: 198 – 212 15 Jayasinha P., 1999, Lemongrass ( Cymbopogon citratus), Industrial Technology Institute (CISIR) & National Science Foundation, Sri Lanka 16 Manzoor F., Munir N., Ambreen A and Naz S 2012 Efficacy of some essential oils against American cockroach Periplaneta americana (L.) Journal of Medicinal Plants Research Vol pp: 1065-1069 17 Mahanta J J., Chutia M., Bordoloi M., Pathak M G., Adhikary R K and Sarma T C 2007 Cymbopogon citratus L essential oil as a potential antifungal agent against key weed moulds of Pleurotus spp Spawns Flavour and fragrance journal 22: 525 – 530 18 Matasyoh J C., Wagara Isabel N., Nakavuma Jesca L and Kiburai Anderson M 2010 Chemical composition of Cymbopogon citratus essential oil and its effect on mycotoxigenic Aspergillus species African Journal of Food Science: 138-142 19 Mohamed Hanaa A.R., Sallam Y.I., El-Leithy A.S., Aly Safaa E 2012 Lemongrass (Cymbopogon citratus) essential oil as affected by drying methods Annals of Agricultural Science 57, pp: 113–116 20 Negrelle R R B, Gomes E C 2007 Cymbopogon citrarus (DC.) stapf Chemical composition and biological activities Rev Bras Pl Med., Botucatu, v.9, n.1, pp: 80-92 21 Oliveira Valéria C S., Moura Daniela M S., Lopes José A D., Andrade Paulo P de, Silva Nicácio H da, Figueiredo Regina C B Q 2008 Effects of essential oils from Cymbopogon citratus (DC) Stapf, lippia sidoides cham and 44      ocimum gratissimum L on growth and ultrastructure of leishmania chagasi promastigotes Parasitol Res 104:1053–1059 22 Om P S Tej K B 2008 Analytical Methods DPPH antioxidant assay revisited, Food Chemistry 113: 1202 – 1205 23 Soares M O., Vinha Ana F., Barreira Sộrgio V P., Coutinho Filipe, Sộrgio Aires-Gonỗalves, Oliveira Maria B P P., Pires Pedro C & Castro Ana 2013 Evaluation of Antioxidant and Antimicrobial Properties of the Angolan Cymbopogon Citratus Essential Oil With a View to Its Utilization as Food Biopreservative Journal of Agricultural Science; Vol pp: 9752 – 9760 24 Torres R C 1993 Citral from Cymbopogon Citratus (DC) staf (Lemongrass) oil, Industrial Technology Development Institute Bicutan, Taguig, Metro Manila , pp: 269 – 274 25 Wijesekera R.B.O 1973 The chemical composion and analysis of citranella oil Journal of the nationl sciene council oil of Sri Lanka pp: 67 – 81   45      PHỤ LỤC Xác định nồng độ vi khuẩn phương pháp đếm sống nhỏ giọt (drop plate count) Theo phương pháp Miles Misra , 1938 Xác định nồng độ vi khuẩn phương pháp đếm phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc đĩa thạch nồng độ pha lỗng liên tiếp thời gian ni cấy 37 oC – 24 để xác định mật độ dịch vi khuẩn ban đầu Công thức tính số lượng vi khuẩn 1ml dịch mẫu nồng độ pha lỗng: A = a × 50 × h Trong đó: a : số khuẩn lạc trung bình có khu vực độ pha loãng a=   (với số khuẩn lạc khu vực độ pha loãng, n số lần lặp lại cho độ pha loãng) h : hệ số pha lỗng Tính số lượng vi khuẩn ml mẫu nguyên: lấy trung bình số lượng vi sinh vật có ml dịch mẫu n độ pha loãng khác (A1, A2, A3) Atb =   Phương pháp tiến hành Sử dụng chủng vi khuẩn: Staphylococus aureus E coli Cấy chủng vi khuẩn lên đĩa môi trường TSA, ủ đĩa 37 oC 24 Dùng que cấy vòng cấy chuyển khuẩn lạc đơn từ đĩa vào bình tam giác chứa dịch môi trường TSB lắc tăng sinh 24 điều kiện 100 vòng / phút 37 o C Hút lấy 100 µl dịch vi khuẩn sau ủ bình tam giác cho vào eppendot chứa 900 µl nước cất hấp tiệt trùng Lúc ta vi khuẩn pha loãng 10-1, pha loãng liên tiếp xuống 10-2 , 10-3 , 10-4 , 10-5 , 10-6, 10-7 , 10-8 46      Chuẩn bị đĩa môi trường TSA, đĩa chia làm phần tương ứng với độ pha loãng 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, nồng độ lặp lại ba lần Dùng micro pipet hút 20 µl dịch vi khuẩn pha loãng eppendot nhỏ giọt gọn, nhẹ cho giọt tỏa tròn vào khu vực thạch tương ứng độ pha loãng Ủ 37 oC 24 đếm khuẩn lạc mọc đĩa, tính số khuẩn lạc trung bình Bảng mật độ vi khuẩn sau thời gian 24 lắc tăng sinh Số thứ tự Chủng E coli Staphylococcus aureus Mật độ vi sinh vật (CFU/ml) 2,571×102 2,539 × 102                               47      PHỤ LỤC   Môi trường potato glucose ager (PGA) Thành phần (g/l) Khoai tây 200g Đường glucose 20g Agar 20g Nước cất 1000ml 48      PHỤ LỤC   Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm (thể tích tinh dầu thu từ sả tươi) Nghiệm thức Trung bình 1,5 1,6 1,7 1,6 1,5 1,5 Lần lặp lại 1,4 1,6 1,7 1,6 1,5 1,4 Trung bình 1,5 1,5 1,6 1,5 1,5 1,4 1,467 1,567 1,683 1,567 1,5 1,433 1,536 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu bảng A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 0.121 0.024 10.224(**) 0.0005 Within 12 0.028 0.002 Total 17 0.149 Coefficient of Variation = 3.16% Number Sum Average SD SE -1 3.00 4.400 1.467 0.06 0.03 3.00 4.700 1.567 0.06 0.03 3.00 5.050 1.683 0.03 0.03 3.00 4.700 1.567 0.06 0.03 3.00 4.500 1.500 0.00 0.03 3.00 4.300 1.433 0.06 0.03 -Total 18.00 27.650 1.536 0.09 0.02 Within 0.05 Bartlett's test Chi-square = 12.439 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.000 49      DataFile: Keyboard Function: RANGE Error Mean Square = 0.002000 Error Degrees of Freedom = 18 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.1051 s_ = 0.02582 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = Ranked Order 1.470 1.570 1.680 1.570 1.500 1.430 BC B A B BC C Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 1.680 1.570 1.570 1.500 1.470 1.430 A B B BC BC C Bảng Số liệu dùng cho xử lý thống kê thí nghiệm (Thể tích tinh dầu từ củ sả) Nghiệm thức Trung bình 1 1,1 0,8 0,5 0,4 Lần lặp lại 0,9 1,2 1,2 0,8 0,4 0,4 Trung bình 1 1,2 0,7 0,5 0,5 0,967 1,067 1,167 0,767 0,467 0,433 0,811 Bảng Bảng ANOVA thí nghiệm số liệu bảng A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob Between 1.438 0.288 57.511(**) 0.0000 Within 12 0.060 0.005 Total 17 1.498 Coefficient of Variation = 8.72% Var V A R I A B L E Number Sum No Average 50    SD SE   -1 3.00 2.900 0.967 0.06 0.04 3.00 3.200 1.067 0.12 0.04 3.00 3.500 1.167 0.06 0.04 3.00 2.300 0.767 0.06 0.04 3.00 1.400 0.467 0.06 0.04 3.00 1.300 0.433 0.06 0.04 -Total 18.00 14.600 0.811 0.30 0.07 Within 0.07 Bartlett's test Chi-square = 1.752 Number of Degrees of Freedom = Approximate significance = 0.930 DataFile: Keyboard Function: RANGE Error Mean Square = 0.005000 Error Degrees of Freedom = 18 No of observations to calculate a mean = Duncan's Multiple Range Test LSD value = 0.1662 s_ = 0.04082 at alpha = 0.010 x Original Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean = = = = = = 0.9700 B 1.070 AB 1.170 A 0.7700 C 0.4700 D 0.4300 D Ranked Order Mean Mean Mean Mean Mean Mean 51    = = = = = = 1.170 1.070 0.9700 0.7700 0.4700 0.4300 A AB B C D D ... đề tài Ly trích, khảo sát hàm lượng phân tích đặc tính sinh, hóa, lý tinh dầu sả Cymbopogon citratus (DC.) Stapf” Kết đề tài đánh giá chất lượng tinh dầu sả hàm lượng, hoạt tính hóa lý, hóa... tài: Ly trích, khảo sát hàm lượng phân tích đặc tính sinh, hóa, lý tinh dầu sả (Cymbopogon citratus (DC.) Stapf)” thực nhằm mục đích hiểu rõ thành phần hóa học, hoạt tính hóa sinh tinh dầu sả để... VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP LY TRÍCH, KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH SINH, HĨA, LÝ CỦA TINH DẦU SẢ (Cymbopogon citratus