Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng bacillus subtilis có khả năng sản sinh bacteriocin hoạt tính cao 3

20 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1 Vật liệu nghiên cứu Chế phẩm sinh học Bacillus của công ty BioSpring Việt Nam (16212 Bình Lợi, Phường 13, Bình Thạnh, Hồ Chí Minh) được thiết kế dành riêng cho các nhà máy thức ăn chăn nuôi và thức ăn cho ngành thủy sản, nguyên liệu cho thú y và dược phẩm Vi sinh vật được sử dụng để khảo sát khả năng đối kháng Bảng 2 1 Các vi sinh vật dùng trong thử nghiệm khả năng đối kháng Vi khuẩn chỉ thị Nấm mốc chỉ thị Pseudomonas aeruginosa Bacillus cereus Salmo.

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu Chế phẩm sinh học Bacillus công ty BioSpring Việt Nam (162/12 Bình Lợi, Phường 13, Bình Thạnh, Hồ Chí Minh) thiết kế dành riêng cho nhà máy thức ăn chăn nuôi thức ăn cho ngành thủy sản, nguyên liệu cho thú y dược phẩm Vi sinh vật sử dụng để khảo sát khả đối kháng Bảng 2.1 Các vi sinh vật dùng thử nghiệm khả đối kháng Vi khuẩn thị Nấm mốc thị Pseudomonas aeruginosa Fusarium oxysporum Bacillus cereus Fusarium equiseti Salmonella enteritica subsp enteritica Aspergillus sp Staphylococcus aureus Aspergillus fumigatus Salmonella typhi Penicillium chermesinum Escherichia coli Neoscytalidinum dimidiatum 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp phân lập Cân g bột chế phẩm sinh học cho vào môi trường LB broth, nuôi lắc 150 vòng/phút 30 phút 37ºC Dùng que cấy nhúng vào ống giống hoạt hóa tiến hành cấy tria đĩa môi trường LB agar nuôi ủ 37°C 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy ria có chủng vi khuẩn khiết Tiến hành giữ giống cho thí nghiệm 2.2.2 Phương pháp giữ giống Chọn khuẩn lạc riêng lẻ tăng sinh ml môi trường LB, hút 10% giống vào 10 ml môi trường LB ni cấy lắc 150 vịng/phút đến OD600= 0.6-0.8 Sau phân phối vào eppendorf dịch khuẩn glycerol với tỷ lệ 1:1, tiến hành trữ đông -60ºC 20 2.2.3 Phương pháp định danh Quan sát đại thể, vi thể Hình thái khuẩn lạc quan sát sau 24 nuôi cấy môi trường thạch LB Tiến hành quan sát đặc điểm khuẩn lạc dựa vào yếu tố: màu sắc, kích thước, bề mặt khuẩn lạc, hình dạng rìa khuẩn lạc [7] Cấu trúc vi thể khuẩn lạc quan sát tiêu nhuộm Gram: (1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng (2) Tạo vết bôi cách dùng que cấy lấy vi khuẩn hòa vào giọt nước lam kính sau hơng khơ lửa đèn cồn (3) Nhuộm tiêu theo thứ tự thuốc nhuộm tím kết tinh 60 giây - rửa nước - Lugol 60 giây - rửa nhanh cồn 96° - rửa nước - safranin 60 giây - rửa nước (4) Quan sát ghi nhận hình ảnh vật kính X100 với dầu Vi khuẩn Bacillus đa số tạo bào tử sau 48 giờ, sau thời gian nuôi ủ chọn khuẩn lạc đặc trưng tiến hành nhuộm bào tử: (1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng (2) Tạo vết bơi cách dùng que cấy lấy vi khuẩn hịa vào giọt nước lam kính sau hong khơ lửa đèn cồn (3) Đặt lam kính lên giá đỡ đặt vào nồi nước đun sôi, đặt giấy lọc vệt bôi (4) Nhỏ 2-3 giọt malachite lên để yên 10 phút sau rửa nước cất (5) Nhỏ 2-3 giọt safranin 30 giây, rửa lại nước cất, để khơ (6) Quan sát vật kính X100 ghi nhận hình ảnh Các phản ứng sinh hóa Thử nghiệm phản ứng sinh hóa: Thử nghiệm indol, VP, amylase, catalase, có khả di động, hiếu khí [7] - Thử nghiệm indol: Vi khuẩn nuôi cấy môi trường canh thang Tryptophan 35-37°C 18-24 giờ, sau thời gian ủ nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Kovac quan sát kết Dương tính xuất vịng đỏ phía dung dịch ni cấy - Thử nghiệm VP: Vi khuẩn nuôi cấy môi trường MR-VP 37°C 24-48 Sau thời gian nuôi ủ lấy ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm mới, thêm 0.6 21 ml dung dịch α-napthol 15% với 0.2 ml KOH 40% Sau 15-20 phút quan sát kết Kết dương tính xuất màu đỏ mơi trường - Thử nghiệm tính di động: Cấy vi khuẩn đâm sâu vào mơi trường thạch mềm (0.5% agar) vi khuẩn có tính di động làm mơi trường đục, phát triển lan khỏi vệt cấy - Thử nghiệm catalase: Lấy vi khuẩn đặt lên lam kính sạch, nhỏ vài giọt H2O2 30% lên vi khuẩn, quan sát sau - giây Phản ứng dương tính có bọt khí xuất - Kiểm tra hoạt tính amylase: bổ sung vào môi trường LB agar 1% tinh bột, cấy chấm điểm vi khuẩn sau ủ 37°C 24-48 Tiến hành nhỏ lugol vào đĩa thạch, vi khuẩn có khả phân giải amylase xuất vòng phân giải Định danh phương pháp sinh học phân tử Gen mã hóa cho 16S-rRNA giải trình tự cơng ty TNHH Dịch Vụ Thương Mại Nam Khoa Kết giải trình tự xử lí so sánh với sở liệu 16S-rRNA vi khuẩn có sẵn NCBI cơng cụ BLAST sử dụng để vẽ phát sinh loài phần mềm Mega 2.2.4 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy Bacillus nuôi tăng sinh môi trường LB broth với tốc độ lắc 150 vịng/phút 24 giờ, sau chia nhỏ dịch huyền phù vào ống eppendorf 1.5 ml, tiến hành ly tâm 14000 vòng/ phút vòng 15 phút 4°C loại bỏ cặn tế bào Phần dịch sau ly tâm lọc qua màng lọc 0.45 µm điều kiện vơ trùng để loại bỏ phần tế bào cịn sót lại [8] 2.2.5 Phương pháp khuếch tán giếng thạch Vi khuẩn nuôi cấy qua đêm môi trường LB broth, sau dịch vi khuẩn pha lỗng tương đương với giá trị McFarland 0.5 (≈1.5x108 CFU/ml) để sử dụng làm đối kháng Chuẩn bị đĩa môi trường LB agar (10 ml), hút 100 µl dịch vi khuẩn thị trang bề mặt thạch khô Tiến hành đục giếng với đường kính mm đĩa thạch Hút 50 µl dịch cho vào giếng với giếng 1: dịch nuôi cấy; giếng 2: dung dịch NaCl 0.9% [8] Ủ đĩa nhiệt độ phòng đọc kết sau 12 22 Khả kháng khuẩn dịch nuôi cấy xác định diện vòng kháng khuẩn xung quanh giếng, đường kính vịng kháng khuẩn tính cơng thức: [8] [9] H= D-d Trong H: Độ lớn vòng kháng khuẩn xung quanh giếng (mm) D: Đường kính vùng ức chế (bao gồm đường kính giếng) (mm) d: Đường kính giếng (mm) 2.2.6 Phương pháp chuẩn bị giống Bacillus từ eppendorf giữ giống cấy ria đĩa môi trường LB agar ủ 37°C 24 Sau thời gian ủ, dùng que cấy trịn lấy trọn khuẩn lạc cho vào bình chứa ml môi trường LB broth nuôi lắc 150 vòng/phút, 37°C, qua đêm Tiếp theo dùng micropipette hút 10% giống cho vào bình 20 ml mơi trường LB broth tiếp tục ni cấy lắc 150 vịng/phút 37°C 12-15 Dịch nuôi cấy sử dụng làm giống cho thí nghiệm 2.2.7 Phương pháp khảo sát nhiệt độ thời gian ni cấy thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường LB broth, dùng micropiptette hút ml dịch vi khuẩn chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml môi trường nuôi cấy lắc 150 vòng/phút nhiệt độ khác nhau: 25°C, 28°C, 33°C, 37°C, 45°C Sau nuôi cấy, tiến hành thu dịch xử lí, đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng để lựa chọn nhiệt độ thời gian mà dịch ni cấy có khả kháng khuẩn mạnh Giá trị nhiệt độ thời gian nuôi cấy sử dụng cho thí nghiệm [9] [10] 2.2.8 Phương pháp khảo sát giá trị pH thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường LB broth, dùng micropiptette hút ml dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml mơi trường điều chỉnh với giá trị pH khác nhau: 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 Các bình ni cấy lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ thời gian lựa chọn thí nghiệm trước Sau thời gian ni cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn giá trị pH thích hợp [9] [11] 23 2.2.9 Phương pháp khảo sát nguồn nitrogen thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường MTCB (0.5 g MgSO4.7H2O, g NaH2PO4.2H2O, g Na2HPO4.12H2O) có bổ sung 1% glucose, dùng micropiptette hút ml dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml mơi trường với 1% nguồn nitrogen khác (NH4Cl, NH4NO3, NaNO3, peptone, yeast extract, urea) Các bình ni cấy lắc 150 vịng/phút với giá trị pH 7.0, nhiệt độ, thời gian lựa chọn từ thí nghiệm trước Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn nguồn nitrogen thích [9] [11] [12] 2.2.10 Phương pháp khảo sát nồng độ NaCl thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường LB broth MTCB (0.5 g MgSO4.7H2O, g NaH2PO4.2H2O, g Na2HPO4.12H2O) Dùng micropiptette hút ml dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml mơi trường có bổ sung nồng độ NaCl khác (0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%) Các bình ni cấy lắc 150 vòng/phút với giá trị pH, nhiệt độ, thời gian lựa chọn từ thí nghiệm trước Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn nồng độ thích hợp [13] 2.2.11 Phương pháp khảo sát nhiệt độ thời gian bảo quản dịch bacteriocin thô từ chủng Bacillus Dịch bacteriocin thô sau thu nhận bảo quản nhiệt độ khác (-60°C, -20°C, 5°C, nhiệt độ phịng) Hoạt tính kiểm tra phương pháp khuếch tán giếng thạch sau 10 ngày [14] 2.2.12 Phương pháp xử lí số liệu Các thí nghiệm nghiên cứu lặp lại lần Số liệu tính tốn, vẽ biểu đồ Excel xử lý thống kê phương pháp phân tích ANOVA với phần mềm Statgraphics centurition XVIII, mức độ tin cậy 95% 24 ... 25°C, 28°C, 33 °C, 37 °C, 45°C Sau nuôi cấy, tiến hành thu dịch xử lí, đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng để lựa chọn nhiệt độ thời gian mà dịch ni cấy có khả kháng khuẩn... nuôi cấy sử dụng cho thí nghiệm [9] [10] 2.2.8 Phương pháp khảo sát giá trị pH thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường LB broth, dùng micropiptette hút ml dịch ni cấy. .. gian nuôi cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn giá trị pH thích hợp [9] [11] 23 2.2.9 Phương pháp khảo sát nguồn nitrogen thích hợp