Nghiên cứu khả năng kháng salmonella spp của vi khuẩn lactic phân lập từ cây húng lủi

SYTH ỉ TRẰN TRỨC LINH NGẰNH s CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA í »15 > »17 GVHD ; Ttó, TRCƠNG HUỲNH ANH YỮ TP Hồ CHÍ MINH - NĂM 2017 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHÁNG SALMONELLA SPP CỦA VI KHUẨN LACTIC PHÁN LẬP TỪ CÂY HÚNG LỦI TRÀN TRÚC LINH Khóa luận đệ trình đê đáp ứng u cầu cấp bàng Kỹ sư ngành Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hướng dẫn: ThS Trương Huỳnh Anh Vũ / TRIfiWfnH N^ỐyĨtA^ẦNH trường ĐH NGUYỀN TẤT THÀNH TRUNG TÀM THƠNG TIN-THƯ VIỆN LVOOlGh-I / cgOlY Tp Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2017 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, em xin chán gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS Trương Huỳnh Anh Vũ - Phó trưởng phịng Vi sinh Trung tám Dịch Vụ Phân tích Thí nghiệm (CASE) tận tính hướng dẫn truyền đạt cho em kiến thức quí báu giúp em thực hoàn thành luận văn Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Giảm Đốc CASE tạo điều kiện cho em thực khóa luận Trung tâm trang thiết bị, vật tư hóa chất giúp em hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn ThS Hưỳnh Yên Hà - Trưởng phịng Vi sinh tồn thể anh chị phịng Vi sinh ln nhiệt tinh giúp đỡ, động viên suốt thời gian thực luận văn Em xin chân thành cảm ơn tất cà quí cô Khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Nguyễn Tất Thành tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức quí báu suốt thời gian theo học trường Con xin cảm ơn bố mẹ - người sinh thành, nuôi nấng, ủng hộ động viên cho suốt trình học tập Em xin cảm ơn anh, người ln bên cạnh chia sè động viên em vượt qua khó khăn sống Tp Hồ Chi Minh, tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực Trần Trúc Linh ii TÓM TẤT Đê tài “Nghiên cứu khả náng kháng Salmonella spp vi khuẩn lactic phân lập từ Húng lủi” thực tứ tháng 01/12/2016 - 30/6/2017 Phịng Vi sinh, Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm Tp Hồ Chí Minh với mục tiêu xác định khả kháng Salmonella spp cùa vi khuẩn lactic phân lập từ Húng lủi Đồ tài bao gồm nội dung sau: - Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic từ Húng lủi - Xác định khả kháng Salmonella spp dịch bacteriocin thô thu nhận từ chủng vi khuẩn lactic - ứng dụng kỹ thuật PCR để phát sổ gen mã hóa bacteriocin từ chủng phân lập Các thí nghiệm bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên Ket cần đạt được: - Phân lập tuyển chọn số chủng vi khuẩn lactic từ Húng lủi có khả kháng Salmonella spp - Khảo sát khả kháng Salmonella spp dịch bacteriocin thơ - Phát gen có khả mã hóa cho bateriocin chùng vi khuẩn lactic có khả kháng Salmonella spp iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii DANH MỤC TỪ, KÍ Tự VIÉT TẤT vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH ix MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan vikhuẩnlactic 1.1.1 Lịch sử phát triển .3 1.1.2 Đặc điểm chung 1.1.3 Phân loại vi khuẩnlactic 1.1.4 Đặc điểm sinh trưởng 1.1.5 ứng dụng 1.1.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩnlactic sinh bacteriocin 1.1.7 Gen mã hóa bacteriocin vi khuẩn lactic 12 1.2 Tổng quan Húng lủi 13 1.2.1 Giới thiệu Húng lủi 13 1.2.2 Đặc điểm hình thái 14 1.2.3 Công dụng 14 1.3 Tổng quan Salmonella spp 16 1.3.1 Lịch sử phát 16 1.3.2 Phân loại 16 1.3.3 Đặc điểm chung 16 1.3.4 Đặc điểm sinh hoá 17 1.3.5 Đặc điểm kháng nguyên 17 iv 1.3.6 Nguồn gốc gây nhiễm 18 1.3.7 Cơ chế gây bệnh 18 1.4 Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 19 1.4.1 Lịch sử đời 19 1.4.2 Nguyên tắc 20 1.4.3 Phân tích kết PCR 21 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứư 22 2.1 Thời gian địa điểm thực 22 2.1.1 Thời gian thực 22 2.1.2 Địa điểm thực 22 2.2 Vật liệu 24 2.2.1 Chủng vi khuẩn thị 24 2.2.2 Thiết bị 24 2.3 Phương pháp thực 25 2.3.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuản lactic từ Húng lủi 25 2.3.2 Phương pháp tuyển chủng vi khuẩn lactic từ Húng lùi 25 2.3.3 Xác định đặc tính sinh hóa vi khuẩn lactic 25 2.3.4 Phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật 29 2.3.5 Phương pháp chuẩn bị dịch khuẩn Salmonella spp 30 2.4 Xác định hoạt tính kháng Salmonella spp cùa chùng vi khuẩn lactic phương pháp nhỏ giọt 30 2.5 Xác định hoạt tính kháng Salmonella spp chùng vi khuẩn lactic phương pháp khuếch tán giếng thạch 31 2.6 Phương pháp phát gen mã hoá bacteriocin bàng kỹ thuật PCR 31 2.6.1 Ly trích DNA vi khuẩn lactic 31 2.6.2 Xác định gen mã hóa Pediocin Enterocin vi khuẩn lactic m - PCR1 32 2.6.3 Xác định gen mã hỏa Nisin Plantaricin vi khuẩn lactic bang m - PCR2 32 2.6.4 Thành phần quy trình nhiệt m - PCR1 32 V 2.6.5 Thành phần quy trinh nhiệt m - PCR2 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết phân lập chủng vi khuán lactic ÍLAB) từ rau Húng lủi 35 3.2 Kết khả ức chế Salmonella spp phương pháp nhỏ giọt 40 3.3 Kêt khả ức chế Salmonella spp bang phương pháp khuếch tán frên giếng thạch 43 3.4 Ket phát gen mã hóa Bacteriocin .47 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 48 4.2 Kiến nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Phụ lục 1: Các thành phần phản ứng PCR 52 Phụ lục 2: Khảo sát điều kiện phản ứng PCR để khuếch đại gen mục tiêu 55 Phụ lục 3: Thành phần cách pha chế thuốc nhuộm 56 vi DANH MỤC TỪ, KÍ Tự VIẾT TẤT ATCC: American Type Culture Collection ATP: Adenosin triphosphate Bp: Base pair CFU: Colony Forming Unit DNA: Deoxyribonucleic axit dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate ISO: International Standardization Organization LAB: Lactic Acid Bacteria MRD: Maximum Recovery Diluent MRS: de Man, Rogosa and Sharpe NA: Nutrient Agar Nm: Nanomet PCR: Polymerase Chain Reaction PCR: Polymerase Chain Reaction RNA: Ribonucleic axit TAE: Tris-Acetate-EDTA vii DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1: Thông tin mẫu 23 Bảng 2.2: Trình tự cặp mồi sử dụng thí nghiệm 34 Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái, sinh hóa cùa cãc chùng vi khuẩn lactic 35 Bảng 3.2.1: Ket khả ức chế Salmonella spp phương pháp nhỏ giọt 31 Bảng 3.2.2: Ket khả ức chế Salmonella spp phương pháp nhỏ giọt có đường kính lớn 3,5 cm 32 Bảng 3.3: Kết khả ức chế Salmonella spp bàng phương pháp khuếch tán 44 viii OANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1: Rau Húng lủi 13 Hình 1.2: Vi khuẩn Salmonella spp 17 Hình 2.1: Vi khuẩn lactic phân giải CaCCh ưẻn mõi trường MRS .26 Hình 2.2: cầu khuẩn gram âm 27 Hình 2.3: cầu khuẩn gram dương 27 Hình 2.4: Trực khuẩn gram âm 27 Hình 2.5: Trực khuẩn gram dương 27 Hình 2.6: Phản ứng catalase 28 Hình 2.7: Phản ứng Oxydase 29 Hình 3.1: Vi khuẩn lactic 40 Hình 3.2: Vi khuẩn lactic thể hoạt tính kháng với chủng Salmonella spp môi trường MRS phương pháp nhỏ giọt 42 Hình 3.3: Kết điện di 47 ix Báng 3.3: Kêt nâng ức chế salmonella spp bang phương pháp khuếch tán Khuếch tán giếng thạch Stt Kí hiệu Hình ảnh Đường kính vịng kháng Đường kính giếng (cm) (cm) LAB5 0,7 0,6 0,7 0,6 Đối chứng LAB7 44 45 0,6 0,6 0,6 46 3.4 Kết phát gen mã hố bacteriocin 412bo Hình 3.3: Kêt điện di L: Thang chuản 100 bp 1: LAB5, 2: LAB7,3: LABS 4: LAB28, 5: LAB33 6: LAB34 7: LAB 36 8: LAB38 Kết điện di m - PCR.1 thê Hình 3.3 cho thấy cặp mồi khuếch đại đoạn gen mục tiêu với kích thước ỉ 2bp (Enterocin) chiếm 12,5% chủng, với tín hiệu tốt chi có khuẩn lạc lactic sinh bacteriocin cho tín hiệu khuếch đại với cặp mồi chọn, không xuất sản phẩm khuếch đại ký sinh 47 Chương Két luận kién nghị 4.1 Kết luận Các kêt thực nghiệm ưu điểm luận văn tóm tắt sau: Trong 39 chủng vi khuân phin lập từ mẫu rau Húng lủi phân lập từ khu vực thành phơ Hồ Chí Mình có 24 dịng vi khuẩn lactic thể khả nâng tính kháng khn, dịng có tính kháng mạnh với đường kính vịng vơ khuẩn lớn hon 3,5 cm, dịng có tính kháng trung binh với đường kính vịng vơ khuẩn 2,5 - 3,2cm dịng có tính kháng yếu với đường kính vịng vơ khuẩn nhó 2,5 cm kiểm tra phương pháp nhỏ giọt Có dịng vi khuẩn có xuất vùng sáng vơ khn với kích thước khác Trong đó, có dịng phân lập có tính kháng khuẩn lớn 0.8cm, nên thể tính kháng mạnh dịng cịn lại Tiêu biểu, dịng LAB38 có đường kính vịng sáng rộng lem, thể tính kháng mạnh Bẽn cạnh có dịng cho vịng vơ khuẩn nằm khoảng 0,7 - 0,8 cm, biểu tính kháng khuẩn mức trung bình Phát (12,5%) chùng có gen mã hóa Enterocin ừong tổng số chủng có vịng kháng khuẩn tốt nhât 4.2 Kiến nghị • Định danh đến cấp lồi chùng lactic có khà kháng Salmonella spp * Tối ưu hóa điều kiện ni cấy nhàm thu bacteriocin có hoạt tính mạnh • ứng dụng bactcriocin vào việc bào quan thực pham 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Dược sĩ Nguyễn Bá f luy Cưởng (2014), Húng lủi - rau quý ưong vườn, Sức khỏe Bao người lao dộng rJd.com.vn/suc-khoe/hung-lui-rau-quy-trong- vuon-2014071521224662.htm > Ngộ độc thực phẩm, “Quàng Bình: Thêm nhiều người bị ngộ độc ăn bánh mì”, Thời nước - Bảo người lao động (2015) Nguyễn Thị Thủy Tiên Lè Thị Anh Thư Nguyễn Hiền Trang (2016) Khả ức chế E coli Salmonella spp vi khuẩn lactic phân lập từ bã sắn tré Thừa Thiên - Huế Tạp chi khoa học nơng nghiệp Việt Nam Nguyễn Thu Hiền, Hồng Thị Thu Hiền, Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Huy Hoàng (2013), Chọn dòng biếu gen Keratinase Escherichia coli BL21(DE3) từ vi khuẩn bacillus, Tạp chí khoa học 2013 Phạm Hùng Vân (2009), “PCR real - time PCR, Các vấn đề áp dụng thường gặp”, pp Trần Linh Thước (2002), “Phương pháp phàn tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm”, Nhà xuất Giảo dục Việt Nam, Tái lần thứ 8, pp 81-120 Tài liệu tiếng nước Carol Ash, J.A.E Farrow, Sally Wallbanks, M.D Collins (1991), Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillusrevealed by comparative analysis of small subunit ribosomal RNA sequences 49 Clark MA, Barret EI (1987) “ rhe phs gene and hydrogen sulfide production by Salmonella spp typhimurium.” J Bacteriology 169 (6): 2391-2397 Dr Nawfal Hussein Aldujaili /2014) Molecular detection of bacteriocin producing Lactic acid bacteria from fermented milk in Alnajaf Journal of Kerbala University, Vol 12 Ko.2 Scientific 2014 10 Duongdeam Suwanjinda, Chris Eame, and Watanalai Panbangred (2007) Screening of Lactic Acid Bacteria for Bacteriocins by Microbiological and PCR Methods The International Union of Biochemistry and Molecular Biology 11 Irena Nemeckova, Katerina So’.ichova Petr Roubal, Barbora Chrova and Eva Svirakova (2011), Methods for Detection of Bacillus sp., B cereus, and B Licheniformis in Raw Milk http://www.agriculturejoumals.cz/publicFiles/54734.pdf, 12 Ji Yeun Kim, Janay A Young, Nereus w Gunther IV, Jung-Lun Lee (2014) Inhibition of Salmonella spp by Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria Derived from U.S Kimchi and Broiler Chicken Journal offood safety 13 Komkhae Pilasombut, Kittapom Rumjuankiat, Nualphan Ngamveesoon, and Le Nguyen Doan Duy (2015) In vitro Chacracterization Ò Bacteriocin Produced by Lactic Acid Bacteria Isolated from Nem Chua, a Traditional Vietnamese Fermented Pork Korean J Food Sci An Vol.35, pp 473-478 14 MikoIajczyk A, Radkowski M (2002), Elimination of Salmonella spp spp By lactic acid Polish journal of veterinary sciences 15 M.P Zacharof, R.w Lovitt (2012) Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria a Review Article APCBEE Procedia vol page 50 - 56 16 Raquel Cristina Konrad Burin Silva Jr Luis Augusto Nero (2014), Influence of lactic acid and acetic acid on Salmonella spp spp growth and expression of acid tolerance-related genes Food Research International vol 64 17 Salasiah Kormin, Gulam Rusul, Son Radu and Foo Hooi Ling (2001) 50 Bacteriocin-Producing Lactic Acid Bacteria Isolated from Traditional Fermented Food The Malaysian journal of medical sciences (MJMS) 18 A Von Wright and L Axelsson (2011) Chapter 1: Lactic Acid Bacteria: An Introduction Lactic Acid Bacteria Microbiological and Functional Aspects Revised and Expanded, fourth edition ( Ed: Seppo Salminen, Atte von Wright, Arthur Ouwehand Sampo Lahtinen ) New york, United States of America, pp 1-16 51 Phụ lục Các thành phần phản ứng PCR Để thử nghiệm PCR thực dược, cẩn phải có đầy đù thành phàn phàn ứng PCR sau đây: Nước Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt giởi hạn -Nói cách khác khơng chứa thành phần khác Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: Dung dịch đệm cho PCR yếu tố quan ừọng ảnh hường đến chất lượng phản ứng PCR Thành phần dung dịch đệm phàn ứng PCR thường phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng PCR, thường chứa muối đệm Tris HC1 10 mM, KC1 50mM MgCh 1.5mM Ngồi dung dịch đệm PCR cịn chứa 0.001% BSA hay Gelatine số phản ứng PCR cịn thêm tween hay formamide Trong thành phần trên, ảnh hưởng lên thử nghiệm PCR nhiều nồng độ MgCh, để có thử nghiệm PCR có độ nhạy cao, phàn ứng rõ nét, người ta phải tối ưu hóa phản ứng cách thăm dị nồng độ MgCh thích hợp Nồng độ MgCh dao động từ 0.5-5 mM Chính ion Mg2+ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả bám cùa mồi Nong độ MgCh cao tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCh thấp không tạo sản phẩm PCR dNTP(deoxy nucleoside triphosphate) dNTP đom vị để tổng hợp bàn cùa DNA đích dNTP có cấu tạo gồm đường deoxyribose có gắn base, Adenine (dATP) hay Thymine (dTTP) hay Cytosine (dCTP) hay Guanine (dGTP) carbone số (Cl) Ba phân tử phosphate (triphosphate) gắn carbone sổ (C5) phân tử deoxyribose đày chinh nori mà dNTP gắn vào đầu 3’ cùa chuồi bổ sung chuỗi DNA đích Năng lượng phản ứng xảy lấy từ nối phosphate 52 giàu lượng triphosphate dNTP Đó lý phải dN rp dNDP ^diphosphate) hay dNMP(monophosphate) Moi (primer) Mồi đoạn DNA sợi đơn ngấn dài khoảng 20-30 base có trình tự bổ sung với hai đầu đoạn DNA cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA Chúng nhận phần DNA cần nhãn lên, bất cặp bổ sung với đầu DNA mẫu tạo vị trí bắt đầu tái bàn Các mồi có chiều ngược nhau, bao gồm mồi xuôi (forward primer) mồi ngược (reverse primer) Mồi yếu tố quan trọng phán ứng PCR, định tính đặc hiệu phản ứng Trong thử nghiệm PCR, đoạn mồi có hai vai ưị : (1) Quyết định nên tính đặc hiệu thừ nghiệm, đoạn mồi chọn đặc hiệu cho chuỗi đích, nghĩa chì có thê băt cặp chi đích mà khơng thê bắt cặp chuỗi DNA khác ngồi chuỗi đích, sàn phâm PCR đặc hiệu thử nghiệm PCR đặc hiệu (2) Khởi động men polymerase men polymerase chì bẳt đầu tổng hợp sợi bổ sung cho chuỗi DNA đích nhận dạng đầu 3’ (là đầu mà xúc tác cho dNTP gắn vào) tình ơạng sợi đơi Enzim DNA polymerase (Taq) Kết phản ứng PCR phụ thuộc vào khà nãng chịu nhiệt enzyme polymerase Enzyme DNA polymerase: Là enzyme xúc tác cho trình lắp ráp nucleotide A, T, G, c vào mạch DNA tổng hợp DNA mẫu (DNA template) Là mẫu DNA mà khuếch đại Có thể DNA kép, đơn, RNA tách chiết từ đổi lượng nghiên cứu DNA khn có độ ngun vẹn cao tránh lẫn tạp chất Phản ứng PCR tổi ưu xảy mẫu DNA không dài quá, thường khuếch đại tôt đổi với đoạn DNA đài khoảng 1-1,5kb 53 Mau DNA tinh cho kết quà tốt, nhiên kỹ thuật chuẩn đoán phương pháp đạt kết tốt trường hợp mẫu DNA khơng cần có độ tinh cao, vết máu khô, mẫu vật khảo cổ Phương pháp cho phép xác định DNA với lượng thấp, khoảng 100 nucleotide 54 Phụ lục Khảo sát điểu kiện phản ứng PCR để khuếch đại gen mục tiêu a Khảo sát nhiệt độ bắt cặp Nhiệt độ bắt cặp chu ưình khuếch dại cẩn khảo sát nhằm tối tru hóa quy trình phân tích với mục đích đảm bào thu kết phân tích xác b Khảo sát độ đặc hiệu cặp moi bang thực nghiệm Kiểm tra khả khuếch đại vi khuân lactic với cặp mồi, cặp mồi cặp mồi cặp mồi nhằm tìm độ đặc hiệu chung cùa cặp mồi • Sử dụng chủng vi khuẩn lactic phân từ mẫu rau - Chứng dương: khơng có - Chứng âm: phản ứng cặp mồi + nước • Tiến hành - Đối với chủng vi sinh vật, huyền phù khuẩn lạc ống tube có chứa Iml mơi trường MRD - Ly trích DNA - Thực chương trình khuếch đại PCR - Điện di đọc kết 55 Phụ lục Thành phần cách pha chế thuốc nhuộm Môi trường nuôi cấy, hố chất, thuốc thử a) Mơi trường MRS Agar (Oxoid) 10g Pepton Cao nấm men 5s Glucose 20 g Tween 80 ml (NH4)2SO4 2g CH3CO2Na 5g MgSO4 X 7H2O 0,1 g MnSO4 X H2O 0,05 g k2hpo4 2g Nước cất 1000 ml Hịa tan 55,15 g mơi trường MRS Broth tổng hợp với 1000 ml nước cất, hấp khử trùng 121°c thời gian 15 phút Nếu pha mơi trường MRS Agar bổ sung thêm 20g/l lít mơi trường, hịa tan thạch agar b) Nutrient Agar (NA) Thành phần môi trường (g/L) Extract yeast 3g Peptone 5g Agar 15 g 56 Hịa tan 23g mơi trường Nutrient Agar 1000ml nước cất vô trùng Đun sôi, khuấy đểu khừ trùng nồi hấp 121 °C 15 phút c) Maximum Recovery Diluent (MRD) Thành phần môi trường (g/L) Peptone 1.0 g Natri clorua 8.5 g Giá trị pH: 6,8 - 7,2 Pha chế: Hòa tan hồn tồn 9,5g 1000ml nước cất vơ trùng Hấp khử trùng 121 °C 15 phút ❖ TE buffer: Thành phần Tris-Cl, pH EDTA lOmM mM Phosphate buffer Saline(PBS) Thành phần (gr) Na2HPO4.12 H2O KH2PO4 NaCl Nước cất lần 1,72g 0,254g 8j5g 1000 ml Pha chế: Đối với lít PBS IX, chuẩn bị sau: + Băt đâu với 800 ml nước cất: + Thêm g NaCl 57 + Thêm 0,2 gKCl + Thêm ,44 g Na2HPO4 + Thêm 0,24 g KH2PO4 + Điểu chỉnh pH tới 7,4 với HC1 + Thêm nước cất vào thể tích lít + Pha dung dịch vào bình khừ trũng cách hấp (20 phút, 121°C) Lưu trữ nhiệt độ phòng ❖ Gel Agarose: Gel agarose đổ bàng cách đun agarose dung dịch đệm thích hợp có màu trắng cho dặc lại cách đổ vào khuôn để nguội Khi đặc lại agarose tạo nên mạng lưới mả kích thước phụ thuộc nồng độ agarose dung dịch đệm a Pha chế thuốc nhuộm Sử dụng hóa chất nhuộm Gram thương mại (ví dụ: Bộ Nhuộm Gram Merck /Code 1.11885) Trong trường hợp khơng có sẵn thuốc thử hóa chất nhuộm Gram thương mại, pha chế thuốc nhuộm theo hướng dẫn đây: b Dung dịch tím kết tinh (Crystal violet) Crystal violet (tím tinh thể) 2,0g Ethanol (95%) 20ml Ammonium oxalate (C2H8N2O4) 0,8g Nước cất 80ml Hòa tan Crystal violet ethanol ammonium oxalate nước cất Sau đó, trộn đêu hai dung dịch đê yên 24 trước sừ dụng Bảo quản chai lọ tối màu nhiệt độ phòng c Dung dịch Iodine Iodine l50g Potassium iodide (KI) 2,0g 58