Đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố hà nội

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 221-226 ðặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lactic phân lập ñịa bàn thành phố Hà Nội Mai ðàm Linh1,*, ðỗ Minh Phương1, Phạm Thị Tuyết1, Kiều Hữu Ảnh1, Nguyễn Thị Giang2 Khoa Sinh học, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Phòng Vi sinh, Viện Dinh Dưỡng, Yersin, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 02 tháng năm 2007 Tóm tắt Việc sử dụng chủng vi khuẩn lactic ñời sống ngày phổ biến Trong nghiên cứu này, ñã phân lập ñược lượng lớn chủng vi khuẩn lactic từ mẫu lên men chua ứng dụng từ trình lên men lactic Trong số này, chủng vi khuẩn lactic L0, L1, Dr1 ñược lựa chọn ñể nghiên cứu sâu với tiêu chuẩn bao gồm sinh axit lactic lớn (trên 2000T), phổ kháng khuẩn rộng, hoạt tính proteaza cao, đồng thời sinh trưởng tốt mơi trường cải biến để lên men với dung tích lớn, tiết kiệm chi phí sản xuất so với mơi trường đặc hiệu Từ khóa: probiotic, vi khuẩn lactic., lên men lactic Ở Việt Nam, việc nghiên cứu sử dụng sản phẩm probiotic có nguồn gốc từ vi khuẩn lactic hạn chế Nghiên cứu nhằm tìm chủng vi khuẩn lactic có khả ứng dụng ñể tạo sản phẩm probiotic cho thị trường Việt Nam ðặt vấn ñề∗ Việc sử dụng chủng vi khuẩn lactic phòng ngừa ñiều trị bệnh phục hồi trì sức khoẻ ngày phổ biến Ngày nay, chúng cịn sử dụng điều trị làm điều chỉnh miễn dịch, giảm cholesterol, ngăn ngừa ung thư [1] Các sản phẩm probiotic có nguồn gốc từ vi khuẩn lactic xuất nhiều lĩnh vực thực phẩm bổ dưỡng [2] Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vi sinh vật Lactobacillus nhóm vi khuẩn lactic ñược sử dụng nhiều lĩnh vực probiotic[3] Hoạt ñộng Lactobacillus hiệu việc tạo khả bám dính vào tế bào, loại trừ làm giảm lan truyền bệnh, tính bền vững khả nhân lên [4,5] Các chủng vi khuẩn lactic ñược phân lập từ mẫu lên men chua thu thập Hà Nội 2.2 Môi trường - Sử dụng môi trường MRS phân lập nghiên cứu ñặc tính sinh học vi khuẩn lactic _ ∗ Tác giả liên hệ ðT: 84-4-8588856 E-mail: linhmd@vnu.edu.vn 221 222 M.Đ Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 221-226 - Môi trường cải biến I (100g rau cải xanh, 20g đường kính, 1g K2HPO4, 0,5g MgSO4: bổ sung tới 1000ml nước.) - Môi trường cải biến II: (100g cà chua, 20g đường kính, 1g K2HPO4, 0,5g MgSO4: 5g cao nấm men bổ sung tới 1000ml nước.) - Mơi trường cải biến III: (100g giá đỗ, 20g ñường kính, 5g cao nấm men bổ sung tới 1000ml nước.) 2.3 Phương pháp Sử dụng phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông dụng việc phân lập xác ñịnh ñặc ñiểm sinh học vi khuẩn lactic Khả sinh axit chủng vi khuẩn lactic ñược xác ñịnh phương pháp chuẩn ñộ Therner (0 T) Xác định hoạt tính kháng khuẩn hoạt tính enzym theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết thảo luận 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic Từ 17 mẫu khác nhau, ñã tiến hành phân lập chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS Kết ñã phân lập ñược 50 chủng vi khuẩn lactic Dựa vào kết phân lập, ñã lựa chọn ñược 10 chủng thể khả sinh axit lactic cao ðặc tính sinh học chủng trình bày bảng Bảng ðặc điểm hình dạng 10 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn Chủng Hình dạng tế bào Hình dạng khuẩn lạc Chủng Lo Que ngắn xếp chuỗi Tròn, trong, nhỏ N10 L1 que chuỗi dài Dr1 L2 Que xếp chuỗi ngắn Tròn, trắng Tròn, trắng sữa, chân trắng Tròn, trắng, sữa Dc2 Trịn, trắng đục Dc3 N3 N7 Que ngắn, xếp chuỗi dài Que, chuỗi dài Các chủng vi khuẩn mang nhiều đặc tính nhóm Lactobacillus, lựa chọn để tiến hành thí nghiệm 3.2 ðịnh lượng axit lactic sinh từ chủng tuyển chọn Dr3 Hình dạng tế bào Que mảnh xếp chuỗi Que dài Que dài (tế bào mập) Que ngắn xếp chuỗi (tế bào mập) Que ngắn xếp chuỗi Chủng 10 Lo L1 L2 N3 N7 N10 Dr1 Dr3 Dc2 Dc3 Tròn, nhỏ, trắng sữa Tròn, trắng sữa Trịn, trắng sữa Trịn, đục Trịn, trắng sữa 10 chủng sinh axit lactic cao tiến hành ni cấy môi trường MRS dịch thể, 37oC từ 24 -96 giờ, sau xác định lượng axit lactic tạo thành theo phương pháp Therme Kết trình bày bảng Bảng Khả sinh axit lactic 10 chủng lựa chọn STT Hình dạng khuẩn lạc Lượng axít tạo thành (tính theo độ o T) 24 48 72 96 204 244 269 258 199 248 263 258 193 240 249 253 204 239 266 253 198 240 260 232 219 235 262 250 194 251 266 255 244 226 251 254 157 210 267 259 202 204 258 255 M.Đ Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 221-226 Kết cho thấy lượng axit lactic sinh thời ñiểm khác khác Lượng axit tăng dần theo thời gian từ 24 đến 72 có xu hướng giảm dần sau 72 giờ, qua cho thấy lượng axit sinh ñạt cực ñại khoảng thời gian từ 48 ñến 72 223 72h/370 C sau ly tâm thu lấy dịch Tiến hành phân tích hoạt tính theo phương pháp khuếch tán ñĩa thạch Kết trình bày bảng Bảng cho thấy 10 chủng có khả ức chế vi khuẩn kiểm ñịnh, phổ kháng rộng (kháng ñược vi khuẩn Gram dương Gram âm) đường kính vịng phân giải cao (trên 10mm), có chủng thể hoạt tính cao nhất: L0, L2 , R1, Dc2 Hình Khả sinh axit lactic chủng L1 MT MRS 3.3 Hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh 10 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn ni cấy mơi trường MRS dịch thể Hình Hoạt tính ức chế Shigella sp chủng Lo (1); L1 (2); Dr1 (3) Bảng Hoạt tính ức chế vi khuẩn kiểm định chủng nghiên cứu STT Chủng 10 L0 L1 L2 N3 N7 N10 Dr1 Dr3 Dc2 Dc3 Hoạt tính ức chế (D – d,mm) Bacillus.sp E.coli 21 20 21 17 20 18 17 17 18 15 17 16 20 18 19 17 19 17 17 15 3.4 Hoạt tính phân giải protein (hoạt tính proteaza) 10 chủng vi khuẩn lactic tuyển chọn ni cấy mơi trường MRS dịch thể 72h/370C sau ly tâm thu lấy dịch Việc Sighella 25 26 25 25 26 25 26 25,5 26 25 Saccina 22 23 29 20 22 21 21 20 26 26 xác định hoạt tính phân giải cazein gelatin ñược tiến hành theo phương pháp khoan lỗ thạch Sau ủ 48 tủ ấm 37oC, đĩa petri lấy để đo đường kính vịng phân giải Kết trình bày bảng 4, hình 224 M.Đ Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 221-226 37oC 72 sau xác ñịnh hàm lượng axit lactic ñược sinh theo phương pháp chuẩn độ Therner Kết trình bày bảng Bảng Khả sinh axit chủng Lo, L1, Dr1 Chủng Lo L1 Dr1 Hình Hoạt tính proteaza chủng Lo(1); L1 (2); Dr1 (3) Bảng Năng lực phân giải protein 10 chủng nghiên cứu Chủng L0 L1 L2 N3 N7 N10 Dr1 Dr3 Dc2 Dc3 Hoạt tính phân giải (D – d, mm) Cazein Gelatin 11 23 12 24 11 22 11 21 11 21 10 24 11 22 11 22 11 20 10 22 Bảng cho thấy 10 chủng có khả phân giải protein, có chủng thể hoạt tính phân giải mạnh là: L0, L1 , L2, Dr1, Dr3 3.5 Nghiên cứu số mơi trường ni cấy đơn giản đánh giá hoạt tính chủng vi khuẩn mơi trường Ba mơi trường tiến hành thử nghiệm để ni cấy chủng vi khuẩn lactic bao gồm mơi trường I, II, III Sau ñánh giá hoạt tính chủng thí nghiệm theo phương pháp thông thường 3.5.1 Khả sinh axit lactic Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Lo, L1, Dr1 môi trường thử nghiệm I, II, III Lượng axit tạo thành (tính theo ñộ oT) I II III 147 73 78 159 69 121 11 98 Kết bảng cho thấy chủng L0, L1 , Dr1, ñều sinh axit ba môi trường không mạnh mơi trường MRS thể hoạt tính cao mơi trường I (rau cải) chủng sinh axit cao 3.5.2 Khả ức chế vi khuẩn gây bệnh Tiến hành nuôi cấy chủng vi khuẩn Lo, L1 , Dr1 môi trường thử nghiệm I, II, III, 37o 72 giờ, ly tâm thu lấy dịch tiến hành theo phương pháp khuếch tán ñĩa thạch Kết trình bày bảng Bảng Khả ức chế vi khuẩn kiểm định mơi trường chủng nghiên cứu Môi trường I II III Chủng kiểm ñịnh Bacillus sp E.coli Shigella sp Sarcina sp Bacillus sp E.coli Shigella sp Sarcina sp Bacillus sp E.coli Shigella sp Sarcina sp Hoạt tính ức chế (D – d, mm) Lo 19 23 21 14 17 13 13 18 14 L1 14 22 20 15 12,5 10 17,5 16 Dr1 17 22 20,5 12 15,5 14 11 16 15,5 Bảng cho thấy: Cả chủng Lo, L1, Dr1 , nuôi môi trường I, II, III có khả ức chế vi khuẩn kiểm định mơi trường I (mơi trường Rau cải) chủng có M.Đ Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 221-226 Bảng 10 ðặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn hoạt tính ức chế mạnh (đường kính vịng ức chế 20mm) 3.5.3 Năng lực phân giải protein Các chủng vi khuẩn Lo, L1, Dr1, ni mơi trường I, II, III 72 giờ, sau tiến hành theo phương pháp khuếch tán ñĩa thạch Kết ñược trình bày bảng Bảng Năng lực phân giải protein chủng nghiên cứu Môi trường I II III Cơ chất Cazein Gelatin Cazein Gelatin Cazein Gelatin Chủng Lo L1 Dr1 Hdtb Que ngắn Que dài Que ngắn Gram + O/F F Catalaza Âm tính + F Âm tính + F Âm tính (Hdtb: Hình dạng tế bào) Hoạt tính phân giải (D-d, mm) Lo L1 7,5 Dr1 7,5 2,5 2,5 Bảng cho thấy: Khi nuôi môi trường I, II, II ba chủng L0, L1, Dr1, có khả phân giải protein nhiều so với môi trường MRS, môi trường I (mơi trường rau cải) ba chủng thể hoạt tính phân giải mạnh cả, ñặc biệt Các kết cho thấy môi trường I (môi trường rau cải xanh), hoạt tính chủng vi khuẩn giữ tốt, ñặc biệt lượng axit lactic hoạt tính kháng khuẩn chút so với môi trường MRS ðây mơi trường rẻ tiền dễ kiếm, thay mơi trường MRS (là mơi trường chứa nhiều hố chất đắt tiền) để lên men với thẻ tích lớn ứng dụng cho việc tạo chế phầm chăn nuôi sau Hình Phản ứng O/F chủng vi khuẩn 3.6 Một số ñặc ñiểm sinh học chủng tuyển chọn Các ñặc ñiểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn trình bày bảng 10 Hình Hình dạng tế bào chủng L1 225 226 M.Đ Linh nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 221-226 Elsevier Applied Science, London and New York, 211- 296; 447 – 475 Kết luận - Trong số 50 chủng vi khuẩn lactic phân lập, ñã lựa chọn ñược 10 chủng vi khuẩn mang nhiều ñặc ñiểm chi Lactobacillus - 10 chủng tuyển chọn ñều sinh axit lactic cao (trên 2000 T), hoạt tính ức chế vi khuẩn tốt, khả phân giải protein mạnh - ðã lựa chọn chủng có hoạt tính cao tiến hành nuôi cấy thử nghiệm môi trường thông thường, rẻ tiền, kết cho thấy chủng sinh trưởng tốt mơi trường I , thay mơi trường MRS với nhiều hố chất đắt tiền, khó kiếm Tài liệu tham khảo [1] J B Brian, Wood, The Lactic Acid Bacteria, The Lactic Acid Bacteria in Health and Disease [2] A.F Harper, E.T Kornegay, K.L Bryant, H R Thomas, “Efficacy of virginiamycin and a commercialy-available Lactobacillus probiotic in swine diets”, Anim Feed Sci Technol (1983) 69 [3] M Champ, O Szylit, P Raibaud, N AitAbdelkader, “Amylase production by three Lactobacillus strain isolated from chicken crop”, J Appl Bacteriol 55 (1983) 487 [4] K.S Muralihara, G.G Sheggeby, P.R Elliker, D.C England, W.E Sandine, “Effect of feeding lactobacilli on the coliform and Lactobacillus flora of intestinal tissue and feces from piglets”, J Food Protection 40 (1977) 288 [5] S.E Gilliland, B.B Bruce, L.J Bush, T.E Stanlet, “Comparison of two strains of Lactobacillus acidophilus as dietary adjuncts for young calves”, J Dairy Sci 63 (1980) 964 Study on characteristics of lactic acid bacteria isolated in Hanoi Mai Dam Linh1, Do Minh Phuong1, Pham Thi Tuyet1, Kieu Huu Anh1, Nguyen Thi Giang2 Department of Biology, College of Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Department of Microbiology, National Institute of Nutrition, Yersin, Hanoi, Vietnam - Out of 50 isolated lactic bacteria strains, 10 active strains were selected which have properties of Lactobacillus.7 - 10 selected strains producing lactic acid strongly (over 2000T), were able to inhibit the growth of some bacteria such as Shigella, E coli from which three strains (Lo, L1, Dr1) were further studied - Three strains (Lo , L1, Dr1) grew well in medium No I (made from some normal and cheap chemicals) which replaces MRS medium (made from some expensive chemicals)  ... thảo luận 3.1 Phân lập vi khuẩn lactic Từ 17 mẫu khác nhau, ñã tiến hành phân lập chủng vi khuẩn lactic môi trường MRS Kết ñã phân lập ñược 50 chủng vi khuẩn lactic Dựa vào kết phân lập, ñã lựa... vi sinh vật thông dụng vi? ??c phân lập xác ñịnh ñặc ñiểm sinh học vi khuẩn lactic Khả sinh axit chủng vi khuẩn lactic ñược xác ñịnh phương pháp chuẩn ñộ Therner (0 T) Xác định hoạt tính kháng khuẩn. .. 50 chủng vi khuẩn lactic phân lập, ñã lựa chọn ñược 10 chủng vi khuẩn mang nhiều ñặc ñiểm chi Lactobacillus - 10 chủng tuyển chọn ñều sinh axit lactic cao (trên 2000 T), hoạt tính ức chế vi khuẩn