Xây dựng phương pháp xác định nhanh các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR

Xây dựng phương pháp xác định nhanh các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR Xây dựng phương pháp xác định nhanh các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR Xây dựng phương pháp xác định nhanh các chủng nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin bằng kỹ thuật PCR luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp luận văn tốt nghiệp,luận văn thạc sĩ, luận văn cao học, luận văn đại học, luận án tiến sĩ, đồ án tốt nghiệp

bộ giáo dục đào tạo trường đại học bách khoa hµ néi -& - luận văn thạc sỹ khoa học Ngành : công nghệ sinh học Xây dựng phương pháp Xác định nhanh chđng nÊm mèc sinh ®éc tè aflaToxin b»ng kü tht PCR Người hướng dẫn : TS Lê Quang Hoà Học viên CH : Đào Thị Thanh Xuân hà nội 2006 Đào Thị Thanh Xuân Lời Cam Đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu sử dụng luận văn chưa công bố nghiên cứu Học viên cao học Đào Thị Thanh Xuân Đào Thị Thanh Xuân Mục lục Mở đầu PhÇn I Tæng quan 1.1 Định nghĩa Aflatoxin 1.2 TÝnh chÊt hãa lý 1.3 Nấm mốc có khả sinh aflatoxin 10 1.3.1 Các loại nÊm sinh aflatoxin 10 1.3.2.Đặc điểm hình thái 12 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng khả sinh độc tố 15 1.3.4 Điều kiện sinh độc tố 16 1.4.Tình trạng nhiễm aflatoxin lương thực thực phẩm 17 1.5.Cơ chế tác động aflatoxin thê 20 1.6 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 21 1.6.1 Cơ chế sinh tổng hợp aflatoxin 21 1.6.2 Cấu trúc chức mét sè gen cơm gen sinh tỉng hỵp aflatoxin 24 1.7 Các phương pháp kiểm soát aflatoxin 31 1.7.1 BiƯn ph¸p canh t¸c nông nghiệp bảo quản 31 1.7.2 Biện pháp chọn tạo giống có khả kháng aflatoxin 32 1.7.3 ứng dụng phương pháp PCR để xác định nấm sinh aflatoxin thực phẩm 33 PhÇn II 38 VËt liƯu vµ phương pháp nghiên cứu 38 2.1 Đối tượng nghiên cứu 38 Đào Thị Thanh Xuân 2.2 Các môi trường sử dụng trình nghiên cứu 38 2.3 Phương pháp tách chiết aflatoxin 39 2.4 Ph­¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN tõ nÊm mèc 40 2.5 Phương pháp PCR 41 PhÇn III 43 KÕt qu¶ th¶o luËn 43 3.1 T¸ch chiÕt ADN tæng sè 43 3.3 KiĨm tra sù biĨu hiƯn gen aflJ chủng nấm mốc 46 3.4 Kiểm tra biểu gen avfA chủng nấm mốc 47 3.5 Khảo sát biểu gen NorA-CypB chủng nấm mốc 48 3.6 Khảo sát biểu gen ordB chủng nấm mốc 49 3.7 Khảo sát biểu gen aflRstop chủng nấm mốc 50 3.8 Khảo sát biểu gen adhA chủng nấm mốc 52 3.9 Khảo s¸t sù biĨu hiƯn gen estAcđa c¸c chđng nÊm mèc 52 3.10 Khảo sát biểu gen ver1của chủng nấm mốc 53 3.11 Khảo s¸t sù biĨu hiƯn gen verA cđa c¸c chđng nÊm mốc 54 3.12.Khảo sát biểu gen verB chủng nấm mốc 55 3.13 Khảo sát biểu gen avnA chủng nấm mốc 56 3.14 Khảo sát biểu gen omtA chủng nấm mốc 57 3.15 Khảo sát biểu gen omtB chủng nấm mốc 58 3.16 Khảo sát biểu gen ordA chủng nấm mốc 59 3.17 Khảo sát biểu gen pksA cũ chủng nÊm mèc 60 3.18 Sµng läc chđng sinh aflatoxin víi måi 61 3.19 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Sắc ký máng TLC 61 PhÇn IV 65 KÕt luËn 65 Đào Thị Thanh Xuân Tài liƯu tham kh¶o 66 Đào Thị Thanh Xuân Mở đầu Aflatoxin độc tố gây hại cho sức khỏe người vật nuôi tiêu thụ thức ăn có nhiễm độc tố Nhưng độc tố thường tạo có phát tiển nấm mốc, đặc biệt chủng A.parasiticus A.flavus hai loài chủ yếu sinh aflatoxin Để khảo sát khả sinh độc tố, thường người ta nuôi chủng phân lập môi trường tự nhiên môi trờng nhân tạo cho nấm mốc phát triển sinh độc tố (nếu có), sau đo lượng afltoxin tiÕt qua chiÕt xuÊt tõ m«i tr­êng nu«i cấy sắc ký mỏng TLC, Sắc ký lỏng cao áp, kỹ thuật ELIZA Điều tốn thời gian từ 7-14 ngày tốn chi phí phân tích aflatoxin.Với đề tài sử dụng kỹ thuật PCR dựa tập hợp gen sinh tổng hợp aflatoxin thiết kế cặp mồi thích hợp để xây dựng phương pháp xác định nhanh có mặt loại nấm mốc có khả sinh tổng hợp aflatoxin Néi dung nghiªn cøu: - ThiÕt kÕ måi cho gen cụm gen sinh tổng hợp aflatoxin - Khảo sát biểu gen cụm gen aflatoxin chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus - Kiểm tra lại khả sinh độc tố chủng nấm mốc phương pháp sắc ký mỏng TLC - Xây dựng phương pháp xác định nhanh chủng nấm mốc sinh aflatoxin phương pháp PCR Đào Thị Thanh Xuân Phần I Tổng quan 1.1 Định nghĩa Aflatoxin Afltoxin nhóm hợp chất có nhân diuranocumarin, sản phẩm trao đổi chất nấm A.parasiticus A.flavus Người ta đà phát xác định có 17 loại aflatoxin khác nhau, aftoxin B có độc tính mạnh nhất, loại khác sản phẩm chuyển hoá AFB , AFB , AFG , AFG , AFM , AFM , …[1, 4] 1.2 TÝnh chÊt hóa lý Các aflatoxin thường nhiễm sản phẩm thực vật Trong loại aflatoxin, aflatoxin B tìm thấy nồng độ cao nhất, G B G tồn nồng độ thấp Người ta đà phát xác định cấu trúc 16 hợp chất này, kể chất đà biến đổi thĨ ®éng vËt O O R2 R1 O R5 X R3 OR4 O Hình1 1: Công thức cấu tạo chung aflatoxin Đào Thị Thanh Xuân Bảng 1.2 : C¸c nhãm chøc cđa c¸c aflatoxin Aflatoxin R1 R2 R3 R4 R5 X B1 H H H CH O H2 G1 H H H CH O -OCH B2 H2 H2 H CH O H2 G2 H2 H2 H CH O -OCH B2a OH H2 H CH O H2 G2 a OH H2 H CH O -OCH 1-methoxy B OCH H2 H CH O H2 2-methoxy B H2 OCH H CH O H2 2-methoxy B H2 OCH CH H CH O H2 2-methoxy B H2 OCH CH H CH O -OCH Aflatoxincol (R o ) H H H H O H2 P1 H H OH CH O H2 M1 H H OH CH O H2 M2 H2 H2 OH CH O H2 BGM H H OH CH O -OCH BGM H2 H2 OH CH CH H2 Dihydro- H2 H2 H CH CH H2 aflatoxin C¸c cÊu tạo aflatoxin chất trao đổi có liên quan đến aflatoxin B G Afatoxin B vµ G lµ dÉn xt hydro cđa hợp chất mẹ Các aflatoxin M M chất trao đổi hydroxylat hóa B vµ B , theo thø tù chóng cã công thức sau: Đào Thị Thanh Xuân Hình1.2 Công thức cấu tạo số aflatoxin Các afltoxin phát quang mạnh ánh sáng cực tím sóng dài Điều cho phép phát hợp chất nồng độ cực thấp (0,5 ng hay thấp vết sắc ký mỏng) Nó cung cấp điểm mặt thực hành cho tất phương pháp hóa lý cho việc phát định lượng Nồng độ aflatoxin M 0,02 mg/l phát sữa lỏng Các aflatoxin hòa tan dung môi phân cực nhẹ cloroform metanol, đặc biệt dimetylsulfoxit (là dung môi sử dụng phương tiện việc áp dụng aflatoxin vào động vật thực nghiệm) aflatoxin tan nước dao động khoảng từ 10 -20 mg/l.[2] Các aflatoxin bền nhiệt độ cao không bị phân hủy đun nóng thông thường mà bị ph©n hđy hÊp ë 120oC 30 Do ®ã nã vÉn cã thĨ tån t¹i thùc phÈm mà có mặt nấm mốc Tuy nhiên để không khí đặc biệt tia tử ngoại aflatoxin lại tương đối không bền Đào Thị Thanh Xuân Các aflatoxin dung môi cloroform benzen bền vững giữ điều kiện tối nhiệt độ thấp Các aflatoxin bị phá hủy hoàn toàn việc xử lý mạnh amoniac hypoclorit Sự có mặt vòng lacton phân tử aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thủy phân môi trường kiềm, đặc tính quan trọng trình chế biến thực phẩm xử lý kiềm làm giảm nhiễm aflatoxin sản phẩm thực phẩm Tuy nhiên sau trình xử lý kiềm axit hóa làm phản ứng ngược trở lại để tạo aflatoxin [4] Các aflatoxin bền với enzym tiêu hoá, aflatoxin B phân tử mỡ có lượng phân tử thấp dễ dàng hấp thụ sau ăn Sự chuyển hoá aflatoxin B đường tiêu hoá nhờ hoạt động tương tác protein niêm mạc ống tiêu hoá tạo sản phẩm AFB – epoxie, AFB – dihydrodiol hc AFB 2α AFB sản phẩm chuyển hóa tiết qua ba co đường là: qua mật, nước tiểu sữa (sản phẩm AFB qua sữa AFM ) người ta đà xác định có tương quan tuyến tính AFB ăn vào lượng AFM sữa Lượng AFM sữa ước tính khoảng 1% lượng AFB ăn vào Chính mà động vật ăn sản phẩm nhiễm aflatoxin sữa sản phẩm chúng bị nhiễm loại độc tố 1.3 Nấm mốc có khả sinh aflatoxin 1.3.1 Các loại nấm sinh aflatoxin Nấm mốc sinh độc tố Aflatoxin chđ u thc chi Aspergillus Chi Aspergillus ph©n bè rộng rÃi khắp trái đất có lợi có hại tuỳ theo chất chúng sử dụng.Trong ®ã ng­êi ta nhËn thÊy A.flavus vµ A.parasiticus cã mèi quan hệ chặt chẽ cấu trúc gen hai loài có khả sinh độc tố aflatoxin mạnh Việc xác định loài sinh aflatoxin 10 Đào Thị Thanh Xuân Nhìn vào bảng kết ta thấy chủng thuộc nhóm A.flavi biểu gen 3.12 Khảo sát biểu gen avnA chủng nấm mốc Các gen avnA, omtA, omtB ordA gen cấu trúc mà hoá enzym xóc t¸c chun ho¸ c¸c chÊt trung gian qu¸ trình sinh tổng hợp aflatoxin Mồi sử dụng cho phản ứng PCR để khảo sát biểu gen dựa đoạn nucleotid bảo thủ gen Điều kiện phản ứng kết thể sau: Trình tự Các bước phản ứng PCR NhiƯt ®é (0oC) Thêi gian Chu kú BiÕn tÝnh khëi ®éng 94 BiÕn tÝnh 94 30 gi©y Bắt cặp 55 30 giây Tổng hợp 72 45 giây Lưu giữ phút 34 Hình 3.12 Kết biểu gen avnA Ghi chú: 56 Đào Thị Thanh Xuân M Marker Mẫu đối chứng âm A sojae A oryzae A niger A flavus A flavus A parasiticus A oryzae A nidudans 3.13 Khảo sát biểu gen omtA chủng nấm mốc Trình tự Các bước phản ứng PCR Nhiệt độ (0oC) Thời gian Chu kú BiÕn tÝnh khëi ®éng 94 Biến tinh 94 30 giây Bắt cặp 56 30 giây Tổng hợp 72 45 giây Lưu giữ phút 34 Hình 3.13 Kết biểu gen omtA Ghi chú: M Marker Mẫu đối chứng âm A sojae A oryzae A niger A flavus A flavus A parasiticus A oryzae A nidudans 57 Đào Thị Thanh Xuân 3.14 Khảo sát biểu gen omtB chủng nấm mốc Trình tự Các bước phản øng PCR NhiƯt ®é (0oC) Thêi gian Chu kú BiÕn tÝnh khëi ®éng 94 BiÕn tÝnh 94 30 giây Bắt cặp 55 30 giây Tổng hợp 72 45 giây Lưu giữ phút 34 Hình 3.14 KÕt qu¶ biĨu hiƯn gen omtB Ghi chó: M Marker Mẫu đối chứng âm A sojae A oryzae A niger A flavus A flavus A parasiticus A oryzae A nidudans 58 Đào Thị Thanh Xuân 3.15 Khảo sát biểu gen ordA chủng nấm mốc Trình tự Các bước phản ứng PCR Nhiệt độ (0oC) Thêi gian Chu kú BiÕn tÝnh khëi ®éng 94 phút Biến tính 94 30 giây Bắt cặp 55 30 giây Tổng hợp 72 45 giây Lưu giữ phút 34 Hình 3.15 Kết biểu gen ordA Ghi chó: M Marker MÉu ®èi chøng ©m A sojae A oryzae A niger A flavus A flavus A parasiticus A oryzae A nidudans 59 Đào Thị Thanh Xuân Các kết cho thấy biểu gen đồng có chủng không thuộc chi A.flavi không biểu gen 3.16 Khảo sát biểu gen pksA chủng nấm mốc pksA tham gia vào trình chuyển hoá acetate thành NOR Mặc dù trình có thự tham gia gen fas1 vµ fas2 nh­ng pksA lµ gen quan träng trình sinh tổng hợp aflatoxin Trình tự Các bước phản ứng PCR Nhiệt độ (0oC) Thời gian Chu kú BiÕn tÝnh khëi ®éng 94 BiÕn tính 94 30 giây Bắt cặp 60 30 giây Tổng hợp 72 45 giây Lưu giữ phút 34 Hình 3.6 Kết biểu gen pksA Ghi chú: M Marker Mẫu đối chứng âm A sojae A oryzae A niger A flavus A flavus A parasiticus A oryzae A nidudans 60 Đào Thị Thanh Xuân 3.17 Khảo sát biểu gen aflR-FacB chủng nấm mốc Trình tự Các bước phản ứng PCR NhiƯt ®é (0oC) Thêi gian Chu kú BiÕn tÝnh khëi ®éng 94 BiÕn tinh 94 30 gi©y Bắt cặp 58 30 giây Tổng hợp 72 45 giây Lưu giữ phút 34 Hình 3.17 Kết biĨu hiƯn gen aflR-FacB Ghi chó: M Marker MÉu ®èi chøng ©m A sojae A oryzae A niger A flavus A flavus A parasiticus A oryzae A nidudans 61 Đào Thị Thanh Xuân Bảng 3.1 Tổng kết sù biĨu hiƯn gen aflatoxin ë c¸c chđng nÊm mèc Gene A B aflR + + aflR- + C + D E F G + + + + + + + + H FacB aflRstop + + + + + aflJ + + + + + adhA + + + + + estA + + + + + Ver1 + + + + VerA + + + + + + avnA + + + + + + verB + + + + + + avfA + + + + + + omtA + + + + + + omtB + + + + + + ordB + + ordA + + pksA + + + + + + + + + + Ghi chó: A A sojae B A oryzae C A niger D A flavus E A flavus F A parasiticus G A oryzae H A nidudans 62 Đào Thị Thanh Xuân + Nhìn vào bảng tổng kết kết cho thấy chủng nấm mốc thuộc nhóm A.flavi tương đồng cấu trúc gen, chúng biểu hầu hết gen cụm gen aflatoxin Cã chđng lµ A.flavus1 vµ A.parasiticus mang đầy đủ gen cần thiết cho trình sinh tổng hợp aflatoxin đồng thời không biểu gen aflRstop hai chủng Vì đến kết luận A.flavus1 A.parasiticus hai chủng sinh độc tố aflatoxin Từ cho ta thấy để xác định chủng nấm mốc sinh độc tố aflatoxin không thiết phải xác đinh tất gen cụm gen aflatoxin ChØ thùc hiÖn trÖn mét sè gen quan trọng mà chủng nấm mốc không biểu gen không sinh aflatoxin, đồng thời không biểu aflR stop 63 Đào Thị Thanh Xuân 3.19 Kiểm tra khả sinh aflatoxin Sắc ký mỏng TLC Các chủng nấm sử dung nghiên cứu biểu gen aflatoxin, nuôi môi trường rắn Malt extract để kiểm tra khả tiết aflatoxin cuar chủng Kết thể hình sau: M Hình 3.18 Kết kiểm tra khả sinh aflatoxin b»ng TLC Ghi chó: A flavus A parasiticus A niger A Oryzae M Marker A flavus A sojae A oryzae A nidudans KÕt qu¶ kiĨm tra kh¶ sinh độ tó aflatoxin chủng cho thấy, cã hai chđng A.flavus vµ A.parasiticus tiÕt aflatoxin môi trường nuôi cấy Kết hoàn toàn trùng hợp với kết nghiên cứu biểu gen aflatoxin chủng nấm mốc nghiên cứu 64 Đào Thị Thanh Xuân Phần IV Kết luận Qúa trình nghiên cứu xây dựng phương pháp xác đinh nhanh chủng nấm mèc sinh ®éc tè aflatoxin b»ng kü tht PCR chóng tôirút số kết luận sau: - Các chđng nÊm mèc thc chi A.flavi cã cơm gen sinh aflatoxin có độ tương đồng cao - Các chủng sinh aflatoxin mang đầy đủ gen cần thiết cho trình sinh tổng hợp đồng thời không biểu gen aflRstop - Xây dựng phương pháp xác đinh nhanh chủng nấm mốc sinh độc tố dựa sè måi quan träng lµ aflR, ver1, omtB, avfA vµ aflRstop Kiến nghị Vì thời gian thực luận văn có hạn chưa hoàn thiện phương pháp đồng thời chưa thử nghiệm rộng rÃi chủng nấm mốc khác Do nghiên cứu nên sâu hoàn thiện để phương pháp trở thành công cụ cho việc xác đinh chủng nấm mốc gây nhiễm độc tố aflatoxin nông sản sản phẩm thực phẩm 65 Đào Thị Thanh Xuân Tài liệu tham khảo Nguyễn Hồng Miên, NÊm mèc ®é thùc phÈm , NXB Khoa häc Kỹ thuật Hà Nội, 1980 Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, Vi nấm dùng công nghệ sinh häc, NXB Khoa häc vµ Kü thuËt Hµ Néi, 2000 Lê Văn Lương, Quyền Đình Thi Kỹ thuật di truyền ứng dụngNXB Đại học Quốc Gia HN, 2004 Nguyễn Thuỳ Châu Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc độc tố chúng Ngô, Gạo Việt Nam biện pháp phòng trừ Luận án Phó tiÕn sÜ khoa häc sinh häc Rendoll J.Matin and Paul T Rygienwicn Fungal specific PCR primer developed for analysis of the ITS regon of environmental DNA extract, BMC Microbiology, 2005 Zheng – You Yang, Won-Bo-Shim, Ji-Hun Kim, Duck- Hwa- Chung, Detection of aflatoxin – Production Mold in Korean Fermented Food and Grain by Multiplex PCR, College of Medicin (504-510), 2004 Kenneth C Ehrich, Peter J Cotty An isolate of Aspergillus flavus used to aflatoxin contamination in cottonseed has defective polykedide synthase, Appl Microbiol Biotechnol, 2004 8.Jiujang Yu,Charles P.Woloshuk, Deepak Bhatnagar, Thomas E.Cleveland, Cloning and charaterization of avf Aand omt Bgenes involvod in aflatoxin Biosynthesis in three Aspergillus species BMC Microbiology (105-200), 2001 66 Đào Thị Thanh Xuân Tranvis Henrry,Peter C Iwen, H Hinrichs.Indefinecation of Apergillus species using Interal transcribed spacer Region and 2.American Society for Microbiology(2-5), 2001 10 Kendall J Martin, Paul T Rygieewicz, Fungi specific PCR pimer developed for analysis of ITS region of enviromental DNA extraction.BCM Microbiology(1-8), 2005 11 K.Matsushima,P.-K Chang, J.Yu, K.Abe, D.Bhatnagar, T.E.Cleveland Pre-termination in aflR of Aspergillus sojae inhibits aflatoxin biosinthesis Apply Microbiol Biotechnol, 2001 (585-589) 12 Gregory R.OBrian, Ahmad M.Fakhoury, and Gary A.Payne Identification of genes differentially expressed during aflatoxin biosynthesis in Aspegillus flavus and Aspegillus parasiticus Fungal Genetics and Biology 39 ,2003 (118-127) 13 Michael J Miller, Ludmila V Roze, Frances Trail and John E.Linz Role of cis –Acting Sites Norl, a TATA Box, and AflR1 in nor-1 Transcriptional Activation in Aspegillus parasiticus, American Society for Microbiology 2005 (539-1545) 14 Jiujiang, Perng-Kuang Chang, Kenneth C.Ehrlich, Jeffrey W.Cary, Deepak Bhatnagar,Thomat E.Cleveland, Gary A.Payne, Jonh E.Linz, Charles P.Roloshuk and Joan W.Bennett Clusted Pathway Genes in Aflatoxin Biosynthesis American Society for Microbiology, 2004 (2531262) 15 Perng-Kuang Chang, Jiujiang Yu, Jae-Hyuk Yu aflT a MFS transporter-encoding gene located in the aflatoxin gene cluster,does not have a significant role in aflatoxin secretion Fungal Genetics and Biology 41, 2004 (911-920) 67 Đào Thị Thanh Xu©n 16 Kenneth C Ehrlich, Beverly G.Montalbano, Jeffrey W.Cary, Peter J Cotty Promoter elements in the aflatoxin patrhway polyketide synthase gene Biochimica et Biophisica Acta 1576(2002)171-175 17 Jiujiang Yu, Catherin A.Whitelaw, William C.Nierman, Deepak Bhatnagar, Thomas E.Cleveland Aspegillus flavus expressed sequence tags for identification genes with putative roles in aflatoxin contamination of crops FEMS Microbiology Letters 237(2004) 333-340 18 Jiujiang Yu, Charles P.Woloshuk, Deepak Bhatnagar, Thomas E.Cleveland, Cloning and characterization of avfA and omtB gene involved in aflatoxin biosynthesis in three Aspergillus species Gen 248, 2000 (157167) 19 Jiujiang Yu, Deepak Bhatnagar, Thomas E Cleveland Completed sequence of aflatoxin parthway gene clusted in Aspergillus parasiticus FEBS Letters 564, 2004 (126-130) 20 Michael S.Price, Shannon B.Conners, Sabrina Tachdjian, Robert M.Kelly, Gary A.Payne Aflatoxin conductive and nonconductive growth conditions reveal new gene association with aflatoxin production Fungal Genetics and Biology 42, 2005 (506-518) 21 Kenneth C Ehrlich, Perng – Kuang Chang, Jiujiang Yua and Peter Cotty Aflatoxin Biosynthesis Cluster Gene cypA Is Required for G Aflatoxin Formation Applied and Envirenmental Microbiology, Nov 2004 (6518-6524) 22 Ursula Konietzy, Ralf Greiner The application of PCR in the detection of mycotoxigenic fungi in food Brazillian Journal of Microbiology, 2003 – 34 (283-300) 23 Kenneth C Ehrlich, Peter J Cotty An isolate of Aspergillus flavus to reduce aflatoxin contamination in cottonseed has a defective polyketide synthase gen App Microball Biotechnol, 2004-65 (473-478) 68 Đào Thị Thanh Xu©n 24 N.Mahanti, D.Bhatnagar, J.W Cary, J Joubran and J E Linz Structure and Function of fas-1A, a Gene Enciding a Putative Fatty Acid Synthetase Directly Involved in Aflatoxin Biosynthesis in Aspergillus parasiticus Applied and Environmental Microbiology, 1996 (191-195) 25 Mihoko Tominaga, Yun-Hae Lee, Risa Hayashi, Yuji Suzuki, Osamu Yamada, Kazuioshi Sakamoto, Kuniyasu Gotoh and Osamu Akita Molocular Analysis of an Inactive Aflatoxin Biosunthesis Gene Cluster in Aspergillus oryzae RIB Strains Applied and Environmental Microbiology, 2006 (484 - 490) 69 Đào Thị Thanh Xuân Tóm tắt luận văn A.parasiticus, A.flavus, A sojae, A oryzae, A.nidudans,A.niger loài thuộc nhóm Aspergilus Trong nhóm có loài có khả sinh tổng hợp aflatoxin có loài không Đặc biệt A sojae, A oryzae lµ hai loµi thc nhãm A.flavi chóng có mối quan hệ gần gũi với A.parasiticus Aflavus Cả hai loài không sinh aflatoxin chúng có gen aflR số gen khác tương ®ång víi c¸c gen cơm gen aflatoxin Trong ®Ị tài sử dụng chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus trường đại học KHTN viện Công nghệ thực phẩm cung cấp để khảo sát biểu gen cụm gen aflatoxin phản ứng PCR Mồi cho phản ứng PCR dựa đoạn bảo thủ gen điểm đột biến đoạn gen Với mục đích tìm gen đặc hiệu trình sinh tổng hợp aflatoxin để xây dựng phương pháp xác đinh nhanh chủng sinh độc tố Nội dung nghiên cứu: - ThiÕt kÕ måi cho c¸c gen cơm gen sinh tổng hợp aflatoxin - Khảo sát biểu gen cụm gen aflatoxin chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus - Kiểm tra lại khả sinh độc tố chủng nấm mốc phương pháp sắc ký mỏng TLC - Xây dựng phương pháp xác định nhanh chủng nấm mốc sinh aflatoxin phương pháp PCR 70 Đào Thị Thanh Xuân ... chủng nấm mốc thuộc nhóm Aspergillus - Kiểm tra lại khả sinh độc tố chủng nấm mốc phương pháp sắc ký mỏng TLC - Xây dựng phương pháp xác định nhanh chủng nấm mốc sinh aflatoxin phương pháp PCR. .. có gai, chủng sinh độc tố có phình to phần sợi sợi nấm tạo thành mắt nhỏ [1] Tuy nhiên dựa vào đặc điểm hình thái khó để xác định xác chủng sinh hay không sinh aflatoxin 1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng... kiện sinh độc tố Khả sinh độc tố phụ thuộc vào nhiều yếu tố, chủng nấm mốc, nhiệt độ, yếu tố môi trường Lượng aflatoxin sản sinh thay đổi phụ thuộc vào yếu tố Một số chủng sinh aflatoxin bị khả sau