Xây dựng phương pháp xác định s allyl cystein trong tỏi và chế phẩm tỏi bằng sắc ký lỏng

Vì vậy, tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp xác định S-allyl cysteine trong tỏi và chế phẩm tỏi bằng sắc ký lỏng” để góp phần phục vụ công tác kiểm nghiệm và cung cấp thêm các l

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI – 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin được cảm ơn ThS Đặng Thị Ngọc Lan – Giảng

viên Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội, người

đã chỉ bảo, giúp đỡ và động viên em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin được bày tỏ lòng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc tới

ThS Vũ Ngân Bình và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa phân

tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện tốt nhất và giúp đỡ em trong quá trình học tập, nghiên cứu tại bộ môn

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng toàn thể các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã trang bị cho em những kiến thức và kỹ năng trong thời gian em theo học dưới mái trường

Cuối cùng, lời cảm ơn thân thương nhất em muốn gửi đến gia đình, bạn

bè, những người đã luôn động viên và âm thầm giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Đặng Thị Thùy Linh

MỤC LỤC

Lời cảm ơn

Mục lục

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng, biểu

Danh mục các hình vẽ, đồ thị

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về tỏi 2

1.1.1 Tổng quan về tỏi tươi 2

1.1.2 Tổng quan về tỏi đen 3

1.2 Tổng quan về SAC 5

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất 5

1.2.2 Tác dụng dược lý 5

1.2.3 Các phương pháp xác định 6

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng 9

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng 9

1.3.2 Nguyên tắc của sắc ký tạo cặp ion 10

1.3.3 Nguyên tắc của phương pháp tạo dẫn xuất 10

1.3.4 Ứng dụng 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 12

2.1.1 Đối tượng 12

2.1.2 Nguyên liệu 12

2.1.3 Thiết bị 13

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký 13

2.3.2 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký 13

2.4 Thẩm định phương pháp định lượng 13

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 16

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 17

3.1 Chuẩn bị các dung dịch 17

3.2 Khảo sát 17

3.2.1 Khảo sát quy trình định lượng trực tiếp 17

3.2.2 Khảo sát quy trình định lượng bằng tạo cặp ion 19

3.2.3 Khảo sát quy trình định lượng bằng tạo dẫn xuất 21

3.3 Thẩm định phương pháp định lượng 29

3.3.1 Độ chọn lọc 29

3.3.2 Độ phù hợp của hệ thống 31

3.3.3 Đường chuẩn 32

3.3.4. Độ lặp lại của phương pháp 33

3.3.5 Độ đúng của phương pháp 34

3.3.6 Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ 35

3.3.7 Hiệu suất chiết 35

3.4 Xác định hàm lượng SAC trong mẫu tỏi đen, tỏi tươi, cao tỏi 36

3.5 Bàn luận 37

3.5.1 Lựa chọn phương pháp 37

3.5.2 Điều kiện xử lý mẫu 38

3.5.3 Xây dựng phương pháp định lượng 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

DAD Diod Array Detector Detector mảng diod

HPLC High Performance Liquid

Chromatography Sắc kí lỏng hiệu năng cao MeOH Methanol

MS Mass Spectrometry Khối phổ

RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối SAC S-allyl-L-cystein

SD Standard Deviation Độ lệch chuẩn

S/N Signal/Noise Tín hiệu/Nhiễu đường nền UV-VIS Ultraviolet Visible Phổ tử ngoại – Khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

1.1 Các nghiên cứu định lượng SAC trong tỏi đen và chế

vào

35

3.8 Kết quả xác định hàm lượng của SAC trong mẫu tỏi và

chế phẩm tỏi

37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1.2 Sơ đồ chuyển GSAC thành SAC nhờ enzym γ-GTP 4

3.1 SKĐ của mẫu chuẩn ở điều kiện sắc ký 1 18 3.2 SKĐ của mẫu thử ở điều kiện sắc ký 1 18 3.3 SKĐ của mẫu chuẩn ở điều kiện sắc ký quy trình 3 20 3.4 SKĐ của mẫu tỏi đen ở điều kiện sắc ký quy trình 3 20 3.5 SKĐ của mẫu tỏi trắng với pha động là đệm phosphat 22 3.6 SKĐ của mẫu tỏi đen với pha động là đệm phosphat 22 3.7 SKĐ của mẫu tỏi đen với pha động là đệm acetat 22 3.8 SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 1 23 3.9 SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 2 24 3.10 SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 3 24 3.11 SKĐ chuẩn SAC theo chương trình gradient 4 25 3.12 Phổ UV của sản phẩm dẫn xuất hoá của SAC 26 3.13 SKĐ của mẫu thử khi chiết bằng nước 26 3.14 SKĐ của mẫu thử khi chiết bằng hệ dung môi

3.19 SKĐ của chuẩn SAC 30

3.22 Mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ

SAC

33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tỏi là cây trồng phổ biến ở nước ta Trong những năm gần đây, tỏi và các chế phẩm tỏi (điển hình là tỏi đen) thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên cứu do có tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự phát triển của ung thư Sau quá trình lên men tỏi tạo thành tỏi đen, khả năng chống oxy hóa của tỏi tăng lên đáng kể [6], [13] Hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong tỏi đen cũng tăng tên, trong đó đáng chú ý là S-allyl-L-cystein (SAC) Đây là chất có hoạt tính chống oxy hóa, ức chế sự phát triển ung thư, hạ đường huyết và hạ cholesterol [16]

Hiện nay tỏi đen được sử dụng khá phổ biến nhưng chưa có tiêu chuẩn

cụ thể đối với chất lượng của tỏi đen Ở Việt Nam các nghiên cứu về SAC trong tỏi đen vẫn còn khá ít Năm 2012, Học viện quân y đã nghiên cứu định lượng SAC trong tỏi đen bằng HPLC [3] Tuy nhiên, nghiên cứu này còn nhiều hạn chế do ảnh hưởng khá nhiều của nền mẫu Do đó cần xây dựng một phương pháp tách tốt hơn để định lượng SAC trong tỏi đen Bên cạnh đó, ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu về hàm lượng SAC trong tỏi tươi và các chế phẩm

tỏi khác như cao tỏi Vì vậy, tôi tiến hành đề tài “Xây dựng phương pháp xác

định S-allyl cysteine trong tỏi và chế phẩm tỏi bằng sắc ký lỏng” để góp phần

phục vụ công tác kiểm nghiệm và cung cấp thêm các lựa chọn cho các nhà phân tích với hai mục tiêu sau:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng SAC trong tỏi và chế phẩm tỏi bằng sắc kí lỏng

2 Ứng dụng phương pháp trên để định lượng SAC trong tỏi và một số chế phẩm tỏi trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về tỏi

1.1.1 Tổng quan về tỏi tươi

a Đặc điểm thực vật và phân bố:

Tỏi, còn được gọi là đại toán, có tên khoa học là Allium sativum L., họ

Hành (Aliaceae) Tỏi là cây thảo, thân hành, hình trụ ép vào nhau quanh một

trục lõi, phía dưới mang nhiều rễ phụ Lá phẳng và hẹp, hình dài, mỏng, bẹ to

và dài có rãnh dọc, đầu nhọn hoắt, gân song song, hai mặt nhẵn Cụm hoa mọc

ở ngọn, bao bọc bởi những lá mo có mũi nhọn rất dài, hoa màu trắng hay hồng

có cuống hình sợi dài, bao hoa gồm 6 phiến hình mũi mác, xếp thành hai hàng,

thuôn, nhị 6 chỉ nhị có cựa dài, dính vào các mảnh bao hoa, bầu gần hình cầu

Quả nang [5] Bộ phận dùng là củ tỏi Tại Việt Nam có nhiều vùng đất trồng

tỏi nổi tiếng như: Lý Sơn, Phan Rang

b Thành phần hóa học:

Tỏi tươi chứa khoảng 62,8% nước, 6,3% protein, 0,1% chất béo, 29%

hydratcacbon, Ca 0,00003%, P 0,000031, Fe 0,0013%, vitamin C 0,013%

Thành phần chủ yếu trong tỏi là allicin (C6H10OS2) một hợp chất chứa

lưu huỳnh có tính kháng khuẩn, đặc biệt là đối với chủng Staphllococcus,

thương hàn, phó thương hàn, tả, trực khuẩn bạch hầu, vi khuẩn thối Allicin

được taọ thành từ alliin nhờ enzym alliinase theo phản ứng sau [2]

alliinase Alliin Allicin

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển Alliin thành Allicin

Allicin rất dễ kết hợp với cystein, một acid amin chứa gốc SH tạo thành

C6H11O2S2 Gốc SH có vai trò quan trọng trong sự sinh sản của vi khuần Nhờ

đó allicin ức chế sự sinh sản của vi khuẩn [2]

Trong tỏi chứa hợp chất polysaccharid có Se-GPS ức chế sự phá hoại màng hồng cầu và có khả năng vận chuyển gốc tự do có oxy hoạt động [5] Ngoài ra trong tỏi còn có một số hợp chất saponin steroid có hoạt tính chống nấm và một số pectin như arabinose, manose, glucose [5]

c Công dụng

Tỏi được sử dụng như một gia vị phổ biến trong bữa ăn hằng ngày Ngoài

ra tỏi còn được biết đến trong vai trò một vị thuốc Đông y vị cay, tính ôn, quy kinh can và vị với tác dụng thanh nhiệt giải độc, sát trùng, chữa băng đới, nhọt, hạch ở phổi, tiêu đờm, đầy chướng, đại tiểu tiện khó [2]

Tỏi có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm, ức chế sự phát triển của tụ

cầu vàng, trực khuẩn lao, E Coli, trực khuẩn mủ xanh, Candida… [2] Tỏi làm

giảm cholesterol và lipid huyết tương, sự chuyển hóa mỡ do ức chế enzym HMG-CoA reductase [5] Tỏi cũng có tác dụng chống tăng huyết áp và tác dụng

hạ đường huyết khi dùng cao nước, cồn tỏi hoặc bột tỏi [26] Tỏi có tác dụng chống oxy hóa và thu dọn gốc tự do, ức chế sự oxy hóa LDL [5] Tỏi còn được dùng chữa các bệnh hô hấp như viêm phổi, hen suyễn hay hen mãn tính do ức chế giải phóng histamin khỏi tế bào ưa kiềm và tế bào mast [17]

1.1.2 Tổng quan về tỏi đen

Mặc dù có rất nhiều tác dụng, tỏi có mùi hôi rất khó chịu do có chứa allicin và các thành phần gây mùi khác Vì vậy, các nhà khoa học Nhật Bản, Hàn Quốc đã nghiên cứu lên men tỏi tươi tạo ra tỏi đen để khắc phục nhược điểm này Tỏi đen là sản phẩm lên men từ tỏi tươi ở nhiệt độ 70-80oC và độ ẩm thích hợp trong 1-3 tháng [20] Sản phẩm thu được có màu đen vị ngọt, không

còn mùi vị hăng cay của tỏi tươi do enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóa alliin thành allicin bị ức chế bởi độ ẩm của quá trình chế biến tỏi đen [8]

Trong quá trình lên men sẽ xảy ra phản ứng chuyển hoá các hợp chất chứa lưu huỳnh như methionin, cystein, methanethiol thành những hợp chất mới chứa lưu huỳnh tan được trong nước như S-allyl-L-cystein, alliin, isoalliin, cycloalliin, các dẫn chất của cystein, dẫn chất tetrahydro-β-carboline [28] Quy trình lên men tự nhiên cũng làm cho hàm lượng carbohydrat tăng từ 28,7% (trong tỏi) lên tới 47,9% (trong tỏi đen), nhờ đó tỏi đen có vị ngọt của trái cây

vì trong thành phần tỏi có chứa đường, acid amin và sau quá trình lên men sẽ tạo ra melanoidin, một chất có màu sẫm đen Do đó tỏi sau khi lên men tự nhiên

sẽ chuyển thành màu đen, vị ngọt, không còn mùi cay, hăng của tỏi thông thường

Đặc biệt sau khi lên men hàm lượng SAC trong tỏi đen tăng lên đáng kể,

có thể cao hơn gấp 5-6 lần trong tỏi tươi [10] Hàm lượng SAC thay đổi rất nhiều phụ thuộc vào điều kiện lên men như nhiệt độ hay thời gian lên men Sang Eun Bae và các cộng sự đã chỉ ra rằng khi lên men ở 40oC hàm lượng SAC trong tỏi đen sẽ cao nhất vì đó là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym γ-GTP (γ-glutamyl transpeptidase) xúc tác cho phản ứng thủy phân chuyển GSAC (glutamyl-S- allylcysteine) thành SAC [11] Sơ đồ của phản ứng này được thể hiện ở hình 1.2

γ-GTP GSAC SAC

Hình 1.2 Sơ đồ chuyển GSAC thành SAC nhờ enzym γ-GTP

Như vậy sau quá trình lên men, hàm lượng SAC trong tỏi tăng lên do sự chuyển hóa các hợp chất chứa lưu huỳnh như methionin, cystein, methanethiol

và phản ứng thủy phân chuyển GSAC thành SAC Hàm lượng SAC tăng lên trong tỏi đen làm dịch chiết tỏi đen có một số tác dụng vượt trội so với tỏi tươi như: tác dụng chống oxy hóa, tăng cường miễn dịch, ức chế tế bào ung thư [28]

1.2 Tổng quan về SAC

1.2.1 Cấu trúc hóa học và tính chất

SAC có danh pháp IUPAC: (R)-3-(Allylthio)-2-aminopropanoic acid và

có các tên gọi khác nhau như S-allylcystein, L-deoxyalliin Liên kết -C-S- là phần hoạt động mạnh nhất của phân tử SAC, mang đến hoạt tính sinh học của phân tử này Công thức cấu tạo của SAC được thể hiện ở hình 1.3

Hình 1.3 Công thức cấu tạo S- allyl cystein

SAC có công thức hóa học: C6H11NO2S, khối lượng phân tử: 161,222 Điểm nóng chảy: 223,3 – 223,7oC, điểm sôi: 300oC

SAC tan tốt trong nước: 137 mg/ml, pKa1=2,53; pKa2= 9,14

SAC không có hệ liên kết đôi liên hợp nên khả năng hấp thụ tử ngoại – khả kiến (UV-VIS) rất kém

b Tác dụng trong điều trị ung thư

SAC được chứng minh có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư tuyến tiền liệt,

ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư CWR22 [14], ức chế sự phát triển và

di căn của ung thư gan [21] Ngoài ra, SAC còn được biết đến với các tác dụng

ức chế sự phát triển của ung thư phổi tế bào không nhỏ [30]

c Tác dụng với đường huyết

Tác dụng bảo vệ của SAC trên tuyến tụy được thí nghiệm trên mô hình chuột bị gây tiểu đường bằng streptozotocin (STZ) Mức đường huyết được kiểm soát sau khi sử dụng SAC Hiệu quả của SAC được so sánh với glyclazide, một thuốc hạ đường huyết Những phát hiện này gợi ý rằng SAC có tác dụng

điều trị trong tiểu đường [24] Đối với những người mắc bệnh tiểu đường thì

SAC giúp tăng sản xuất insulin giúp vận chuyển glucose đi đến các tế bào, làm

hạ đường huyết [25]

d Tác dụng với các bệnh lý thần kinh

SAC làm giảm đáng kể tình trạng thiếu máu não và chảy máu não, chống lại quá trình oxy hóa và ngăn chặn các tổn hại đến tế bào thần kinh, giúp làm giảm tổn thương não sau khi bị tắc động mạch não [9] SAC có tác dụng hạn chế một số bệnh lý liên quan đến thoái hóa synap thần kinh và các bệnh viêm khớp có liên quan đến Alzheimer [23]

e Nâng cao miễn dịch

Dịch chiết tỏi đen làm tăng cường hệ thống miễn dịch trên chuột [31]

f Tác dụng khác

SAC có tác dụng bảo vệ tim, giảm kích thước nhồi máu, tỉ lệ tử vong trong điều trị nhồi máu cơ tim [27] SAC giúp cải thiện cholesterol máu thông qua cơ chế làm gián đoạn chuyển hóa cholesterol [29]

1.2.3 Các phương pháp xác định

Một số phương pháp phân tích SAC trong tỏi và tỏi đen được liệt kê

trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Các nghiên cứu định lượng SAC trong tỏi đen và chế phẩm

tỏi

Tên tác giả Mẫu Chuẩn

bị mẫu Pha tĩnh Pha động Detector LOD,

H 3 PO 4 0,1%

trong nước và ACN

UV

LOQ 28,2 ng/ml, LOD 8,46 ng/ml

NaH 2 PO 4 , acid heptanesulfonic, pH= 2,1 và ACN

LOD 29,67 µg/ml

Sanghee Lee

và cộng sự

(2014) [18]

Nước ép tỏi tươi đun nóng

Nước

Tạo dẫn xuất với dansyl clorid

C18 (250x 4,6 mm; 5 µm)

CH 3 COONa và MeOH

LOD 0,23 µg/g, LOQ 0,71 µg/g

Sang Eun Bae

C18 Tag (150x3,9 mm)

AccQ-AccQ-Tag (CH 3 COONa

140 mM, triethylamin 17

mM, EDTA 1

mM, pH 5,05), ACN, nước

FLD

LOD 6,28 µg/ml, LOQ 19,02 µg/ml

Acid formic 0,1% trong amoni acetat 20

mM (pH 3,5) và acid formic 0,1% trong ACN

MS

LOD 0,02 µg/ml

SAC trong nước ép tỏi, tỏi đen được chiết bằng dung môi nước hoặc methanol ở nhiệt độ thường hoặc 40oC, 70oC Phương pháp được sử dụng phổ biến để phân tích SAC trong tỏi đen là HPLC kết nối với các detector khác nhau Trong đó có 3 detector chính là hấp thụ UV-VIS, huỳnh quang (FLD) và khối phổ (MS)

a Phương pháp HPLC với detector UV

SAC trong tỏi đen có thể được phân tích trực tiếp không qua tạo dẫn xuất; tạo cặp ion hoặc dẫn xuất hoá với dansyl clorid trước khi phân tích bằng HPLC

- Chử Văn Mến và các cộng sự đã ứng dụng và phát triển phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UV để xác định trực tiếp hàm lượng SAC trong tỏi đen Lý Sơn [3] Các tác giả sử dụng điều kiện phân tích sắc ký khá đơn giản: Cột optimapak C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm), pha động gồm dung dịch

H3PO4 0,1% trong nước và ACN, bước sóng phát hiện ở 210 nm Tuy nhiên trên sắc ký đồ, pic của SAC chưa được tách hoàn toàn khỏi nền mẫu thử

- Tác giả Arnault và cộng sự [8] đã phát triển phương pháp xác định SAC trong tỏi đen, sử dụng kỹ thuật tạo cặp ion Tác giả sử dung cột Hypurity Elite C18 (150 × 3 mm; 3µm), pha động bao gồm 20 mM NaH2PO4 và 10 mM acid heptanesulfonic trong nước, pH= 2,1 (điều chỉnh bằng acid orthophosphoric

850 mL/L) và ACN Bước sóng phát hiện là 208 nm Giới hạn phát hiện của phương pháp là 29,67 µg/mL, còn tương đối cao

- Tác giả Sanghee Lee và cộng sự [18] đã phát triển phương pháp HPLC bằng cách tạo dẫn xuất của SAC với dansyl clorid (Dns-Cl) Tác giả lấy 0,1 mL dịch ép tỏi trộn với 0,25 mL thuốc thử dansyl clorid (Dns-Cl) 10 mM trong ACN và 0,65 mL đệm borat 20 mM (pH 9,2) ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Sản phẩm sau đó được lọc và chạy HPLC

Tác giả sử dụng cột C18 (250 x 4,6 mm; 5 μm); pha động gồm natri acetat 50 mM (điều chỉnh pH về 5 bằng acid formic) và methanol (MeOH); thể tích tiêm 10 µl; bước sóng phát hiện 250 nm LOD là 0,23 µg/g, LOQ là 0,71 µg/g Tuy nhiên thời gian phân tích dài (72 phút)

b Phương pháp sắc ký lỏng với detector huỳnh quang

- Năm 2012, Sang Eun Bae và các cộng sự [10] đã phát triển và thẩm định phương pháp xác định SAC trong tỏi đen bằng cách tạo dẫn xuất với AccQ-Flour (1-[(quinolin-6-ylcarbamoyl)oxy]pyrrolidin-2,5-dion)

Mẫu được phản ứng với thuốc thử AccQ-Flour (khoảng 10 mM AccQ-Flour trong ACN) Tác giả sử dụng cột C18 AccQ-Tag (150 x 3,9 mm; 4µm), nhiệt

độ cột 37oC Bước sóng kích thích là 250 nm và bước sóng phát xạ là 395 nm Pha động gồm AccQ-Tag (140 mM CH3COONa, 17 mM triethylamine, 1 mM EDTA, pH 5,05), ACN và nước

Phương pháp này có LOD là 6,28 µg/mL và LOD là 19,02 µg/mL Trong phân tích SAC, sử dụng phương pháp HPLC-FLD có LOD, LOQ thấp hơn xấp

xỉ bốn lần so với phương pháp định lượng trực tiếp bằng HPLC-UV

c Phương pháp sắc ký lỏng với detector khối phổ LC/MS/MS

- Tác giả Sanghee Lee và cộng sự [18] đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối với detector khối phổ (LC-MS/MS) để xác định SAC từ tỏi Tác giả sử dụng cột C18 Zorbax Eclipse XDB (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm) Pha động bao gồm dung dịch acid formic 0,1% trong amoni acetat 20

mM (pH 3,5) và 0,1% formic acid trong ACN Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,02 µg/mL

1.3 Tổng quan về sắc kí lỏng

1.3.1 Nguyên tắc của sắc ký lỏng

Sắc kí lỏng là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở là sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng Sắc kí lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ là tùy thuộc vào pha tĩnh sử dụng [1] Tùy vào ái lực với pha động và pha tĩnh mà chất phân tích

sẽ được rửa giải ra khỏi cột với tốc độ khác nhau

1.3.2 Nguyên tắc của sắc ký tạo cặp ion

Các chất phân cực khi phân tích bằng sắc ký pha đảo thông thường sẽ ít

bị lưu giữ và bị rửa giải ra sớm Một trong những phương pháp hay dùng để tăng thời gian lưu giữ các chất này là tạo cặp ion Cặp ion gồm các ion có điện tích trái dấu được giữ gần nhau không phải bằng các liên kết hóa học mà bởi lực tĩnh điện Các amin hữu cơ, muối amoni có độ dài mạch khác nhau là các tác nhân tạo cặp ion hay được sử dụng cho chất phân tích dạng anion Các sulfonat thơm hoặc sufonat mạch hydrocarbon dài là các tác nhân tạo cặp ion hay được sử dụng cho các chất phân tích dạng cation Mạch alkyl của chất tạo cặp ion càng dài và nồng độ càng cao thì lực lưu giữ chất phân tích càng lớn Ngoài ra còn có các chất tạo cặp ion dễ bay hơi như trifluoroacetic acid và heptaflourobutyric acid… Cặp ion tạo thành có ái lực với pha tĩnh lớn hơn chất phân tích ban đầu, do đó sẽ tăng lưu giữ trong sắc ký pha đảo [12]

1.3.3 Nguyên tắc của phương pháp tạo dẫn xuất

Phương pháp tạo dẫn xuất là phương pháp thực hiện phản ứng hóa học gắn nhóm chức vào chất phân tích, làm biến đổi tính chất lý hóa của chất phân tích, thuận tiện cho quá trình xử lý mẫu, tách và phát hiện chất Một phản ứng tạo dẫn xuất hay gặp là gắn các nhóm mang màu có khả năng hấp thụ UV tốt

từ một tác nhân dẫn xuất hóa vào chất phân tích Phương pháp này được áp dụng trong trường hợp chất phân tích không hấp thụ UV-VIS hoặc độ hấp thụ rất thấp, khó phát hiện bằng detector UV-VIS Dẫn xuất của chất phân tích tạo thành có khả năng hấp thụ UV-VIS tốt hơn, do đó có thể phát hiện bằng detector

UV-VIS Ngoài ra, một số phản ứng dẫn xuất hóa sinh ra sản phẩm có khả năng phát huỳnh quang và có thể phát hiện bằng detector huỳnh quang Dẫn xuất hóa cũng làm tăng khả năng tách do sản phẩm dẫn xuất hóa thường được lưu giữ lâu hơn trên cột, đặc biệt với các phân tử nhỏ và rất phân cực Như vậy phương pháp tạo dẫn xuất được sử dụng để gắn nhóm chức giúp phát hiện chất phân tích bằng detector, tăng độ chọn lọc, độ nhạy, cải thiện khả năng tách, thay đổi

độ tan, hiệu suất chiết… Dẫn xuất hóa có thể được thực hiện trước cột hoặc sau

(9-Cơ chế phản ứng với amino acid của dansyl clorid:

Dan-C1+ H2O Dan-OH +HCl (1)

Dan-C1+ amino acid Dan-amino acid + HC1 (2)

Phản ứng (1) là phản ứng thủy phân của Dan-Cl, xảy ra nhanh ở pH lớn hơn 10 [16] Phản ứng 2 xảy ra khi nhóm amin tồn tại ở dạng –NH2 Như vậy cần lựa chọn pH để phản ứng (2) xảy ra và phản ứng (1) ít xảy ra Thông thường

- Kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm chức hoặc số khối [1]

b Định lượng

Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và thiết bị

2.1.1 Đối tượng

❖ Đối tượng nghiên cứu: SAC

❖ Đối tượng phân tích: tỏi tươi, tỏi đen (một nhánh và nhiều nhánh), cao tỏi

đen

2.1.2 Nguyên liệu

❖ Chất chuẩn: SAC (Sigma Aldrich, số lô: LC43355, hàm lượng: 98%)

❖ Hóa chất, dung môi:

- Dansyl clorid (Số lô: A0380771, hàm lượng 98%)

- Acetonitril, methanol loại dùng cho HPLC (Merck, Đức)

- Triethylamin, natri tetraborat, acid borat, amoni acetat, acid acetic băng, kali dihydro phosphat, acid phosphoric (Merck, Đức)

- Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H (Đức)

- Máy lắc xoáy Labinco L46 (Hà Lan)

- Cân phân tích Satorius TE214S có độ chính xác ± 0,1 mg (Đức)

- Cân kỹ thuật Satorius TE412 (Đức)

- Máy đo pH Mettler Toledo EF20/EL20 (Thụy Sĩ)

- Màng lọc Cellulose acetat 0,45 µm (Satorius Stedim Biotech, Đức)

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát điều kiện sắc ký

- Khảo sát quy trình xử lý mẫu

- Thẩm định phương pháp định lượng

+ Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp

+ Độ phù hợp của hệ thống

+ Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

+ Độ đúng, độ lặp lại của phương pháp

+ Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chuẩn bị các mẫu chạy sắc ký

2.3.2 Khảo sát và xác định điều kiện sắc ký

a Khảo sát quy trình chiết mẫu: khảo sát dung môi chiết, số lần chiết

b Khảo sát các điều kiện sắc ký để xác định SAC

- Quy trình định lượng trực tiếp bằng sắc ký lỏng: khảo sát pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện

- Quy trình định lượng bằng tạo cặp ion: khảo sát tác nhân tạo cặp ion, pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện

- Quy định lượng SAC bằng phương pháp tạo dẫn xuất: khảo sát điều kiện dẫn xuất hoá, pha tĩnh, pha động, bước sóng phát hiện

2.4 Thẩm định phương pháp định lượng

Thẩm định phương pháp trên các tiêu chí: độ chọn lọc, khoảng tuyến tính

và đường chuẩn, độ phù hợp của hệ thống, độ đúng, độ lặp lại của phương pháp, giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ

❖ Độ tuyến tính:

- Độ tuyến tính của một phương pháp phân tích là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phân tích (x) trong khoảng xác định

Nó được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax+ b và hệ số tương quan r

- Cách xác định: Phân tích ít nhất 5 mẫu chuẩn, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa diện tíc pic và nồng độ SAC trong mẫu chuẩn Từ các thông số thu được tính toán hệ số tương quan r, yêu cầu r ≥ 0,99

❖ Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Giới hạn phát hiện (LOD): là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ

thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa với tín hiệu mẫu

trắng hay tín hiệu nền nhưng chưa thể định lượng được

- Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng bằng phương pháp khảo sát và cho kết quả có độ chính xác mong muốn

- Cách xác định: Dựa trên tỷ lệ đáp ứng so với nhiễu (S/N)

Pha loãng mẫu chuẩn đến nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N)

Trong đó S: Chiều cao tín hiệu của chất phân tích

- Độ lặp lại: là mức độ gần nhau giữa các kết quả riêng lẻ của các phép đo theo

đúng quy trình thử nghiệm được lặp lại và được biểu diễn bằng độ lệch chuẩn

S hay độ lệch chuẩn tương đối RSD (%)

- Cách xác định: Pha 6 mẫu thử riêng biệt theo quy trình chuẩn bị mẫu thử rồi tiêm vào hệ thống sắ ký và tính toán độ lệch chuẩn tương đối, với yêu cầu RSD

- Độ đúng (Độ thu hồi): là tỷ lệ phần trăm giữa giá trị thu được so với giá trị lý thuyết

- Cách xác định: Thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng SAC một lượng chính xác chất chuẩn (3 mức thêm chuẩn) sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Độ thu hồi được tính theo công thức:

𝑅(%) =𝐶𝑡 − 𝐶𝑚

𝐶𝑐 100 % Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

Ct: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử thêm chuẩn

Cm: nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Độ thu hồi được chấp nhận là đạt khi nằm trong khoảng 80-110% ở mức nồng độ 1-10 μg/g và khoảng 90% - 107% ở mức nồng độ 100 μg/g [7]

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng các phương pháp xử lý thống kê trong phân tích với các đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tính toán của Microsoft Excel 2013

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

+ Mẫu tỏi đen: cân chính xác khoảng 10 g mẫu tỏi đen đã được đồng nhất vào bình nón, thêm chính xác 50 ml nước hoặc hỗn hợp dung môi nước : methanol tỷ lệ 1:1, siêu âm 15 phút, khuấy cho tơi, siêu âm tiếp 45 phút rồi chuyển vào ống ly tâm, ly tâm 15 phút (9000 vòng/phút) và lấy dịch trong

+ Pha đệm acetat 50 mM: cân chính xác khoảng 3,854 g amoni acetat, thêm

1000 ml nước, chỉnh pH bằng acid acetic băng đến pH 5,00

+ Bước sóng phát hiện: 210 nm

+ Pha động H2O: ACN=95:5

Kết quả phân tích thể hiện ở hình 3.1, 3.2 như sau:

Hình 3.1 SKĐ của mẫu chuẩn ở điều kiện sắc ký 1

Hình 3.2 SKĐ của mẫu thử ở điều kiện sắc ký 1

Trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn, pic SAC xuất hiện ở 2,8 phút Tuy trong sắc ký đồ của mẫu thử xuất hiện pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic trong sắc ký đồ của mẫu chuẩn (2,8 phút) nhưng khi đối chiếu bằng phổ hấp thụ UV thì thấy không giống nhau Như vậy chương tình sắc ký này chưa lưu giữ SAC đủ lâu để tách ra khỏi nền mẫu và chưa quan sát được pic của SAC

trong mẫu thử

❖ Quy trình 2:

(5) KH2PO4 0,02M pH=7,37 và ACN theo chương trình gradient

(6) KH2PO4 0,02M pH=4, ACN theo chương trình gradient

Các quy trình này đều chưa tách được SAC ra khỏi nền mẫu Trong sắc

ký đồ của mẫu thử xuất hiện pic trùng thời gian lưu với pic SAC trong mẫu chuẩn nhưng hai pic không có phổ hấp thụ UV giống nhau

Như vậy các quy trình khảo sát định lượng trực tiếp SAC đều chưa tách được SAC ra khỏi nền mẫu SAC là chất phân cực, do đó khả năng lưu giữ trên