Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC MS MS

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN XUÂN HIẾU 1201208 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS KHÓA LU

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN XUÂN HIẾU

1201208

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM

ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2017

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN XUÂN HIẾU

1201208

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em xin gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà đã nhiệt tình giúp đỡ và cho em những lời khuyên bổ ích

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích- Độc chất và các anh chị Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian làm thực nghiệm tại

bộ môn, tại viện

Em cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu cùng toàn thể thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ em trong 5 năm học tại trường

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2017 Sinh viên

Nguyễn Xuân Hiếu

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Tình trạng trộn trái phép thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược 3

1.1.2 Tổng quan về Metformin hydroclorid 4

1.1.3 Tổng quan về nhóm Sulfonylure 5

1.1.4 Một số nghiên cứu xác định thuốc tân dược giảm glucose máu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, TPCN 8

1.2 Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu 11

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao 11

1.2.2 Sắc ký lỏng khối phổ 12

1.2.3 Một số ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ 16

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……17

2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 17

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn 17

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 17

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 18

2.2 Phương pháp nghiên cứu 19

2.2.1 Thu thập mẫu 19

2.2.2 Xử lý mẫu 19

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS 19

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng 20

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 20

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 21

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch phân tích 21

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký, khối phổ 21

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 28

3.2 Thẩm định quy trình phân tích 34

3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống 34

3.2.2 Độ đặc hiệu 35

3.2.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 38

3.2.4 Độ tuyến tính và khoảng xác định 39

3.2.5 Độ lặp lại 40

3.3 Ứng dụng quy trình phân tích 41

3.4 Bàn luận 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Asoociation of

Official Analyical Chemists) MET Metformin hydroclorid

GLIB Glibenclamid

GLIC Gliclazid

GLIM Glimepirid

GLIP Glipizid

ESI Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI)

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liqid

chromatography) HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (High Performance Thin Layer

PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định thuốc tân dược đái tháo đường

trộn trái phép trong đông dược trên thế giới

Bảng 3.6 Kết quả xây dựng đường chuẩn 5 chất phân tích 39 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 40 Bảng 3.8 Kết quả hàm lượng glibenclamid trong các mẫu thử 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.4 Tứ cực chập ba gập cong trong hệ máy Brucker 15

Hình 3.1 Phổ đồ phân mảnh của 5 chất phân tích 23

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp 37

Hình 3.6 Sắc ký đồ của các chất phân tích ở nồng độ LOQ 39

do tính an toàn của nó khi sử dụng trong thời gian dài, khả năng kiểm soát đường huyết tương đối tốt và giá thành rẻ

Thuốc giả hiện là vấn nạn có quy mô toàn cầu Ở Việt Nam, năm

2012-2013, thuốc giả, thuốc không đạt tiêu chuẩn chiếm 2-3% thị trường dược phẩm [3] Không chỉ ở thị trường tân dược, các chế phẩm đông dược cũng thường được làm giả do có lợi nhuận lớn và quản lý còn chưa chặt chẽ Những năm gần đây hệ thống kiểm nghiệm cũng như các cơ quan công an, quản lý thị trường và thanh tra đã phát hiện khá nhiều thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ dược liệu trộn trái phép thuốc tân dược Các tân dược trộn lẫn trong đông dược gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau như thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) [7,15], corticoid [10], thuốc ức chếphosphodiestarase-5 [9], thuốc đái tháo đường [22,27] Sử dụng các sản phẩm này kéo dài mà ko rõ nguồn gốc thành phần rất nguy hiểm Trong nước, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện các tân dược trộn trái phép trong đông dược, song với nhóm tân dược đái tháo đường mới có một nghiên cứu [12] được công bố

Trên thế giới, để xác định tân dược trộn trong các chế phẩm đông dược,

có thể sử dụng các phương pháp như TLC [22], HPTLC [18], TLC-SERS [20,29 ], HPLC [22], LCMS/MS [21,23], HPTLC-SERS [12]… Trong đó, LC-MS/MS

là phương pháp có độ nhạy, độ chính xác cao, với khoảng nồng độ tuyến tính rộng, thích hợp để phân tích chất cấm trộn trong mẫu đông dược có thành phần phức tạp

Để góp phần vào công tác kiểm nghiệm chất cấm trộn trong chế phẩm đông

dược, chúng tôi thực hiện đề tài “XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC GIẢM GLUCOSE MÁU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS’’, với mục tiêu là:

1 Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm glucose máu trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS

2 Thẩm định phương pháp phân tích và ứng dụng phương pháp để xác định các thuốc giảm glucose máu (nếu có) trộn trái phép trong một số mẫu chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng (TPCN) lưu hành trên thị trường

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu

1.1.1 Tình trạng trộn trái phép thuốc tân dược vào chế phẩm đông dược

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở các nước đang phát triển vẫn dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe của họ, nhất là ở châu Phi và châu Á Ví dụ như dân số sử dụng thuốc đông dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali, chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở Rawanda, chiếm 60% ở Tanzania, chiếm 60%

ở Uganda [22] Trong nước, nhận thức được tính an toàn của các sản phẩm có nguồn gốc từ tự nhiên nên nhu cầu về sản xuất và sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc thảo dược ngày càng tăng Mặt khác, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ truyền lâu đời của nước ta cũng là một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng được lựa chọn để sử dụng Hiện nay, các chế phẩm

có nguồn gốc từ thảo dược được phát triển theo nhiều hướng khác nhau như các bài thuốc gia truyền được sản xuất tại các cơ sở sản xuất của các lương y, lương dược; các chế phẩm thuốc đông dược, thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ thảo dược

Chế phẩm đông dược, TPCN điều trị đái tháo đường trong thành phần có chứa dược liệu có khả năng ổn định đường huyết như giảo cổ lam, dây thìa canh…Có hơn

1000 loài cây được xác định có khả kiểm soát glucose máu và ít tác dụng phụ [26], trong đó có nhiều cây đã được nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam như giảo cổ lam, khổ qua, quế,…[16,24,25] Thành phần công bố của các chế phẩm này rất phong phú,

có chế phẩm thành phần chỉ gồm 1 vị dược liệu, hoặc phối hợp nhiều vị dược liệu để tăng tác dụng Dạng bào chế của các chế phẩm này rất đa dạng: viên nang, viên nén, trà túi lọc, hoàn cứng, hoàn mềm, thuốc tán… Một số chế phẩm không có số đăng

ký, được sản xuất nhỏ lẻ và bán như những bài thuốc gia truyền của các lương y, lương dược Người dân có thể dễ dàng mua các chế phẩm tại các nhà thuốc, siêu thị, chợ thuốc hay thậm chí là trên mạng internet

Cho rằng sản phẩm đông dược có nguồn gốc từ thiên nhiên, gần gũi nên không độc hại, hiệu quả điều trị được lịch sử chứng minh, ít tác dụng phụ nên nhu cầu sử

dụng rất lớn, giá thành thường rẻ hơn tân dược Bên cạnh đó, tâm lý nhiều người muốn khỏi bệnh nhanh trong khi thuốc đông dược để có hiệu quả phải sử dụng dài ngày, nên một số đối tượng trộn lẫn tân dược vào cho công dụng được đẩy nhanh hơn Điều này rất nguy hiểm vì khi dùng thuốc tân dược phải theo chỉ định của bác

sỹ, sử dụng theo liều lượng nhất định Việc trộn tân dược vào đông dược có thể sẽ gây nên quá liều Tân dược có thể được tán thành bột, trộn vào đông dược rồi chế thành thành phẩm ở dạng viên, dạng cao lỏng hay dạng thuốc phiến Tinh vi hơn, tân dược còn được trộn vào vỏ nang, lượng trộn được tính theo liều dùng của thuốc Nhìn bằng mắt thường, rất khó phát hiện các loại thuốc đông dược này có trộn thêm thuốc tân dược Hơn nữa, việc trộn các tân dược vào đông dược rất khó phát hiện, ngay cả khi kiểm nghiệm, vì trong đông dược có rất nhiều thành phần, đòi hỏi phương tiện kiểm nghiệm hiện đại và tốn nhiều chi phí Kết quả kiểm tra chất lượng của hệ thống kiểm nghiệm trong 5 năm gần đây cho thấy số mẫu thuốc đông dược và dược liệu không đạt chất lượng mỗi năm chiếm khoảng 10% trên tổng số mẫu lấy kiểm tra, cao hơn nhiều so với tân dược (khoảng 3%) Viện kiểm nghiệm đã phân tích kiểm tra 2 mẫu Supai 99 Tongkat Ali Plus do Cục Vệ sinh an toàn thực phẩm gửi và một số nơi khác, kết quả 7 trong số 12 mẫu có trộn trái phép chất chống rối loạn cương dương nhóm ức chế phosphodiestarase-5 [8]

Một số nghiên cứu ở Trung Quốc [23,29], Ả Rập [21], Nhật Bản [22] và ngay

ở Việt Nam [12] đã phát hiện thuốc tân dược đái tháo đường trộn trái phép trong chế phẩm đông dược, TPCN Trong các nghiên cứu đó, phát hiện thuốc tân dược điều trị

đái tháo đường thường được trộn trái phép là Metformin và nhóm Sulfonylurea Có

thể, do 2 nhóm thuốc này được sử dụng phổ biến, rộng rãi, tác dụng mạnh; giá thành

rẻ và ít tác dụng phụ trên hệ tiêu hóa hơn các nhóm tân dược điều trị đái tháo đường còn lại nên thường được trộn trái phép Nên chúng tôi chọn Metformin hydroclorid

và 1 số thuốc thông dụng trong nhóm Sulfonylure để xây dựng phương pháp xác định các chất này trộn trong chế phẩm đông dược

1.1.2 Tổng quan về Metformin hydroclorid (MET)

- Công thức hoá học: C14H11N5.HCl

- Khối lượng phân tử: M= 165,6

- Tên khoa học: 1,1– dimethylbiguanid hydroclorid [6]

- Tính chất: Tinh thể trắng, dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong aceton và dicloromethan Điểm chảy từ 222oC đến 226oC [6]

- Liều dùng: Viên nén 500 mg: Bắt đầu uống 500 mg/lần, ngày 2 lần Tăng liều thêm một viên mỗi ngày, mỗi tuần tăng 1 lần, tới mức tối đa là 2,5 mg/ngày [4]

- Tác dụng và cơ chế: Thuốc có tác dụng ức chế hấp thu glucose ở ruột, tăng nhập glucose vào tế bào, kích thích phân huỷ và ức chế tái tạo glucose Ngoài ra còn làm giảm lipid máu [14]

- Tác dụng không mong muốn : thường gặp là tình trạng tăng acid lactic gây toan máu; miệng có vị kim loại, chán ăn, nôn, buồn nôn, ỉa chảy, đầy thượng vị, táo bón, ợ nóng; ban, mày đay, cảm thụ với ánh sáng; giảm nồng độ vitamin B12 Ít gặp hơn là các tác dụng không mong muốn trên huyết học như: loạn sản máu, thiếu máu bất sản, thiếu máu tan huyết, suy tuỷ, giảm tiểu cầu, mất bạch cầu hạt [14]

1.1.3 Tổng quan nhóm Sulfonylure

Đa số nghiên cứu phát hiện tân dược đái tháo đường được trộn trái phép là sulfonylurea thế hệ II Sulfonylure thế hệ II bao gồm: Glibenclamid, Gliclazid, Glimepirid, Glipizid… có tác dụng nhanh, mạnh

- Cơ chế tác dụng: kích thích trực tiếp tế bào beta đảo Langerhan của tuyến tuỵ tăng sản xuất insulin làm giảm nồng độ glucose trong máu Làm tăng số lượng receptor của insulin ở các tế bào, đặc biệt là các tế bào mỡ, hồng cầu, bạch cầu đơn nhân, do đó làm tăng tác dụng của insulin Ức chế nhẹ tác dụng của glucagon Thuốc không có tác dụng khi cơ thể không còn khả năng tiết insulin [14]

- Tác dụng không mong muốn: Hạ glucose huyết , rối loạn tiêu hoá, vàng da ứ mật, mỏi cơ, viêm mạch dị ứng, chóng mặt, rối loạn tâm thần, ban da, rối loạn tạo máu…[14]

1.1.3.1 Glibenclamid (GLIB)

- Công thức hóa học: C23H28ClN3O5S

- Khối lượng phân tử: M= 494,0

- Tên khoa 3-cyclohexylure [6]

học:1-[[4-[2-[(5-Chloro-2-methoxybenzoyl)amido]ethyl]sulfonyl] Tính chất: Bột kết tinh trắng, không tan trong nước và ether, hơi tan trong dicloromethan, khó tan trong methanol và ethanol 96%, tan trong các dung dịch kiềm loãng Nóng chảy ở 169oC đến 174oC [6]

- Liều dùng: Liều ban đầu từ 2,5- 5 mg mỗi ngày Liều duy trì từ 1,25 - 10 mg/ngày Liều tối đa là 15 mg/ngày [4]

1.1.3.2 Gliclazid (GLIC)

- Công thức hóa học: C15H21N3O3S

- Khối lượng phân tử: M= 323,4

- Tên khoa học: 1-(azabicyclo [3,3,0] oct-3-yl)-3-p-tolylsulfonylure [6]

- Tính chất: Bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng Thực tế không tan trong nước, dễ tan trong dicloromethan, hơi tan trong aceton, khó tan trong ethanol [6]

- Liều dùng: Có thể bắt đầu dùng với liều: 40 - 80 mg, thường dùng 80 mg/ngày và tối đa là 320 mg/ngày [4]

1.1.3.3 Glimepirid (GLIM)

- Công thức hóa học: C24H34N4O5S

- Khối lượng phân tử: M=490,6

- Tên khoa học: ethyl] phenyl] sulphonyl]-3-trans-(4-methylcyclohexyl)urea [17]

- Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, không tan trong nước, tan trong dimethylformamid, ít tan trong dicloromethan, rất ít tan trong methanol [17]

- Liều dùng: Khởi đầu 1-2mg /ngày Duy trì 1-4mg/ ngày Tối đa 8mg/ngày [4]

1.1.3.4 Glipizid (GLIP)

- Công thức hóa học: C21H27N5O4S

- Khối lượng phân tử: M= 445,5

- Tên khoa học:1-cyclohexyl-3-[[4-[2-[[(5-methylpyrazin-2-yl)carbonyl]amino] ethyl] phenyl] sulphonyl] urea [17]

- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng, gần như không tan trong nước, tan ít trong methylclorid, aceton, Thực tế không tan trong ethanol 96% Hòa tan tốt trong dung dịch kiềm [17]

- Liều dùng: Khởi đầu người lớn 5mg /ngày; người già hay người bệnh gan là 2,5 mg/ngày Duy trì 15mg/ ngày [4]

1.1.4 Các nghiên cứu phát hiện tân dược đái tháo đường trộn trái phép trong đông dược, TPCN

1.1.4.1 Trên thế giới

Hiện nay có nhiều phương pháp để xác định các tân dược trộn trong đông dược như LC-MS/MS, HPTLC, SERS, HPLC…Các phương pháp phổ biến được tiến hành định lượng thuốc tân dược đái tháo đường trộn trái phép trong đông dược, TPCN tham khảo được tổng hợp trong bảng sau:

Bảng 1.1 Một số nghiên cứu xác định tân dược đái tháo đường trộn trong đông

dược trên thế giới

- Tốc độ dòng: 0,20 ml/phút

- Thể tích tiêm 10 µl

Điều kiện MS

- Chế độ phát hiện MRM

Kết quả nghiên cứu

- LOQ: MET (2,15ng/ml), GLIB (3,84ng/ml), GLIC (1,9ng/ml), GLIM

(10,9ng/ml), GLIP (4,00ng/ml)

- 14 mẫu trong 30 mẫu phát hiện trộn tân dược đái tháo đường Lượng GLIB được trộn lẫn thay đổi từ 0,88- 6,78 mg/viên;

lượng MET thay đổi từ 4,33- 34,1 mg/viên

27 Viên nén

Viên nang

Glibenclamid Gliclazid Phenformin Glimepiride Metformin

LC-MS-MS

Điều kiện sắc ký

- Cột Xterra MS C18 (150mm x 2,1mm, 5µm), tiền cột C18 (4mm x 3mm)

- Pha động là hỗn hợp của acetonitril và dung dịch acid formic 0,05% trong nước

- Tỷ lệ pha động acetonitrile: nước= 60:40

-LOQ: GLB (2ng/ml), GLIC (1,2ng/ml), GLIM (3ng/ml), Phenformin (2ng/ml), MET (5ng/ml)

- Trong 20 mẫu kiểm tra, phát hiện 5 mẫu chứa GLIB, 3 mẫu chứa GLIC, 3 mẫu chứa Phenformin và 2 mẫu chứa cả GLIM, MET

Điều kiện SERS

- Nhỏ trực tiếp 6μl hỗn dịch keo bạc vào mỗi điểm được đánh dấu trên tấm TLC

- Phổ SERS cho mỗi điểm phân tách được ghi bằng máy quang phổ Raman xách tay (BWS415; B & W Tek, Mỹ): bước sóng kích thích 785± 1nm, độ phân giải 5 cm-1, ghi phổ từ 175- 3100 cm-1

- Tốc độ dòng 0,8 ml/phút rửa giải theo gradient

- Thể tích tiêm 20 µl

- Detector DAD, phát hiện ở UV 220 nm

HPLC

- Cột Cadenza CD-C18 (75mm x 4,6 mm, 3µm)

- Pha động : acetonitril-đệm amoni acetat theo gradient

Theo tài liệu chúng tôi thu thập được, nghiên cứu của Phạm Thị Tâm [12] sử

dụng phương pháp HPTLC để phát hiện và định lượng 2 loại thuốc chống đái tháo đường tổng hợp Metformin và Glibenclamid trộn trái phép trong 41 mẫu chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng Các mẫu ở các dạng: viên nén, viên nang, thuốc viên, thuốc tán, trà túi lọc Chất phân tích trong mẫu thử được chiết siêu âm bằng methanol (MeOH) và sắc ký với điều kiện: bản mỏng silica gel 60 F254, pha động gồm n-butyl acetat - MeOH - acid formic (11: 2,5: 1,5), thể tích mẫu: 5µl, quan sát vết ở UV 254 nm, bước sóng quét phổ để định lượng 230 nm Kết quả, 41 mẫu âm tính với Metformin; Glibenclamid được tìm thấy từ 8 trong số 41 mẫu thu thập được Hàm lượng Glibenclamid được trộn lẫn thay đổi 0,18 mg/viên tới 2,21

mg/viên, lượng này tính theo liều dùng với 1 số mẫu là từ 1,8 mg/liều đến 2,21 mg/liều

Vũ Ngọc Thắng và cộng sự [13] đã xây dựng phương pháp HPLC định lượng đồng thời 6 thuốc hóa dược điều trị tiểu đường (rosiglitazon, piogliazon, glibenclamid, glimepirid, glipizid, gliclazid) trên nền mẫu viên nang cứng bào chế từ dược liệu có tác dụng hạ đường huyết kiểm tra không có chất nghiên cứu với cột C18, pha động là dung dịch đệm triethylamin điều chỉnh về pH 3,4 bằng acid phosphoric, phát hiện ở bước sóng 230 nm Nghiên cứu này mới dừng lại

ở phần thẩm định phương pháp

Phương pháp HPTLC có ưu điểm có thể rà soát nhanh với số lượng mẫu lớn,

xử lý mẫu đơn giản Tuy nhiên do nền mẫu đông dược rất phức tạp, thành phần đa dạng (biết đầy đủ thành phần- thuốc đông dược, chỉ biết thành phần chính- thực phẩm chức năng), các thành phần trong dược liệu đi vào có thể xảy ra hiện tượng

âm tính giả HPTLC và hiện tượng dương tính giả TLC Vì vậy chúng tôi lựa chọn phương pháp hiện đại LC-MS/MS có độ nhạy, độ đặc hiệu cao, khoảng nồng độ tuyến tính rộng để tiến hành xác định chính xác các tân dược đái tháo đường trộn trong đông dược

1.2 Tổng quan về phương pháp dùng trong nghiên cứu

1.2.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao

1.2.1.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kĩ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, loại cỡ, ái lực… tùy thuộc vào loại pha tĩnh sử dụng [1]

1.2.1.2 Nguyên tắc

Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục (pha động) Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển qua

cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với

pha tĩnh và pha động Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của

mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách

các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance

liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận

khối phổ (Mass spectrometry – MS)

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp phân tích

dụng cụ quan trọng trong phân tích thành phần và cấu trúc các chất Phương pháp này

nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử cửa chất

đó dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện

trường hoặc từ trường nhất định

Tứ cực thứ

Buồng va chạm

Tứ cực thứ hai Nguồn ion

Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

Trong nghiên cứu khối phổ của bất kỳ chất nào, trước tiên nó phải được chuyển sang trạng thái bay hơi, sau đó được ion hóa bằng các phương pháp thích hợp Các ion tạo thành được đưa vào đo trong bộ phân tích khối của máy khối phổ Tùy theo loại điện tích của ion nghiên cứu mà người ta chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-) Kiểu quét ion dương thường cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn

 Thiết bị khối phổ

- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối

phổ Có hai phương pháp nạp mẫu chính, tùy thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần phân tích:

+ Nạp mẫu dạng khí: Áp dụng đối với các chất khí, chất lỏng dễ bay hơi bằng cách tiêm mẫu hoặc kết nối với hệ sắc ký khí (GC-MS), sắc ký lỏng (LC-MS)

+ Nạp mẫu trực tiếp: Áp dụng với các chất rắn, tinh thể…

Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký

- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử

mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang năng lượng cao Ion phân tử và các mảnh ion là các phần tử có khối lượng từ đó người ta tính được số khối z=m/e (khối lượng ion/điện tích)

So với các kỹ thuật ion hóa đòi hỏi áp suất thấp như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous Flow- Fast Atom Bombardment CF-FAB) hay tia nhiệt (Thermospray- TS), kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization- API) có ưu điểm hơn Ngoài ra, API ion hóa mềm (soft

ionization), không phá vỡ cấu trúc hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Với API, có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử

để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC-MS: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI)

Kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được thực hiện ở áp suất khí quyển Các mẫu

thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 5000V Đồng thời, các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích

và được gia tốc đến điện cực Kỹ thuật này phù hợp cho các chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000 Da

Hình 1.3 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI

Ngoài ra, còn có nguồn ion hóa đa phương thức (MMI, Multimode ionization)

có thể vận hành, thao tác ở hai chế độ ion hóa ESI và APCI

- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽ được

gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện

Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion (Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube)

Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện đặt song

song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực

Hình 1.4 Tứ cực chập ba gập cong trong hệ máy Brucker

Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần

- Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại

thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system)

Là một hệ thống bao gồm hệ thống kết nối và thu nhận dữ liệu thô và phần mềm kiểm soát, điều khiển thiết bị, quá trình phân tích và tính toán, xử lý, báo cáo, xuất dữ liệu thô vừa thu được Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :

+ Quét toàn phổ (SCAN)

Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng

để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

+ SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

 SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh

ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

 MRM: trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ

3 và đưa vào đàu dò để phát hiện

1.2.3 Một số ứng dụng của sắc ký lỏng khối phổ

Đặc tính nổi bật của LC-MS là tính chọn lọc và độ nhạy cao Vì vậy mà khối phổ thường được sử dụng để xác định siêu vết trong mẫu có thành phần phức tạp như định tính, định lượng thuốc và các dạng chuyển hóa trong dịch sinh học, định lượng dư lượng thuốc trừ sâu, chất bảo quản, chất cấm trong các mẫu thực phẩm,mỹ phẩm, dược liệu, đông dược, thủy hải sản và môi trường Ngoài ra phương pháp khối phổ còn có thể được sử dụng để xác định mức độ tinh khiết của chất chuẩn hoặc mẫu chuẩn cần phân tích

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Đối tượng và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn

Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên vật liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc

Chất chuẩn

1 Metformin.HCl Chuẩn QG

Chuẩn VKNTTW SKS: ĐC15010 , HL: 99,99%

Độ ẩm : 0,04%

2 Glibenclamid Chuẩn QG

Chuẩn VKNTTW SKS: 0103129, HL: 100,10% (HPLC),

Độ ẩm: 0,10%

Dung môi, hóa chất

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ Brucker EVOQ Qube, (Mỹ)

Hình 2.1 Hệ máy Brucker EVOQ Qube

Máy sắc ký khối phổ bao gồm các bộ phận:

- Cân phân tích METLER TOLEDO XPE105, (Thụy Sĩ)

- Cân kỹ thuật XP 320 PRESICA, (Thụy Sĩ)

- Máy soi UV Cabinet CAMAG, (Thụy Sĩ)

- Máy siêu âm DAIHAN-WUC A22H, (Hàn Quốc)

- Máy lắc xoáy VORTEX ZX3, (Italy)

- Máy ly tâm HERMLE Z306, (Đức)

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 HANON, (Đài Loan)

- Micropipet 0,5- 10µl, 10- 100µl, 100- 1000µl NICHIPET, (Nhật Bản)

- Các dụng cụ thủy tinh: pipet, bình định mức, ống đong, cốc có mỏ (Đức)

2.1.3. Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu trắng: Mẫu bột mịn tự tạo từ 18 vị dược liệu đại diện cho các vị dược liệu thường được bào chế trong chế phẩm đông dược, TPCN điều trị, hỗ trợ điều trị đái tháo đường thu mua từ thị trường

2.2.2 Xử lý mẫu

- Lựa chọn MeOH làm dung môi chiết mẫu

- Do mẫu đông dược có thành phần phức tạp, để tương thích với hệ sắc ký và khối phổ, tiến hành khảo sát hiệu quả loại tạp của 8 quy trình xử lý mẫu

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS

Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

 Khảo sát điều kiện khối phổ: Tiến hành phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba Lựa chọn nguồn ion, thế ion hóa, ion mẹ, điều kiện phân mảnh và các ion con để phân tích được đồng thời 5 chất phân tích trong hỗn hợp

 Khảo sát điều kiện sắc ký: thành phần và tỷ lệ pha động, thể tích tiêm, tốc độ dòng, để có thể tách và phát hiện đồng thời các nghiên cứu, cho sắc ký đồ sắc nét

và thời gian phân tích không quá dài

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng

Tiến hành thẩm định phương pháp trên mẫu tự tạo chứa các chất phân tích với các chỉ tiêu:

- Độ đặc hiệu của phương pháp

- Phần mềm Microsoft Excel để tính toán và xử lý thống kê

- Một số công thức tính các giá trị thống kê:

Giá trị trung bình 𝑥̅ = 1

𝑛 × ∑𝑛𝑖=1𝑥𝑖

Độ lệch chuẩn (SD) SD = √∑ (𝑥𝑖− 𝑥̅)2

𝑛 𝑖=1

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch

Cân chính xác khoảng 25mg mỗi chất phân tích cho vào 5 bình định mức 25 ml khác nhau (5 bình, mỗi bình chứa riêng 1 chất phân tích), hòa tan vừa đủ bằng MeOH thu được 5 dung dịch chuẩn nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml

- Giữ 10ml mỗi dung dịch chuẩn trên để tiến hành khảo sát xử lý mẫu

- Pha dung dịch chuẩn gốc chứa 5 chất phân tích (10µg/mg):

Dùng pipet có bầu (1 ml) hút 1 ml mỗi dung dịch chuẩn 1mg/ml trên, cho cùng vào 1 bình định mức 100ml, thêm MeOH vừa đủ thu được dung dịch chuẩn gốc chứa

5 chất phân tích nồng độ chính xác khoảng 10 µg/ml

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc ký, khối phổ

3.1.2.1 Điều kiện khối phổ

Để phân tích bằng LC-MS/MS cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) Với kỹ thuật ion hóa ESI, chế độ ion dương, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]++ Sau đó, cần phải xác định được các ion con tạo thành từ ion mẹ trên để định tính và định lượng

Từ dung dịch chuẩn gốc 10µl chuẩn bị ở 3.1.1, tiến hành pha loãng 5 lần bằng MeOH thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 2 µg/ml Sử dụng dung dịch có nồng

độ khoảng 2µg/ml tiêm qua cột với hệ dung môi acetonitril - 0,1% acid formic /nước (1 : 1) vào hệ thống MS để xác định ion mẹ và hai ion con đối với mỗi chất phân tích

Để phát hiện được đúng chất phân tích, việc lựa chọn được ion con là rất quan trọng

Để thu được mảnh ion con có tín hiệu cao cần phải chọn được mức năng lượng bắn phá thích hợp Dùng ion con có tín hiệu lớn và ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính Kết quả khảo sát các điều kiện của nguồn ion hóa và điều kiện phân mảnh :

Hình 3.1 Phổ đồ phân mảnh của 5 chất phân tích Bảng 3.1 Các thông số hoạt động của nguồn ion hóa

Thông số Giá trị tối ưu (đơn vị)

Điện áp đầu phun 3500V

Nhiệt độ ion hóa 300°C

A z i t h r o m y c i

n

Bảng 3.2 Các điều kiện khối phổ để phân mảnh 5 chất phân tích

Ion mẹ (m/z) Ion con CE ( Ev) Tỷ lệ % ion con MET

Chọn mảnh ion con có cường độ lớn nhất (in đậm) dùng để định lượng, mảnh con thứ 2 có cường độ thấp hơn dùng để xác nhận chất phân tích

3.1.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

Để khảo sát điều kiện sắc ký, từ dung dịch chuẩn gốc 10µg/ml, hút 1ml cho vào bình định mức 10ml, thêm MeOH vừa đủ thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 chất phân tích nồng độ 1µg/ml Tiến hành tiêm 2µl dung dịch chuẩn hỗn hợp 5 chất nồng độ khoảng 1µg/ml vào hệ thống sắc ký và khảo sát với các thông số khác như sau:

- Thể tích tiêm: 2µl

- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

- Các điều kiện khối phổ theo bảng 3.1 và 3.2

- Pha động A: Acid formic 0,1% trong nước; pha động B: Acetonitril

Với kênh A: Acid formic 0,1% trong nước; kênh B: Acetonitril

Chương trình pha động khảo sát :

Bảng 3.3 Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient

Sắc ký đồ khảo sát chế độ pha động đẳng dòng và gradient được thể hiện ở hình sau :

Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát chế độ pha động

Dựa vào sắc ký đồ 4 chế độ pha động trên ta nhận thấy:

- Với chế độ đẳng dòng 50:50: Pic gọn, sắc nét Tuy nhiên trong quá trình chạy thời gian lưu của MET trôi nhiều (0,3 phút)

- Với chế độ đẳng dòng 60:40: thời gian phân tích dài, ở thời điểm 9 phút pic GLIB

và GLIM vẫn chưa xuất hiện

- Với chế độ gradient 2: trên sắc ký đồ của GLIB và GLIM xuất hiện pic phụ

- Chế độ gradient 1: các pic tách nhau rõ ràng, pic gọn, sắc nét, tín hiệu cao hơn ở 3 chế độ trên, thời gian phân tích ngắn (5 phút)

=> Vì vậy chúng tôi chọn chế độ gradient 1 để tiếp tục tiến hành nghiên cứu

Thể tích tiêm

Thể tích tiêm mẫu quyết định lượng mẫu được đưa vào cột Vì vậy, cần chọn thể

tích tiêm mẫu phù hợp để thu được các pic cân xứng và có giới hạn phát hiện phù

hợp

Khảo sát thể tích tiêm 2µl, chúng tôi thấy trên sắc ký đồ pic nhọn, gọn, tín hiệu tốt Hơn nữa, nền đông dược có thành phần rất phức tạp, để giảm thiểu tạp đi vào cột gây giảm hiệu lực cột và nhiễu nền cao, chọn tiêm 2µl

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tham khảo các tài liệu [12,22,23,27] và kết quả khi khảo sát đã lựa chọn sử dụng methanol làm dung môi chiết xuất cho hiệu suất cao

Phương pháp LC-MS/MS có độ nhạy rất cao, trong khi nền đông dược có thành phần phức tạp Do đó phải lựa chọn được quy trình chiết xuất mẫu sao cho hiệu suất chiết cao, đồng thời loại được nhiều tạp tránh nhiễu nền, tránh tạp nhiều đi vào cột gây giảm hiệu lực cột và hư hại hệ thống MS

Tiến hành khảo sát 8 quy trình xử lý mẫu :

Sấy khô dược liệu, nghiền mịn, trộn lẫn và đồng nhất bột 18 vị dược liệu thu được nền tự tạo dạng bột mịn Cân vào 8 ống falcon 50ml mỗi ống khoảng 0,5g nền tự tạo