XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HOÀI ÂN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HOÀI ÂN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC HUYẾT ÁP VÀ LỢI TIỂU TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: Nguyễn Thị Kiều Anh HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh người trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình thực hồn thành Luận văn Xin chân thành gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Nguyễn Xuân Trường Trung tâm giám định ma túy Viện khoa học hình - Bộ Cơng An giúp đỡ tạo điều kiện trang thiết bị cho tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo anh chị cán Viện Công nghệ Dược Phẩm Quốc Gia- Trường đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thiết bị hỗ trợ cho suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đồng nghiệp Trung tâm KN Dược phẩm, Mỹ phẩm, Thực phẩm Hà Nội tạo điều kiện thời gian, động viên, hỗ trợ cho tơi nhiều suốt q trình học tập thực đề tài Dù có nhiều cố gắng q trình thực đề tài, song nhiều mặt thiếu sót hạn chế Tơi mong nhận ý kiến đóng góp dẫn thầy cô giáo anh chị đồng nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 29 tháng 03 năm 2019 Trần Thị Hoài Ân MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Tăng huyết áp 1.1.2 Amlodipin 1.1.3 Nifedipin 1.1.4 Varsatan 1.1.5 Atenolol 1.1.6 Hydroclorothiazid 1.1.7 Furosemid 1.2 Một số dược liệu chế phẩm đông dược dùng điều trị hỗ trợ điều trị cao huyết áp, lợi tiểu 10 1.3 Tình hình nghiên cứu xác định thuốc dược dược hạ huyết áp, lợi tiểu trộn lẫn chế phẩm đông dược 13 1.4 Tổng quan phương pháp LC-MS/MS 17 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 21 2.1.1 Nguyên vật liệu 21 2.1.2 Phương tiện, thiết bị nghiên cứu 21 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23 2.2.1: Xử lý mẫu 23 2.2.2: Xây dựng phương pháp định lượng LC-MS/MS: 23 2.2.3: Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng: 23 2.2.4: Ứng dụng phân tích mẫu chế phẩm đông dược thu thập thị trường 24 2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 25 3.1.1 Chuẩn bị dung dịch 25 3.1.2 Khảo sát lựa chọn điều kiện khối phổ 25 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 37 3.2.1 Độ phù hợp hệ thống 37 3.2.2 Độ đặc hiệu phương pháp 39 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lượng 43 3.2.4 Độ tuyến tính khoảng xác định 45 3.2.5 Độ độ xác 48 3.3 Ứng dụng phân tích mẫu thực 51 Chương IV: BÀN LUẬN 57 4.1 Về mẫu 57 4.2 Về phương pháp phân tích 57 4.3 Về phương pháp xử lý mẫu 58 4.4 Về thẩm định phương pháp phân tích 59 4.5 Về ứng dụng phương pháp 60 KẾT LUẬN 61 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt ACN AOAC HPLC LC-MS/MS Tiếng anh tên khoa học Tiếng việt Acetonitril Association of Official Hiệp hội nhà hóa Analytical Chemists phân tích thống High Performance Liquid Sắc ký lỏng hiệu Chromatography cao Liquid chromatography – Mass Sắc ký lỏng hai lần Spectrometry/Mass khối phổ Spectrometry LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiên LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng Khối lượng/điện tích m/z MeOH Methanol MRM Multiple Reaction Monitoring MS Mass Spectrometry Khối phổ NSAID Non steroidal anti- Thuốc chống viêm inflammatory drug không steroid WHO Word health organization Tổ chức y tế giới HCT Hydroclorothiazid AML Amlodipin NIF Nifedipin ATE Atenolol VAL Valsartan FUR Furosemid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số sản phẩm nguồn gốc đông dược hỗ trợ điều trị cao huyết áp thị trường .11 Bảng 2.1 Các chất chuẩn dùng nghiên cứu 21 Bảng 3.1 Tối ưu điều kiện khối phổ chất nghiên cứu 26 Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ chất phân tích 27 Bảng 3.3 Khảo sát điều kiện pha động theo chế độ gradient 30 Bảng 3.4 Kết đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc vào dung môi 33 Bảng 3.5 Kết đánh giá hiệu suất chiết theo vào thời gian siêu âm 35 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS .38 Bảng 3.7 LOD chất phân tích mẫu .43 Bảng 3.8 Cách pha dãy dung dịch chuẩn 45 Bảng 3.9 Sự phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic chất nghiên cứu 46 Bảng 3.10 Kết đánh giá độ độ lặp lại ngày phương pháp 49 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ độ lặp lại khác ngày phương pháp .50 Bảng 3.12 Kết ứng dụng phân tích mẫu thực .52 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1.a Hệ thống LC-MS/MS Bruker 18 Hình 1.1 b Tứ cực chập ba gấp cong hệ thống máy LC-MS/MS Brucker .18 Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký 29 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát chế độ gradient thành phần pha động 30 Hình 3.3a Phổ khối (ion mẹ ion con) amlodipin viên nang .40 Hình 3.3b Phổ khối (ion mẹ ion con) furosemid viên nang .40 Hình 3.4a Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp viên nang 41 Hình 3.4b Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp viên nén 41 Hình 3.4c Sắc ký đồ đánh giá độ đặc hiệu phương pháp viên hồn 42 Hình 3.5 Sắc ký đồ chất phân tích nồng độ LOD, LOQ viên hồn 44 Hình 3.6 Phổ đồ định tính amlodipin mẫu NHA01 54 Hình 3.7 Phổ đồ định tính furosemid mẫu NHA01 55 Hình 3.8 Sắc ký đồ phân tích mẫu NHA01 .56 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện xu sử dụng thuốc thực phẩm chức có nguồn gốc từ thảo dược ngày phổ biến Với suy nghĩ thuốc ‘tây y’ hóa chất tổng hợp hóa học tác dụng chữa bệnh nhanh đem lại nhiều tác dụng phụ chế phẩm đông dược với thành phần tự nhiên đánh giá an tồn độc Tuy nhiên, chế phẩm từ đông dược tác dụng xuất từ từ đòi hỏi người dùng phải sử dụng liên tục thời gian dài Để thu hút người dùng sử dụng sản phẩm hay tăng hiệu kinh doanh số nhà sản xuất sở khám chữa bệnh tư nhân trộn trái phép vào chế phẩm đơng dược số loại thuốc hóa dược để đẩy nhanh tác dụng thuốc tạo tác dụng điều trị Trong khoảng thời gian gần đây, có nhiều trường hợp người dùng sử dụng chế phẩm đông dược trộn trái phép chất hóa dược mà chịu nhiều biến chứng nghiêm trọng: gây độc cho gan, thận, suy tuyến thượng thận, nhiễm toan máu ….[36] Theo báo cáo Tổ chức Y tế giới, tăng huyết áp bệnh gây tử vong hàng đầu giới ước tính gia tăng Theo thống kê năm 2013, năm giới có gần triệu người chết tăng huyết áp biến chứng tăng huyết áp [31] Các nhóm dược chất hóa dược sử dụng điều trị tăng huyết áp: nhóm chẹn kênh calci, nhóm tác dụng lên hệ renin-angiotensin, nhóm tác dụng hệ giao cảm thường phối hợp với thuốc nhóm lợi tiểu Trong dược chất như: amlodipine, nifedipine, atenolol, valsartan, hydroclorothiazid, furosemide… thường hay sử dụng điều trị tăng huyết áp có hiệu điều trị tốt có giá thành rẻ Các dược chất sử dụng điều trị dạng phối hợp đến thành phần Ngoài đặc điểm bệnh lý tăng huyết áp khiến người bệnh phải sử dụng thuốc thường xuyên kèm tác dụng không mong muốn xuất nhiều Nắm bắt xu hướng thị trường có nhiều chế phẩm đơng dược với định hỗ trợ thay điều trị tăng huyết áp, phòng chống tai biến tăng huyết áp Nhưng năm gần đây, giới ghi nhận nhiều báo cáo nhóm nghiên cứu phát trường hợp chế phẩm đông dược bị trộn trái phép dược chất hóa dược : amlodipin, nifedipin, valsartan, atenolol, clonidin hydrochlorothiazid,… [14],[15],[22],[27],[28] Do việc đảm bảo chất lượng thuốc đơng dược, bên cạnh việc chuẩn hóa thành phần hoạt chất dược liệu cần phải có phương pháp phân tích xác định chất hóa dược trộn trái phép chế phẩm đông dược Phương pháp phân tích sắc ký lỏng hai lần khố phổ (LC-MS/MS) phương pháp phân tích đại, triển khai rộng rãi sở phân tích kiểm nghiệm thuốc Với ưu khả phân tích tách chất sắc ký lỏng (LC) kết hợp với khả phát hiện, định lượng khối phổ (MS), phương pháp cho độ nhạy độ đặc hiệu cao phù hợp với chế phẩm có mẫu phức tạp chế phẩm đơng dược, sinh học… Với mục đích phát triển phương pháp phân tích phát đồng thời nhiều hóa dược trộn trái phép chế phẩm đơng dược nồng độ thấp có độ tin cậy cao, góp phần vào cơng tác kiểm tra phát chất cấm trộn lẫn chế phẩm đông dược, tiến hành đề tài nghiên cứu “Xây dựng phương pháp xác định số thuốc huyết áp lợi tiểu trộn lẫn chế phẩm đông dược LC-MS/MS” Với mục tiêu: Xây dựng phương pháp xác định đồng thời amlodipin, atenolol, nifedipin, valsartan, hydroclorothiazid furosemid trộn trái phép chế phẩm đông dược dạng rắn LC-MS/MS Ứng dụng phương pháp xây dựng để phát dược chất trộn lẫn chế phẩm đông dược lưu hành thị trường HHA03 Hoàn cứng Định áp khang Mua trang web cơng ty Difoco (HCM) 10 HHA04 Viên hồn cứng Ích áp cao 11 NHA16 Viên nang Tâm mạch Nhà thuốc HHA06 Hoàn mềm Tongren NiuHuan Qing xin wan Mua qua internet HHA11 Trang web Viên hoàn ‘‘ Thuốc hạ ổn định nam Lương huyết áp Y Triệu Thị Triệu Hòa Hòa ’’ 12 13 14 15 16 Nhà thuốc Công ty cổ phần Difoco 32 viên/ 8528/2017/ATTP lần -XNCB Công ty TNHH 10 viên/ thảo dược Kiên lần Minh Ngày 229530/2017/ATT lần P-XNCB Công ty TNHH viên/ SX KD TM Công lần Đức Ngày 49471/2017/ATT lần P-XNCB Beijing Tong Ren Tang viên/ Limited lần Company-Trung Quốc Lương y Triệu Thị Hòa 30 - 40 viên/lần Ngày lần Công ty trách nhiệm hữu hạn Medistar Việt Nam 4556/2017/ATTP -XNCB viên/ lần Ngày lần NEHA01 Viên nén Hạ áp đan Medi Happy Nhà thuốc NEHA02 Viên nén ZHENJU JIANGYAPI AN Cửa hàng thuốc đông y 42 Lãn ông Trung Quốc Nhà thuốc Cơng ty CP Dược VTYT Hải phòng 13689/2013/ATT P-XNCB NELT03 Viên nén Hạ hồi đơn viên/ lần Ngày 3lần 2-3 viên/ lần Ngày lần 17 NLT03 18 NLT04 19 NLT08 20 NLT12 21 BLT01 22 HLT05 23 HLT06 24 HLT07 25 HLT08 viên/ Công ty dược lần phẩm Truepharco Ngày 2Việt Nam lần 1-2 Viên nang Công ty TNHH viên/ Nhà thuốc Sỏi mật trái United Soft lần sung media Việt Nam Ngày lần Công ty TNHH viên/ Viên nang Mua qua dược phẩm lần cứng Tán internet thương mại Ngày thảo khang Thành Công lần Viên nang American Mẫu gửi để viên/ Giảm cân Biological and kiểm lần/ngà hồng hạc Technologynghiệm y Phục Linh Hồng Koong Viên hồn Cơng ty cổ phần gói/lần cứng Tiêu sỏi Trang web Dược Thiên Y Ngày an thận Phúc lần Phòng khám đơng viên/ Viên hồn Phòng khám y gia truyền lần cứng Thuốc đông y gia truyền Trần Ngọc Ngày trị sỏi Trần Ngọc Sinh Sinh (Bắc lần Giang) Trang web phòng khám 15 viên/ Viên hồn đông y gia Đông y gia lần cứng An thận truyền An truyền Ca Cơng Ngày hồn Ca Cơng lần (Thanh Hóa) Viên hồn Nhà thuốc Cơ sở y dược cứng SoThadi Yến Trang Diệu Phương gói/lần Trang web Viên hồn đơng y gia Đơng y gia viên/ Hoạt thạch truyền Mộc truyền Mộc Tân lần tán Tâm Đường Đường Viên nang Kim liệu khang Phòng khám YHCT 26 27 28 29 30 BLT01 Viên hoàn cứng Tiêu sỏi an thận Phòng khám đơng y Y Phúc Đường Phòng khám đơng y Y Phúc Đường NLT16 Viên nang Thanh Áo Đình Nhà thuốc Cơng ty CP TBYT Phú Hải HLT09 Trang web Viên hoàn ‘‘ Thuốc Thuốc chữa nam Lương sỏi thận Triệu Y Triệu Thị Hòa Hòa ’’ NELT03 Viên nén Bài thạch Phúc Thọ HLT10 Viên hoàn chữa đái rắt, đái buốt Lương y Triệu Thị Hòa gói/lần Ngày lần viên/ lần /ngày thìa café/lần Ngày lần Cơng ty TNHH quốc tế Phúc Thọ viên/ Mua qua Pharma lần internet XNCB: Ngày 214686/2017/ATT lần P-XNCB Phòng Nhà thuốc gia gói/ khám đơng truyền Bách Thảo lần/ngà y Đường y PHỤ LỤC 7: SKĐ phổ đồ số mẫu đại diện Mẫu NHA 01 Viên nang Thanh áp đan NSX: Công ty TNHH IPHA công nghệ Nơi mua: Mua nhà thuốc Hải Đăng a) Phổ đồ valsartan b) Phổ đồ furosemid c) Phổ đồ atenolol d) Phổ đồ HCT e) Phổ đồ amlodipin f) Phổ đồ nifedipin Phổ khối (ion mẹ ion con) chất phân tích mẫu viên nang NHA 01 Sắc ký đồ phân tích mẫu viên nang NHA 01 Mẫu NEHA Viên nén ZHENJU JIANGYAPIAN NSX: Trung Quốc Nơi mua: Cửa hàng thuốc đơng y 42 Lãn Ơng a) Phổ khối HCT b) Phổ khối atenolol c) Phổ khối nifedipin e) Phổ khối furosemid d) Phổ khối valsartan f) Phổ khối amlodipin Phổ khối (ion mẹ ion con) chất phân tích mẫu NEHA Sắc ký đồ mẫu NEHA Mẫu HLT 05 Viên hồn cứng Thuốc trị sỏi NSX: Phòng khám đông y gia truyên Trần Ngọc Sinh Mua phòng khám a) Phổ khối furosemid b) Phổ khối HCT c) Phổ khối valsartan Phổ khối ( ion mẹ ion con) chất phân tích mẫu HLT 05 Sắc ký đồ mẫu HLT 05 Mẫu HHA06 Hoàn mềm Tongren NiuHuan Qing xin wan Beijing Tong Ren Tang Limited Company-Trung Quốc Mua qua internet a) Phổ khối HCT b) Phổ khối amlodipine c) Phổ khối Atenolol d) Phổ khối Valsartan d) Phổ khối Nifedipin f) Phổ khối Furosemid Phổ khối khối (ion mẹ ion con) chất phân tích mẫu HHA 06 Sắc ký đồ mẫu HHA 06 ... trắng gần trắng, dễ hút ẩm - Không tan nước, tan tự ethanol khan, tan methylene clorid, tan tốt methanol [5], [16] Tác dụng dược lý - Valsartan ức chế chọn lọc angiotensin II thông qua gắn vào thụ... xung) sử dụng thuốc thi n ma câu đằng ẩm; mắc chứng thi n âm hư có lục vị quy thược; thi n dương xung can hỏa thịnh có long đởm tả can Can thận âm hư có kỷ cúc địa hoàng thang, can thận dương hư... 4-cloro-2-[(fural-2-ylmethyl)amino]-5- sulfamoylbenzoic KLPT: 330,75 - Không tan nước; tan aceton, methanol, tan ethanol, tan dung dịch kiềm loãng, tan dimethyl formamid [3], [5] - Dung dịch NaOH 0,1M có đỉnh