Lê thùy linh xây dựng phương pháp phát hiện clopheniramin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng lỏng bằng hptlc khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THÙY LINH XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CLOPHENIRAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC DẠNG LỎNG BẰNG HPTLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ THÙY LINH Mã sinh viên: 1801381 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CLOPHENIRAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐƠNG DƯỢC DẠNG LỎNG BẰNG HPTLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Phạm Thị Thanh Hà HVCH Nguyễn Thị Mây Nơi thực Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, nhận giúp đỡ tận tình thầy giáo, anh chị kỹ thuật viên, ủng hộ gia đình bạn bè Tơi xin chân thành bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Phạm Thị Thanh Hà HVCH Nguyễn Thị Mây, người trực tiếp hướng dẫn, bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Vũ Ngân Bình động viên, nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực Tơi xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí từ đề tài Khoa học công nghệ trực thuộc Bộ GD&ĐT mã số 104.04 – 2020.29 TS Đào Thị Cẩm Minh trình thu thập mẫu Cảm ơn bạn sinh viên Nguyễn Phương Thảo tham gia hỗ trợ thu thập mẫu Tơi xin gửi lời cảm ơn đến tồn thể thầy cô giáo, anh chị kỹ thuật viên Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, anh chị cán khoa Nghiên cứu phát triển Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt thời gian làm thực nghiệm để hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Ban Giám hiệu, tồn thể thầy mơn Trường đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ thời gian học tập trường Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè ln động viên, hỗ trợ, giúp đỡ tơi thực khóa luận Dù có nhiều cố gắng q trình thực khóa luận, song khơng thể tránh khỏi thiếu sót hạn chế Tơi mong nhận ý kiến đóng góp dẫn thầy giáo Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 30 tháng 05 năm 2023 Lê Thùy Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.2 Tình hình nghiên cứu phát hoạt chất hóa dược trộn trái phép chế phẩm đơng dược, có Chlorpheniramin 1.2.1 Trên giới 1.2.2 Tại Việt Nam 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu – Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao 1.3.1 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) 1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 12 2.1.1 Hóa chất, chất chuẩn 12 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 12 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 13 2.2 Nội dung nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 14 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 15 2.3.3 Ứng dụng phân tích mẫu thu thập 16 2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 16 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 18 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 18 3.1.1 Khảo sát hệ dung môi pha động 18 3.1.2 Khảo sát bước sóng định lượng 19 3.1.3 Khảo sát xử lý mẫu 20 3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 20 3.2.1 Độ thích hợp hệ thống 20 3.2.2 Độ đặc hiệu 21 3.2.3 Khoảng tuyến tính 22 3.2.4 Độ độ xác 24 3.2.5 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 25 3.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích chế phẩm đông dược dạng lỏng thu thập thị trường 26 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 29 4.1 Xây dựng phương pháp phân tích 29 4.1.1 Về phương pháp phân tích 29 4.1.2 Về quy trình phân tích HPTLC 30 4.2 Thẩm định phương pháp 31 4.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu chế phẩm đơng dược thị trường 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AOAC Hiệp hội nhà hóa học phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) AR Thuốc thử phân tích (Analytical Reagent) CDC Trung tâm kiểm sốt phịng ngừa dịch bệnh CTCT Công thức cấu tạo CTPT Công thức phân tử HL Hàm lượng HPLC Sắc kí lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu cao (High Performance Thin Layer Chromatography) ICH Hội nghị hòa hợp quốc tế (International Conference on Harmonisation) LC Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography) MS Khối phổ (Mass spectrometry) MS/MS Khối phổ hai lần LOD Giới hạn phát (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation) S/N Tỷ số tín hiệu/nhiễu (Signal/Noise) Spic Diện tích pic SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation) TKTW Thần kinh trung ương TPCN Thực phẩm chức TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) UV Cực tím (Ultra violet) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các nghiên cứu giới phân tích Chlorpheniramin trộn trái phép chế phẩm đông dược………………………………………………………………………… Bảng 1.2 So sánh HPTLC TLC………………………………………………… Bảng 2.1 Các nguyên vật liệu dùng nghiên cứu……………………………………12 Bảng 2.2 Thành phần tỷ lệ lỏng………………………………………………13 Bảng 3.1 Kết khảo sát hệ dung môi pha động……………………………………….18 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống ……………………………………….20 Bảng 3.3 Kết thẩm định khoảng tuyến tính………………………………………….23 Bảng 3.4 Kết thẩm định độ đúng, độ xác…………………………………… 25 Bảng 3.5 Kết thẩm định LOD, LOQ…………………………………………………26 Bảng 3.6 Kết định tính mẫu thực…………………………………………………….27 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 CTCT Chlorpheniramin maleat Hình 3.1 Khảo sát bước sóng định lượng 19 Hình 3.2 Sắc ký đồ thẩm định độ đặc hiệu 21 Hình 3.3 Chồng phổ lỏng thêm chuẩn với mẫu chuẩn vị trí Chlorpheniramin 22 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc Spic với nồng độ C (µg/ml) Chlorpheniramin với MeOH 23 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc Spic với nồng độ C (µg/ml) Chlorpheniramin với dung dịch lỏng 24 Hình 3.1 Sắc ký đồ xác định LOD lỏng Chlorpheniramin nồng độ 1.5 ppm……………………………………………………………………………………….26 Hình 3.7 : sắc ký đồ dạng vết mẫu chế phẩm dạng lỏng thu thập 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo CDC Mỹ, tỷ lệ người 18 tuổi Mỹ bị dị ứng theo mùa 25,7% Tại Việt Nam, có khoảng 20% dân số mắc bệnh dị ứng, mày đay Do môi trường ô nhiễm, tỷ lệ người mắc bệnh tăng lên dẫn đến nhu cầu cao sử dụng loại thuốc, thực phẩm chức điều trị dị ứng, mẩn ngứa Những năm gần đây, sử dụng thuốc thực phẩm chức (TPCN) có nguồn gốc đơng dược thay cho sản phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược xu phổ biến Việt Nam giới Những sản phẩm dược ưa chuộng nhiều người tin chúng hiệu tương đối an tồn, tác dụng phụ thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa dược Tuy nhiên, chế phẩm đông dược lại không quản lý nghiêm ngặt bán tràn lan cửa hàng đông y sàn thương mại điện tử Do nhiều sở cố tình trộn trái phép thuốc tân dược vào để đánh lừa người sử dụng tác dụng nhanh chóng sản phẩm Clorpheniramin maleat thuốc dị ứng thuộc nhóm kháng Histamin H1 Thuốc trộn trái phép chế phẩm đông dược nước Năm 1998, nghiên cứu Mỹ số 260 loại thuốc đông dược châu Á thu thập từ cửa hàng bán lẻ thuốc thảo dược California, có 17 loại (7%) chứa tân dược khơng khai báo Trong đó, Chlorpheniramin loại tân dược không khai báo phổ biến [14] Năm 2019, nghiên cứu Phạm Thị Thanh Tuyền cộng phát 7/8 chế phẩm đông dược dạng rắn bị trộn trái phép hoạt chất nhóm thuốc dị ứng Trong có chế phẩm dương tính với Clorpheniramin Việc trộn trái phép thuốc hóa dược vào sản phẩm đông dược không gây nguy hiểm cho bệnh nhân, mà làm rối loạn thị trường dược phẩm, xâm phạm đến quyền lợi đáng nhà sản xuất uy tín Với thực tế trên, việc phát xử lý kịp thời trường hợp trộn trái phép Chlorpheniramin chế phẩm đông dược cấp bách để đảm bảo an toàn cho người sử dụng Ở Việt Nam, có số cơng trình nghiên cứu phát thuốc kháng histamin trộn trái phép chế phẩm đông dược dạng rắn sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) [6], sắc ký lớp mỏng hiệu cao (HPTLC) [6], sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC -MS/MS) [7] Trong HPTLC kỹ thuật phân tích vượt trội so với kỹ thuật phân tích khác xét tổng chi phí thời gian phân tích Do viên hoàn viên nang hai dạng bào chế phổ biến cho chế phẩm đông dược thị trường nay, nên nghiên cứu thực chủ yếu tập trung xây dựng cho chế phẩm dạng rắn này, mà chưa thực xây dựng thẩm định phương pháp chế phẩm dạng lỏng Do đó, nhằm cung cấp phương pháp định lượng Chlorpheniramin mẫu dạng lỏng mở rộng ứng dụng dạng bào chế chế phẩm đông dược thu thập thị trường, đề tài: “Xây dựng phương pháp phát Clopheniramin trộn trái phép chế phẩm đông dược dạng lỏng HPTLC” thực với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp xác định Chlorpheniramin trộn chế phẩm đông dược dạng lỏng phương pháp HPTLC Ứng dụng phương pháp HPTLC để xác định Chlorpheniramin trộn lẫn chế phẩm đông dược dạng lỏng thu thập thị trường Bảng 3.3 Kết thẩm định khoảng tuyến tính Trong dung dịch lỏng Trong MeOH STT Nồng độ (µg/ml) Spic Nồng độ (AU) (µg/ml) Spic (AU) 20 993,62 20 783,31 40 1520,23 40 1492,70 50 2019,52 50 1823,86 60 2121,82 60 1987,30 80 2833,05 80 2701,46 100 3401,98 100 3274,56 Phương trình hồi quy y = 30,338x + 378,67 y = 30,782 + 214,93 R 0,9964 0,9979 ME% 1,44% Spic (MeOH) 4000 y = 30.338x + 378.67 R² = 0.9928 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 120 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc Spic với nồng độ C (µg/ml) Chlorpheniramin MeOH 23 Spic (nền lỏng) 3500 y = 30.782x + 214.93 R² = 0.9959 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 20 40 60 80 100 120 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn phụ thuộc Spic với nồng độ C (µg/ml) Chlorpheniramin dung dịch lỏng Nhận xét: Trong khoảng nồng độ khảo sát Chlorpheniramin có tương quan tuyến tính Spic nồng độ chất phân tích, với hệ số tương quan r ≥ 0,995, ứng dụng phương pháp để định lượng Chlorpheniramin có nồng độ khoảng nồng độ tuyến tính Từ kết đánh giá ảnh hưởng mẫu đường chuẩn (ME%), nhận thấy mẫu lỏng có ảnh hưởng không đáng kể đến kết (độ lệch đường chuẩn dung môi đường chuẩn mẫu 1,44% < 15%) [8], nên tiến hành định lượng theo đường chuẩn pha methanol 3.2.4 Độ độ xác Độ độ xác ngày xác định cách thêm xác lượng dung dịch chuẩn gốc vào mẫu lỏng (1,0 g lỏng) mức nồng độ (thấp, trung bình, cao tương ứng để sau xử lí mẫu, nồng độ Clopheniramin dung dịch 20 – 50 –80 µg/ ml), lắc đều, để yên 15 phút Sau tiến hành xử lý mẫu theo quy trình phần phương pháp nghiên cứu mục 2.3.1.2 Tiến hành lặp lại lần mức nồng độ Mỗi mỏng chấm dãy dung dịch chuẩn Chlorpheniramin pha methanol để tính tốn kết Độ độ xác khác ngày tiến hành tương tự vào ngày phân tích khác Phân tích HPTLC với điều kiện phân tích chọn Lượng chất tìm 24 lại tính theo đường chuẩn xây dựng ngày phân tích Từ lượng chuẩn tìm lại so sánh với lượng chuẩn thêm vào ta tính độ (độ thu hồi) Yêu cầu: độ thu hồi phải đạt từ 80 - 110% [9] Kết trình bày bảng: Bảng 3.4 Kết thẩm định độ đúng, độ xác Ngày Ngày C thêm vào (µg/ ml) C tìm lại (µg/ ml) % thu hồi RSD % C tìm lại (µg/ ml) % thu hồi RSD % 20 18,17 90,85 5,44 19,94 99,69 2,44 50 51,17 102,33 1,14 48,79 99,96 3,35 80 79,46 99,32 1,28 77,15 96,43 1,67 Nhận xét: Ở mức nồng độ 20 –50 – 80 µg/ ml, phương pháp có tỷ lệ thu hồi từ 90,85 % 102,33 % với RSD 1,14% - 5,44% Như vậy, phương pháp xây dựng cho độ thu hồi độ lặp lại đáp ứng theo hướng dẫn AOAC 2016 [9] (tỷ lệ thu hồi từ 80 – 110% RSD < 7,3% mức hàm lượng 10 µg/ ml - < 100 µg/ ml) 3.2.5 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Thêm chuẩn Chlorpheniramin với lượng giảm dần vào lỏng mức nồng độ 1,5 - 2,5 – - 10 µg/ml Xử lý mẫu theo quy trình xây dựng mục 2.3.1.2 tiến hành phân tích hệ thống HPTLC với điều kiện chọn Mỗi nồng độ phân tích lặp lại - lần theo quy trình xây dựng Nồng độ cho tỷ số tín hiệu nhiễu (S/N) khoảng LOD nồng độ cho tỷ số tín hiệu nhiễu (S/N) khoảng 10 LOQ 25 Hình 3.6 Sắc ký đồ xác định LOD lỏng Chlorpheniramin nồng độ 1.5 µg/ml Bảng 3.5 Kết thẩm định LOD, LOQ Nồng độ S/N LOD (ng/vết) LOQ (ng/vết) 1,5 µg/ml 2,8 15 45 Nhận xét: Kết cho thấy LOD LOQ nhỏ nồng độ nhỏ khoảng tuyến tính xây dựng Như vậy, phương pháp HPTLC xây dựng có độ đặc đặc hiệu tốt, giới hạn phát định lượng thấp, có mối tương quan tuyến tính đáp ứng nồng độ chất phân tích khoảng nồng độ khảo sát (hệ số tương quan r ≥ 0,995); độ đáp ứng yêu cầu AOAC 2016 [9] mức nồng độ 20, 50, 80 µg/ml 3.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích chế phẩm đơng dược dạng lỏng thu thập thị trường Ứng dụng phương pháp HPTLC xây dựng để phân tích Chlorphenramin mẫu chế phẩm đông dược dạng lỏng (dung dịch xịt, dung dịch nhỏ, dầu xoa,…) điều trị hỗ trợ điều trị dị ứng, mày đay, mẩn ngứa; thu thập thị trường từ nguồn khác mua qua internet, nhà thuốc,… lưu hành Việt Nam Chế phẩm xử lý theo quy trình phân tích mẫu theo phương pháp HPTLC thẩm định Nếu phát có mẫu nghi ngờ tiến hành so sánh phổ chất nghi ngờ chất chuẩn Kết trình bày hình 3.6 26 Hình 3.7: Sắc ký đồ dạng vết mẫu chế phẩm dạng lỏng thu thập Trong đó: C chuẩn Chlorpheniramin 100 µg/ml 1- CLA24, 2- CLA25, 3- DX01, 4- DDN01, 5- DDN02, 6- DDN03, 7- DDN04, 8- DDX01, 9- DDX02 Nhận xét: Hình 3.6: Khơng có mẫu lỏng nghi ngờ dương tính với Chlorpheniramin Do đề tài thực song song với khóa luận tốt nghiệp sinh viên Nguyễn Phương Thảo đối tượng cỡ mẫu nên kết LC - MS/MS trích bảng 3.6 để đối chứng với kết HPTLC thực đề tài Bảng 3.6 Kết định tính mẫu thực STT Mã kí hiệu Dạng bào chế Nguồn gốc Định tính HPTLC Đối chiếu LC-MS/MS CLA24 Cao lỏng Việt Nam - + CLA25 Cao lỏng Việt Nam - - DNN01 Dung dịch nhỏ mũi Việt Nam - - 27 DNN02 DNN03 DNN04 DX01 DDX01 DDX02 Dung dịch nhỏ mũi Dung dịch nhỏ mũi Dung dịch nhỏ mũi Dầu xoa Dung dịch xịt mũi Dung dịch xịt mũi Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam Việt Nam - - - - - - - - - - - - Nhận xét: Kết phân tích mẫu chế phẩm đông dược dạng lỏng thu thập phương pháp HPTLC phát mẫu chế phẩm dạng lỏng (trong có mẫu CLA24 bị âm tính giả) bị trộn trái phép Chlorpheniramin Do độ nhạy HPTLC, đề xuất nên phân tích lại mẫu CLA24 hệ thống HPTLC với lượng mẫu lớn 28 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Xây dựng phương pháp phân tích 4.1.1 Về phương pháp phân tích HPTLC phương pháp kỹ thuật tiên tiến, có ứng dụng tích cực phân tích định tính định lượng loạt hợp chất Ưu điểm HPTLC: - Phù hợp với phân tích định tính định lượng, máy qt Scanner ghi lại phổ hấp thụ chất, chồng phổ chất cần phân tích với phổ chất chuẩn nên định tính đặc hiệu so với TLC, định lượng xác so với chụp ảnh đo mật độ màu vết nhờ thông số diện tích pic giống phương pháp HPLC - Hơn nữa, hệ thống HPTLC sử dụng mỏng có kích thước 20 x10 cm, phân tích đồng thời với số lượng mẫu lớn (khoảng 18 mẫu) điều kiện sắc ký, thời gian phân tích ngắn (khoảng 30 - 40 phút), HPTLC vượt trội so với kỹ thuật phân tích khác xét tổng chi phí thời gian phân tích [30] - Các mẫu phân tích mẫu chuẩn chấm mỏng sắc ký, khai triển lúc điều kiện dung môi, nhiệt độ, độ ẩm nên cho độ lặp lại cao, hạn chế tác động mơi trường lần phân tích - Chuẩn bị mẫu đơn giản, không cần xử lý trước cho dung môi lọc khử khí, lượng tiêu thụ pha động cho mẫu thấp - Khả phân tích mẫu thơ chứa nhiều thành phần [30], mẫu phức tạp, mẫu bẩn [31] - So với LC, HPTLC yêu cầu hơn, chí không yêu cầu bước làm mẫu, nên tiết kiệm thời gian chi phí [31] - Thiết bị dễ sử dụng vận hành - Nói chung, tính chọn lọc, khả phân tách, độ nhạy (giới hạn định lượng) HPTLC thấp LC, độ khơng đảm bảo đo liệu xác từ thẩm định phương pháp tương đương [31] - Phương pháp HPTLC giúp làm giảm thiểu phơi nhiễm chất hữu độc hại làm giảm đáng kể vấn đề xử lý chất thải hữu cơ, đó, làm giảm nhiễm mơi trường Có thể coi phương pháp thân thiện với môi trường [30] Nhược điểm HPTLC: Nền mẫu chế phẩm đông dược phức tạp, thành phần đa dạng, thành phần dược liệu xuất vị trí tương đương với vị trí chất phân tích nên xảy tượng dương tính giả âm tính giả phương pháp sử dụng khơng đáp ứng độ nhạy 29 Do đó, phương pháp HPTLC lựa chọn để ứng dụng để phát hiện, sàng lọc nhanh mẫu chế phẩm đông dược thu thập thị trường cách so sánh giá trị Rf mẫu thử mẫu chuẩn Tuy nhiên, tỉ lệ trộn thuốc với liều dùng thấp với mẫu phức tạp nhiều thành phần mẫu chế phẩm đơng dược, sử dụng HPTLC dẫn đến trường hợp dương tính giả: mẫu thử có vết khơng phải chất cần phân tích có Rf tương đương với chất chuẩn Khi ta kiểm tra lại cách quét so sánh phổ UV-VIS vết nghi ngờ với vết chất chuẩn, nên hạn chế trường hợp dương tính giả, cho kết định tính có độ tin cậy Cụ thể, có pic lạ khơng phải chất cần phân tích cho Rf tương đương với pic vết chuẩn, chồng phổ mà cho hệ số match khơng đạt ta kết luận âm tính (loại bỏ trường hợp dương tính giả) Trường hợp âm tính giả xảy chất cần phân tích trộn với lượng nhỏ khơng thể phát đèn UV thơng thường bước sóng 254 nm hay 366 nm, ta chồng phổ hệ số match đạt, ta kết luận dương tính (loại bỏ trường hợp âm tính giả) Do đó, phương pháp HPTLC phù hợp với phân tích định tính định lượng Chlorpheniramin trộn trái phép chế phẩm đông dược thời gian ngắn đảm bảo độ tin cậy xác cao 4.1.2 Về quy trình phân tích HPTLC Chúng khảo sát hệ pha động khác để tách Chlorpherniramin khỏi chế phẩm đơng dược dựa tài liệu Q trình khảo sát hệ dung mơi pha động thấy có hệ 4: Cyclohexan : Aceton : Triethylamin (8:2:0,5) tách Chlorpheniramin khỏi mẫu với Rf khoảng 0,15 – 0,85 Quét phổ hấp thụ cực đại Chlorpheniramin, lựa chọn bước sóng phát Chlorpheniramin 254 nm, bước sóng định lượng 260 nm Về quy trình xử lý mẫu: So với tài liệu tham khảo [6], tính tốn quy lượng cân 1,0 g áp dụng với tất mẫu lỏng, không cần phải tính tốn theo liều loại mẫu Do giúp tiết kiệm thời gian thuận tiện cho việc thực thường quy, cần lưu ý ứng dụng với mẫu mà có lượng dùng liều lớn để tránh trường hợp âm tính giả Đề tài xây dựng thẩm định phương pháp phát Chlorpheniramin trộn trái phép chế phẩm đông dược dạng lỏng nhằm tiếp nối nghiên cứu trước phát Clorpheniramin trộn chế phẩm dạng rắn So với phương pháp LC-MS/MS [7] hay HPLC [6] áp dụng số nghiên cứu, phương pháp HPTLC xây dựng dễ thực hơn, phân tích sàng lọc 30 lượng lớn mẫu, giúp tiết kiệm thời gian chi phí Đồng thời, với tính UV Scanner, quét phổ, chồng phổ giúp định tính nhanh, xác HPLC Mặc dù phương pháp có LOD, LOQ khơng nhỏ phương pháp LC-MS hay HPLC kết chấp nhận để ứng dụng phân tích sàng lọc 4.2 Thẩm định phương pháp LOD Chlorpheniramin 15 ng/ vết; LOQ 45 ng/ vết Tuy nhiên, LOD, LOQ phương pháp xây dựng cao so với nghiên cứu khác sử dụng phương pháp HPLC [6], LC-MS/MS [7] để xác định thuốc dị ứng chế phẩm đông dược 4.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu chế phẩm đơng dược thị trường - Đề tài ứng dụng phương pháp HPTLC xây dựng để phân tích mẫu chế phẩm đông dược điều trị/hỗ trợ điều trị dị ứng, mày đay, mẩn ngứa dạng lỏng thu thập thị trường (dung dịch xịt, dung dịch nhỏ,…) Nếu dựa vào màu sắc vị trí vết tách mỏng cho kết dương tính với mẫu Nhưng đối chiếu kết LC – MS/MS, phát có trường hợp âm tính giả mẫu CLA24 Có ngun nhân dẫn tới âm tính giả là: + Thứ nhất: độ nhạy phương pháp HPTLC không cao, giới hạn phát LOD không nhỏ + Thứ hai: Lượng uống liều dùng lớn, nên nồng độ Chlorpheniramin trộn mẫu thấp Cũng lý này, nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu trường Đại - học Dược Hà Nội xây dựng quy trình xử lý mẫu tính theo liều dùng [6], [7] Tuy nhiên, để thuận tiện cho việc thực thường quy, việc quy lượng cân cần thiết, cần lưu ý ứng dụng với mẫu mà có lượng dùng liều lớn Về mẫu chế phẩm đông dược: Các nghiên cứu trước đây, thuốc, thực phẩm chức có số đăng ký (được cơng bố ATTP) thường khơng có mẫu dương tính [7] Nhưng đề tài này, phát có mẫu có số đăng ký CLA24 dương tính với Clorpheniramin 31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu đưa số kết luận sau: Đã xây dựng phương pháp HPTLC để phát Clorpheniramin trộn trái phép chế phẩm đông dược dạng lỏng nhằm mở rộng ứng dụng phát dạng bào chế chế phẩm đông dược Phương pháp thực với kỹ thuật xử lý mẫu đơn giản Phương pháp thẩm định theo hướng dẫn AOAC 2016 cho độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện, định lượng nhỏ (LOQ = 45 ng/ vết) Khoảng tuyến tính từ 20 µg/ml – 100 µg/ml với hệ số tương quan lớn 0,995 Phương pháp có độ 90,85 % 102,33% với RSD 1,14% - 5,44% đáp ứng yêu cầu độ thu hồi khoảng: 80 - 110 % với RSD < 7,3% Điều cho thấy phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu AOAC, đủ tin cậy xác để ứng dụng xác định Chlorpheniramin chế phẩm đơng dược Đã ứng dụng phương pháp phân tích mẫu chế phẩm đông dược dạng lỏng điều trị hỗ trợ điều trị dị ứng, mẩn ngứa, mày đay thu thập thị trường Kết phân tích cho thấy khơng phát thấy Chlorpheniramine trộn chế phẩm dạng lỏng phương pháp HPTLC, có mẫu CLA24 bị âm tính giả (do lượng uống liều dùng lớn, thuốc bị trộn với nồng độ thấp) KIẾN NGHỊ - Ứng dụng phương pháp để kiểm tra sàng lọc Chlorpheniramin chế phẩm đơng dược dạng lỏng có tác dụng điều trị hỗ trợ điều trị dị ứng đặc biệt sản phẩm khơng có số đăng ký mua qua mạng internet - Khảo sát phương pháp để mở rộng ứng dụng phát chất kháng Histamin khác Cinnarizin, Promethazin, trộn lẫn chế phẩm đông dược dạng lỏng HPTLC 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Tử An (2012), Hóa phân tích 2: Phân tích dụng cụ, Nhà xuất y học, Hà Nội, tr 168-214 Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học, Hà Nội Bộ Y tế (2018), Dược thư quốc gia Việt Nam, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr.187-188 Nguyễn Thị Kiều Anh cộng - Nghiên cứu xác định số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép chế phẩm Đông dược HPLC-DAD – Tạp chí dược học năm 2020, tập 60, số 4, tr.19-20 Nguyễn Thị Kiều Anh cộng - Xây dựng phương pháp HPTLC xác định số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép chế phẩm đông dược - Tạp chí nghiên cứu dược thơng tin thuốc năm 2021, số 2, Tr16-21 Trần Thị Lan (2020), Xây dựng phương pháp xác định số thuốc kháng histamin H1 trộn trái phép chế phẩm đông dược HPLC HPTLC, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Phạm Thị Thanh Tuyền (2019), Xây dựng phương pháp xác định số thuốc chống dị ứng trộn trái phép chế phẩm đông dược LC-MS/MS, Luận văn thạc sĩ dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Kiểm ngiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia (2010), Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 31 Tiếng Anh AOAC International (2016), Guidelines for Standard Method Performance Requirements, AOAC Official Methods of Analysis 10 Ariburnu, E., Uludag, M F., Yalcinkaya, H., & Yesilada, E (2012), “Comparative determination of sibutramine as an adulterant in natural slimming products by HPLC and HPTLC densitometry”, Journal of pharmaceutical and biomedical analysis, 64, 77-81 11 Bateman, J., Chapman, R D., & Simpson, D (1998), “Possible toxicity of herbal remedies”, Scottish Medical Journal, 43(1), 7-15 12 Calahan, J., Howard, D., Almalki, A J., Gupta, M P., & Calderón, A I (2016), “Chemical adulterants in herbal medicinal products: a review”, Planta Medica, 82(06), 505-515 13 Chen, Y., Zhao, L., Lu, F., Yu, Y., Chai, Y., & Wu, Y (2009), “Determination of synthetic drugs used to adulterate botanical dietary supplements using QTRAP LC-MS/MS”, Food Additives and Contaminants, 26(5), 595-603 14 Coppes, M J., Anderson, R A., Egeler, R M., & Wolff, J E (1998), “Alternative therapies for the treatment of childhood cancer”, New England Journal of Medicine, 339(12), 846847 15 Darwish, H W., Metwally, F H., & El Bayoumi, A (2015), “Development of three methods for simultaneous quantitative determination of chlorpheniramine maleate and dexamethasone in the presence of parabens in oral liquids”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 14(1), 153-161 16 Fang, F., Qi, Y., Lu, F., & Yang, L (2016), “Highly sensitive on-site detection of drugs adulterated in botanical dietary supplements using thin layer chromatography combined with dynamic surface enhanced Raman spectroscopy”, Talanta, 146, 351-357 17 Foroughi, M H., Akhgari, M., Jokar, F., & Mousavi, Z (2017), “Identification of undeclared active pharmaceutical ingredients in counterfeit herbal medicines used as opioid substitution therapy”, Australian journal of forensic sciences, 49(6), 720-729 18 Guo, C., Gong, L., Wang, W., Leng, J., Zhou, L., Xing, S., & Shi, F (2020), “Rapid screening and identification of targeted or non-targeted antitussive adulterants in herbal medicines by Q-Orbitrap HRMS and screening database”, International Journal of Mass Spectrometry, 447, 116250 19 Haneef, J., Shaharyar, M., Husain, A., Rashid, M., Mishra, R., Siddique, N A., & Pal, M (2013), “Analytical methods for the detection of undeclared synthetic drugs in traditional herbal medicines as adulterants”, Drug testing and analysis, 5(8), 607-613 20 Huang, Y Q., You, J Q., Cheng, Y., Sun, W., Ding, L., & Feng, Y Q (2013), “Frontal elution paper chromatography for ambient ionization mass spectrometry: analyzing powder samples”, Analytical Methods, 5(16), 4105-4111 21 Koh, H L., & Woo, S O (2000), “Chinese proprietary medicine in Singapore: regulatory control of toxic heavy metals and undeclared drugs”, Drug safety, 23(5), 351-362 22 Li, F F., Guo, C C., Zhang, Y L., Wang, N., Shi, Y., & Wang, S Q (2020), “A screening method based on 1D CSSF-TOCSY for the identification and quantification of 11 illegal adulterants in herbal medicines”, Microchemical Journal, 153, 104495 23 ManMohan S (2010), “High-performance thin-layer chromatography (HPTLC)”, Springer Science & Business Media, pp 43 24 Nguyen, P H., De Tran, V., Pham, D T., Dao, T N P., & Dewey, R S (2021), “Use of and attitudes towards herbal medicine during the COVID-19 pandemic: A cross-sectional study in Vietnam”, European Journal of Integrative Medicine, 44, 101328 25 Popescu, A M., Radu, G L., Onisei, T., Raducanu, A E., & Niculae, C G (2014), “Detection by gas chromatography-mass spectrometry of adulterated food supplements”, Rom Biotechnolog Lett, 19(4), 9485-92 26 el deen Sayed, N., Hegazy, M., Abdelkawy, M., & Abdelfatah, R (2013), “Spectrophotometric, chemometric and chromatographic determination of naphazoline hydrochloride and chlorpheniramine maleate in the presence of naphazoline hydrochloride alkaline degradation product”, Bulletin of Faculty of Pharmacy, Cairo University, 51(1), 57-68 27 Sharma, A., Shanker, C., Tyagi, L K., Singh, M., & Rao, C V (2008), “Herbal medicine for market potential in India: an overview”, Acad J Plant Sci, 1(2), 26-36 28 Shivatare, R S., Nagore, D H., & Nipanikar, S U (2013), “HPTLC’an important tool in standardization of herbal medical product: A review”, J Sci Innov Res, 2(6), 1086-1096 29 Song, N., Zhang, K., Liu, X., Sang, T., Sun, Y., & Teng, N (2015), “Determination of twelve chemical drugs illegally added in herbal tea by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with modified QuEChERS”, Se pu= Chinese Journal of Chromatography, 33(10), 1026-1031 30 Rashmin, P., Mrunali, P., Nitin, D., Nidhi, D., & Bharat, P (2012), “HPTLC method development and validation: strategy to minimize methodological failures”, Journal of food and drug analysis, 20(4), 20 31 Renger, B (1998), “Contemporary thin-layer chromatography in pharmaceutical quality control”, Journal of AOAC International, 81(2), 333-340 32 Rocha, T., Amaral, J S., & Oliveira, M B P (2016), “Adulteration of dietary supplements by the illegal addition of synthetic drugs: a review”, Comprehensive reviews in food science and food safety, 15(1), 43-62 33 Yang, Y., & Deng, J (2016), “Analysis of pharmaceutical products and herbal medicines using ambient mass spectrometry”, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 82, 68-88 34 YE Lin-hu, X Song, W.Li-sha, HE Mei & C Qi (2016), "Simultaneous determination of antihistamine agents added into traditional Chinese medicine preparation by LCMS/MS", Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 36(11), pp.2022-2028 PHỤ LỤC Phụ lục 1: SKĐ thẩm định độ chọn lọc Phụ lục 1.1: Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu nền, mẫu chuẩn mẫu thêm chuẩn Hình 5.1 Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 5.2 Sắc ký đồ mẫu Hình 5.3 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn Hình 5.4 Sắc ký đồ mẫu chuẩn Phụ lục 1.3: Độ tinh khiết pic Chlorpheniramin