NGUYỄN THỊ AN xây DỰNG PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH các THUỐC KHÁNG HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG dược BẰNG LC MSMS và TLC

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ ĐỨC MƯỜ NGUYỄN THỊ AN XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC KHÁNG HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐƠNG DƯỢC BẰNG LCMS/MS VÀ TLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ AN Mã sinh viên : 1401004 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC KHÁNG HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐƠNG DƯỢC BẰNG LCMS/MS VÀ TLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Dược sĩ Phạm Thị Thanh Tuyền Nơi thực hiện: Viện Khoa học hình - Bộ Cơng An Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy cô giáo, anh chị cán bộ, ủng hộ gia đình bạn bè Tơi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Dược sĩ Phạm Thị Thanh Tuyền, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực hồn thành khóa luận Tơi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Xuân Trường anh chị cán Trung tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình - Bộ Cơng an hỗ trợ cho tơi thiết bị LC-MS/MS để tơi hồn thành đề tài nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Traphaco giúp đỡ tơi q trình tạo mẫu nghiên cứu, xin cảm ơn Ban lãnh đạo anh chị cán Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia tạo điều kiện trang thiết bị, máy móc để hỗ trợ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo đại học tồn thể thầy mơn trường Đại học Dược Hà Nội tận tình dạy dỗ giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè động viên, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Hà Nội, ngày 11 tháng 06 năm 2019 Nguyễn Thị An MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .3 1.1.1 Nhóm thuốc đối kháng thụ thể Histamin H1 1.1.2 Dược liệu chế phẩm đông dược điều trị hỗ trợ điều trị dị ứng 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC 1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3.1 Phương pháp LC-MS/MS 1.3.2 Phương pháp TLC .12 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 14 2.1.1 Hóa chất – chất chuẩn 14 2.1.2 Máy móc – trang thiết bị .14 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 14 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.2.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 16 2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 16 2.2.3 Thẩm định phương pháp phân tích 17 2.2.4 Ứng dụng phương pháp phân tích mẫu 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .19 3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp LC-MS/MS 19 3.1.1 Xây dựng phương pháp LC-MS/MS 19 3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 21 3.1.3 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS 22 3.2 Xây dựng thẩm định phương pháp TLC 28 3.2.1 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 28 3.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích 29 3.2.3 Thẩm định phương pháp TLC .30 3.3 Ứng dụng phân tích mẫu thưc .33 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 37 4.1 Tạo mẫu .37 4.2 Xây dựng phương pháp phân tích 37 4.2.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 37 4.2.2 Xây dựng phương pháp .38 4.2.3 Xử lý mẫu 39 4.3 Thẩm định phương pháp .39 4.3.1 Thẩm định phương pháp 39 4.3.2 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS 40 4.4 Ứng dụng 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết tối ưu hóa điều kiện khối phổ chất phân tích Phụ lục 2: Kết khảo sát điều kiện xử lý mẫu Phụ lục 3: Chế tạo mẫu hình ảnh mẫu Phụ lục 4: Danh mục chế phẩm đông dược phân tích Phụ lục 5: Sắc ký đồ khảo sát mẫu thực TLC Phụ lục 6: Sắc ký đồ, kết định danh hình ảnh mẫu dương tính LCMS/MS Phụ lục 7: Bài báo đăng DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt AOAC AR Chuẩn DĐVN Chuẩn PTN CLO CYP Tiếng anh tên khoa học Association of Official Analytical Chemists Analytical Reagent Chuẩn Dược điển Việt Nam Chuẩn phòng thí nghiệm Chlorpheniramin maleat Cyproheptadin hydroclorid High Performance Liquid HPLC Chromatography High Performance Thin Layer HPTLC Chromatography International Conference on ICH Harmonisation Liquid Chromatography – Mass LC – MS/MS Spectrometry/ Mass Spectrometry LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quantitation LOR Loratadin m/z MeOH Methanol PA Pure Analysis RSD Relative Standard Deviation S/N Signal/Noise TLC Thin Layer Chromatography TOF Time Of Flight UHPLC Tiếng việt Hiệp hội nhà hóa phân tích thống Thuốc thử phân tích Ultra High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Hội nghị hòa hợp quốc tế Sắc ký lỏng hai lần khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Khối lượng/ điện tích Methanol Tinh khiết phân tích Độ lệch chuẩn tương đối Tín hiệu/Nhiễu Sắc ký lớp mỏng Thời gian bay Sắc ký lỏng hiệu suất siêu cao DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Một số dược liệu điều trị hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng Bảng Một số nghiên cứu phân tích thuốc kháng histamin trộn trái phép chế phẩm đông dược Bảng Các nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 14 Bảng Các thông số máy khối phổ 19 Bảng Điều kiện khối phổ chất phân tích 19 Bảng 3.Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient .20 Bảng 4.Kết đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS (n=6) .22 Bảng 5.Sự phụ thuộc tuyến tính nồng độ diện tích pic chất nghiên cứu .24 Bảng Kết độ độ xác ngày mẫu (n=7) 26 Bảng Kết độ độ xác khác ngày mẫu (n=7) 26 Bảng Kết LOD LOQ mẫu 28 Bảng Kết khảo sát hệ dung môi pha động TLC .29 Bảng 10 Kết định tính mẫu thực LC-MS/MS TLC 34 Bảng 11.Kết đánh đánh giá mẫu thực dương tính LC-MS/MS 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 10 Hình Sơ đồ tạo thành ion dương ESI 10 Hình Bộ phân tích tứ cực .11 Hình Mơ hình phân tích tứ cực chập ba 11 Hình Sắc ký đồ khảo sát điều kiện khối phổ sắc ký LC-MS/MS .21 Hình 2.Quy trình xử lý mẫu 22 Hình 3 Sắc ký đồ độ đặc hiệu N1 24 Hình Sắc ký đồ chất phân tích nồng độ LOD N3 27 Hình Kết khảo sát tối ưu hệ 30 Hình Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc phương pháp TLC 31 Hình Kết khảo sát ảnh hưởng betamethason dexamethason lên việc phát CLO, CYP, LOR 32 Hình Sắc ký đồ xác định giới hạn phát phương pháp TLC 33 Hình Kết phân tích mẫu thực TLC 34 ĐẶT VẤN ĐỀ Dị ứng ngày coi bệnh sống đại, đặc biệt bối cảnh ô nhiễm môi trường ngày trầm trọng Tỉ lệ mắc bệnh dị ứng hen suyễn gia tăng toàn giới, đặc biệt là nước có thu nhập bình qn đầu người thấp trung bình [28] Hơn nữa, phức tạp mức độ nghiêm trọng bệnh dị ứng, bao gồm hen suyễn, tiếp tục gia tăng đặc biệt trẻ em niên [28] Hiện giới có khoảng tỉ người mắc dị ứng [32], có 300 triệu người bị hen suyễn, 400 triệu người viêm mũi dị ứng [28] Ở Việt Nam, tỉ lệ mắc dị ứng khoảng 20% dân số nước [33] Nhóm thuốc sử dụng phổ biến để điều trị dị ứng nhóm kháng histamin Nhóm thuốc gây tác dụng không mong muốn nghiêm trọng như: buồn ngủ, khô mắt, dị ứng, lệ thuộc thuốc [3] Đặc biệt trộn lẫn vào chế phẩm đông dược dùng thời gian dài làm trầm trọng tác dụng khơng mong muốn Trong nhóm thuốc kháng histamin, thuốc thuộc hệ bên cạnh tác dụng điều trị dị ứng có tác dụng an thần, giúp người bệnh dễ chịu ngủ ngon, có nguy trộn cao hệ Chlorpheniramin, cyproheptadin, loratadin thuốc kháng histamin hệ có liều dùng thấp, rẻ tiền, dễ mua, lựa chọn đầu tay điều trị dị ứng nên có khả bị trộn trái phép cao chế phẩm đông dược Sử dụng thuốc thực phẩm chức (TPCN) có nguồn gốc từ đơng dược thay cho chế phẩm có nguồn gốc tổng hợp hóa dược xu phổ biến Việt Nam giới Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% người dân nước phát triển sử dụng thường xuyên thuốc cổ truyền chăm sóc sức khỏe [20] Nhiều chế phẩm đông dược đưa vào thị trường để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe người dân, nhiên, tồn nhiều chế phẩm pha trộn với tân dược [15], [20] Các tân dược tìm thấy điển hình thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid… [14], [21], [24], [30] Trong đó, có số công bố thuốc chống dị ứng bao gồm nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 chlorpheniramin, cetirizin, diphenylhydramin, loratadin… [21], [26], [29] Hình PL5 Kết chạy TLC mẫu thực 1- VN01 – H02 – H05 – B04 – B03 – H06 – B07 – B11 – H12 10 – B13 11 – H21 12 – B10 13 – B23 14 – B24 15 – B26 Phụ lục 6: Sắc ký đồ, kết định danh hình ảnh mẫu dương tính LCMS/MS 8.1 Mẫu H05 Hình PL6 Sắc ký đồ phổ đinh danh CYP mẫu H05 Hình PL6 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H05 để định lượng Hình PL6 Mẫu dương tính H05 8.2 Mẫu H21 Hình PL6 Sắc ký đồ phổ định danh CLO mẫu H21 Hình PL6 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H21 để định lượng Hình PL6 Mẫu dương tính H21 8.3 Mẫu B11 Hình PL6 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B11 Hình PL6 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B11 để định lượng Hình PL6 Mẫu dương tính B11 8.4 Mẫu H12 Hình PL6 10 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu H12 Hình PL6 11 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H12 để định lượng Hình PL6 12 Mẫu dương tính H12 8.5 Mẫu B13 Hình PL6 13 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B13 Hình PL6 14 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B13 để định lượng Hình PL6 15 Mẫu dương tính B13 8.6 Mẫu B23 Hình PL6 16 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B23 Hình PL6 17 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B23 để định lượng Hình PL6 18 Mẫu dương tính B23 8.7 Mẫu B24 Hình PL6 19 Sắc ký đồ phổ định danh chlorpheniramin maleat mẫu B24 Hình PL6 20 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B24 để định lượng Hình PL6 21 Mẫu dương tính B24 ... HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ AN Mã sinh viên : 1401004 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC THUỐC KHÁNG HISTAMIN TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐƠNG DƯỢC BẰNG LCMS/MS VÀ TLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC... trộn trái phép chế phẩm đông dược LC- MS/MS TLC Với mục tiêu: Xây dựng phương pháp xác định đồng thời chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid, loratadin trộn trái phép chế phẩm đông dược. .. [26] Các phương pháp phổ biến xác định thuốc kháng histamin trộn chế phẩm đông dược tham khảo tổng hợp bảng sau: Bảng Một số nghiên cứu phân tích thuốc kháng histamin trộn trái phép chế phẩm đông