NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ NGHIÊN cứu ĐỊNH TÍNH một số CHẤT ức CHẾ MEN PHOSPHODIESTERASE 5 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM có NGUỒN gốc dược LIỆU BẰNG sắc ký lớp MỎNG kết hợp PHỔ RAMAN TĂNG CƯỜNG bề mặt (TLC – SERS) LUẬN văn THẠ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ MEN PHOSPHODIESTERASE-5 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM CÓ NGUỒN GỐC DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP PHỔ RAMAN TĂNG CƯỜNG BỀ MẶT (TLC – SERS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: TS Đào Thị Cẩm Minh PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà HÀ NỘI 2022 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc mình, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô TS Đào Thị Cẩm Minh cô PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà quan tâm, tận tình hướng dẫn, dạy bảo, động viên hỗ trợ em suốt trình làm luận văn Em xin cảm ơn quý Thầy Cô mơn Hóa phân tích Độc chất q Thầy Cô trường Đại học Dược Hà Nội tâm huyết truyền dạy kiến thức, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để em học tập, nghiên cứu Em xin cảm ơn hỗ trợ kinh phí thiết bị máy móc từ đề tài cấp Nafosted, mã số đề tài 104.04-2020.29 Em xin trân trọng cảm ơn Hội đồng Trường Đại học Dược Hà Nội, Phòng Đào tạo Sau Đại học tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng em trình học tập nghiên cứu Lời sau cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới người thân gia đình, tới người bạn, tới lãnh đạo đồng nghiệp Khoa Dược, trường Đại học Y Dược, Đại học Huế, anh chị lớp đồng hành, giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian học tập hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, tháng năm 2022 Học viên Nguyễn Thị Quỳnh Như MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Chất ức chế phosphodiesterse – 1.1.2 Tình hình trộn trái phép chất ức chế PDE – chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu giới Việt Nam 1.2 Tổng quan phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt TLC – SERS 1.2.1 Phương pháp quang phổ Raman 1.2.2 Phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS) 1.2.3 Dung dịch keo sử dụng cho phương pháp SERS 10 1.2.4 Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 12 1.2.5 Một số ứng dụng phương pháp TLC – SERS 14 1.3 Một số phương pháp định tính chất ức chế PDE – trộn chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu 14 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 18 2.1.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 18 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 18 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Xây dựng thẩm định quy trình định tính vardenafil tadalafil trộn lẫn chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 19 2.2.2 Ứng dụng quy trình xây dựng để phát vardenafil tadalafil trộn trái phép số chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu thu thập thị trường 21 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1 Xây dựng thẩm định quy trình định tính vardenafil tadalafil trộn lẫn chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 23 3.1.1 Xây dựng thẩm định quy trình định tính vardenafil 23 3.1.2 Xây dựng thẩm định quy trình định tính tadalafil 34 3.2 Ứng dụng quy trình xây dựng để phát chất ức chế phosphodiesterase – trộn trái phép số chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu thu thập thị trường 44 Chương BÀN LUẬN 48 4.1 Lựa chọn phương pháp 48 4.2 Quy trình định tính vardenafil trộn lẫn chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu TLC – SERS 48 4.2.1 Xây dựng quy trình định tính vardenafil 48 4.2.2 Thẩm định phương pháp 50 4.3 Quy trình định tính tadalafil trộn lẫn chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu TLC – SERS 51 4.3.1 Xây dựng quy trình định tính tadalafil 51 4.3.2 Thẩm định phương pháp 52 4.4 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phát vardenafil tadalafil trộn trái phép số chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu thu thập thị trường 53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC 63 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT cGMP Ý NGHĨA (TỪ NGUYÊN) Guanosine monophosphate vòng (Cyclic guanosine monophosphate) CRE Hiệu ứng giọt cà phê (Coffee ring effect) DCRE Hiệu ứng giọt cà phê kép (Double coffee ring effect) EM Điện trường (Ectromagnetic) EU Liên minh Châu Âu (European Union) GC – EI – MS Sắc ký khí khối phổ với nguồn điện tử (Gas chromatographyelectron impact-mass spectrometer) GC – QQQMS Sắc ký khí kết hợp khối phổ ba tứ cực (Gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) HPTLC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High performance thin layer chromatography) LC – ESI – Sắc ký lỏng hai lần khối phổ với nguồn ion hóa điện từ (Liquid MS/MS chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry) LC – MS Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ (Liquid chromatography-mass spectrometry) LC – MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid chromatography tandem mass spectrometry) LC – Q – TOF – Sắc ký lỏng khối phổ với tức cực thời gian bay (Liquid MS chromatography - quadrupole-time of flight mass spectrometer) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) MS Phổ khối (Mass spectrum) PAH Tăng huyết áp động mạch phổi (Pulmonary arterial hypertension) PDE – Phosphodiesterae – PVA Polyvinyl alcohol S/N Tín hiệu/nhiễu (Signal/noise) SERS Phổ Raman tăng cường bề mặt (Surface-enhanced Raman spectroscopy) SWGDRUG Nhóm cơng tác khoa học cho phân tích thuốc bị thu giữ (Scientific Working Group for the Analysis of Seized Drugs) TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron microscopy) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) U – HPLC – Sắc ký lỏng siêu hiệu hai lần khối phổ có độ phân giải cao HRMS/MS (Ultra-high performance liquid chromatography-high resolution tandem mass spectrometry) UV Tử ngoại – khả kiến (Ultraviolet – Visible) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tổng quan vardenafil tadalafil Bảng 1.2 Phân loại kỹ thuật phân tích SWGDRUG 12 Bảng 3.1 Các đỉnh đặc trưng vardenafil 26 Bảng 3.2 Cách chuẩn bị hỗn dịch keo bạc có nồng độ khác 27 Bảng 3.3 Các đỉnh đặc trưng tỷ lệ cường độ SERS đỉnh vardenafil với nồng độ khác 31 Bảng 3.4 Kết xác định giới hạn phát vardenafil 32 Bảng 3.5 Các đỉnh đặc trưng tadalafil 37 Bảng 3.6 Các đỉnh đặc trưng tỷ lệ cường độ SERS đỉnh tadalafil với nồng độ khác 41 Bảng 3.7 Kết xác định giới hạn phát tadalafil 44 Bảng 3.8 Bảng đỉnh đặc trưng tỉ lệ cường độ SERS đỉnh mẫu dương tính vardenafil 46 Bảng 3.9 Bảng đỉnh đặc trưng tỉ lệ cường độ SERS đỉnh mẫu dương tính tadalafil 46 DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Các thành phần tán xạ thu sau cho ánh sáng kích thích đến mẫu Hình 1.2 Quy trình phân tích mẫu theo phương pháp TLC – SERS 14 Hình 1.3 Phổ SERS chất ức chế PDE-5 nghiên cứu [57] 17 Hình 1.4 Sắc ký đồ TLC phổ SERS mẫu nghi ngờ có chứa sildenafil 17 Hình 3.1 Cấu trúc hóa học phổ Raman chuẩn Sildenafil Vardenafil 23 Hình 3.2 Phổ Raman vardenafil, silicagel-keo bạc dung dịch vardenafil TLC đo tia laser 633 nm (a); 785 nm (b) 25 Hình 3.3 Hình ảnh phổ SERS (a) sắc ký đồ TLC (b) vardenafil nhỏ keo bạc tâm vết rìa vết 27 Hình 3.4 Hình ảnh phổ SERS vardenafil nhỏ keo bạc nồng độ khác 28 Hình 3.5 Kết khảo sát thể tích nhỏ kheo bạc (a) vị trí chiếu tia laser (b) 29 Hình 3.6 Kết khảo sát thời gian chiếu tia laser 30 Hình 3.7 Phổ SERS dung dịch vardenafil nồng độ khác 31 Hình 3.8 Phổ SERS đánh giá độ chọn lọc: (a) vardenafil viên nang so với viên nang; (b) vardenafil viên hoàn so với viên hoàn; (c) vardenafil cao thuốc so với cao thuốc 33 Hình 3.9 Cấu trúc hóa học phổ Raman chuẩn Tadalafil, Vardenafil, Sildenafil 34 Hình 3.10 Phổ Raman tadalafil, silicagel-keo bạc dung dịch tadalafil TLC đo tia laser 633 nm (a); 785 nm (b) 36 Hình 3.11 Hình ảnh phổ SERS (a) sắc ký đồ TLC (b) tadalafil nhỏ keo bạc tâm vết rìa vết 38 Hình 3.12 Phổ SERS tadalafil nhỏ keo bạc nồng độ khác 39 Hình 3.13 Kết khảo sát thể tích nhỏ kheo bạc (a) vị trí chiếu tia laser (b) 40 Hình 3.14 Phổ SERS dung dịch tadalafil nồng độ khác 41 Hình 3.15 Phổ SERS đánh giá độ chọn lọc: (a) tadalafil viên nang so với viên nang; (b) tadalafil viên hoàn so với viên hoàn; (c) tadalafil cao thuốc so với cao thuốc 43 Hình 3.16 Sắc kí đồ phân tích mẫu chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu thị trường 45 Hình 3.17 Phổ SERS mẫu nghi ngờ có chứa vardenafil 45 Hình 3.18 Phổ SERS mẫu nghi ngờ có chứa tadalafil 46 Hình 3.19 Sắc ký đồ phổ khối vardenafil mẫu dương tính VNP04 47 ĐẶT VẤN ĐỀ Vardenafil tadalafil chất ức chế men phosphodiesterase loại (PDE – 5) sử dụng để điều trị rối loạn cương dương nam giới Các thuốc trộn trái phép tràn lan chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu nước [6], [7], [23], [27], [33], [35], [37], [39], [48], [49], [55], [59] Các tác dụng phụ đáng kể mặt lâm sàng chất ức chế PDE – nhức đầu, đỏ bừng mặt, khó tiêu rối loạn thị giác [34], [53] Việc đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng mà cịn ảnh hưởng đến uy tín sở sản xuất thuốc có nguồn gốc từ dược liệu chân Một số thuốc nhóm PDE – có vardenafil tadalafil đưa vào danh mục chất cấm sử dụng thực phẩm bảo vệ sức khỏe Thông tư số 10/2021/TT-BYT ngày 30/06/2021 “Quy định danh mục chất cấm sử dụng sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe” Do đó, nhu cầu cấp thiết đặt phát triển phương pháp nhanh chóng, có tính đặc hiệu cao để phát thuốc trộn lẫn trái phép chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu Trong năm gần đây, quang phổ Raman phương pháp nhận quan tâm có nhiều ứng dụng kiểm nghiệm thuốc, có độ đặc hiệu cao đặc biệt sử dụng phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS – Surface-enhanced Raman scattering) [6], [11], [20], [43], [52], [56], [58], [59] Tuy nhiên, mẫu chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu với thành phần phức tạp, phát huỳnh quang mạnh bền với nhiệt tia laser thách thức Raman Do đó, phương pháp TLC – SERS sử dụng sắc ký lớp mỏng để khắc phục nhược điểm này, kết hợp với phổ Raman tăng cường bề mặt (SERS) giúp phát nhanh chỗ chất phân tích với độ nhạy cao, đơn giản, áp dụng thành công để phát chất phân tích khác nhau, đặc biệt phát chất trộn trái phép chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu [23], [43], [48], [57], [60], [61] Hiện có nhiều phương pháp phát nhóm PDE – trộn trái phép chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu phương pháp TLC – SERS chưa có nhiều cơng bố Năm 2017, nghiên cứu Xiaopeng Hu cộng [57] sử dụng 49 Mokhtar S.U., Chin S.T., Kee C.L., et al (2016), "Rapid determination of sildenafil and its analogues in dietary supplements using gas chromatography– triple quadrupole mass spectrometry", Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 121, pp 188-196 50 Pappula N., Kodali B., Datla P.V (2018), “Selective and rapid determination of tadalafil and finasteride using solid phase extraction by high performance liquid chromatography and tandem mass spectrometry”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 152, pp 215-223 51 Ru E C L and Etchegoin P G (2009), Principles of Surface-Enhanced Raman Spectroscopy and Related Plasmonic Effects, Elsevier 52 Sacré P.Y., Deconinck E., Saerens L., De Beer T., Courselle P., Vancauwenberghe R., Chiap P., Crommen J., and De Beer J.O (2011), “Detection of counterfeit Viagra® by Raman microspectroscopy imaging and multivariate analysis”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 56(2), pp 454-461 53 Sweetman S.C (2009), Martindale - the complete drug reference Thirty-sixth edition, pp 2193-2200 54 SWGDRUG (2014), Scientific working group for the analysis of seized drugs (SWGDRUGS) recommendations, pp.1-79 55 Tiên T.K.Do, Theocharis G., et al (2015), "Simultaneous Detection of Three Phosphodiesterase Type Inhibitors and Eight of Their Analogs in Lifestyle Products and Screening for Adulterants by High-Performance Thin-Layer Chromatography", Journal of AOAC International, 98(5), pp 1226-1233 56 Vankeirsbilck T., Vercauteren A., Baeyens W., Van der Weken G., Verpoort F., Vergote G., and Remon J.P (2002), “Applications of Raman spectroscopy in pharmaceutical analysis”, TrAC Trends in Analytical Chemistry, 21(12), pp 869-877 57 Xiaopeng H., Fang G., Han A., et al (2017), ''Rapid detection of six phosphodiesterase type enzyme inhibitors in health care products using thin- 61 layer chromatography and surface enhanced Raman spectroscopy combined with BP neural network'', Journal of Separation Science, 40(11), pp 2506-2514 58 Zhang Y., Huang X., Liu W., et al (2013), ''Analysis of drugs added into Chinese traditional Patent medicine using Surface-enhanced Raman scattering'', Analytical sciences, 29(10), pp 985-990 59 Zhao H., Hasi W., et al (2017), “Rapid Detection of Sildenafil Drugs in Liquid Nutraceuticals Based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Technology”, Chinese Journal of Chemistry, 35(10), pp 1522-1528 60 Zhu Q., Cao Y., Cao Y., Chai Y., Lu F (2014), ''Rapid on-site TLC–SERS detection of four antidiabetes drugs used as adulterants in botanical dietary supplements'', Analytical and Bioanalytical Chemistry, 406(7), pp 1877-1884 61 Zhu Q., Cao Y., Cao Y., Lu F (2014), “Rapid Detection of Four Antipertensive Chemicals Adulterated in Traditional Chinese Medicine for Hypertension Using TLC-SERS”, Spectroscopy and Spectral Analysis, 34(4), pp 990-993 62 PHỤ LỤC Phụ lục Kết thẩm định phương pháp TLC-SERS 1.1 Thẩm định độ chọn lọc N+C N H+C H N+C C Ca+C Ca N H+C H C Ca+C Ca (a) (b) Hình PL1.1 Sắc ký đồ TLC thẩm định độ chọn lọc quy trình định tính vardenafil (a) tadalafil (b) Ký hiệu: N+C: nang thêm chuẩn; N: nang; H+C: hoàn thêm chuẩn; H: hoàn; C: chuẩn; Ca+C: cao thêm chuẩn; Ca: cao 63 1.2 Thẩm định giới hạn phát (LOD) Hình PL1.2 Phổ SERS mẫu placebo thêm chuẩn vardenafil mức nồng độ 8,250 µg/ml Hình PL1.3 Phổ SERS mẫu placebo thêm chuẩn tadalafil mức nồng độ 58,8 µg/ml 64 Phụ lục Danh mục mẫu chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu có tác dụng điều trị hỗ trợ điều trị bệnh lý rối loạn cương dương, tăng cương sinh lực thị trường STT Mã SP Dạng bào chế STT Mã SP Dạng bào chế VNP02 Viên nang 25 VNP42 Viên nang VNP03 Viên nang 26 VNP43 Viên nang VNP04 Viên nang 27 VNP44 Viên nang VNP05 Viên nang 28 VNP45 Viên nang VHP08 Viên hoàn 29 VNEP46 Viên nén VNP09 Viên nang 30 VNEP47 Viên nén VNP12 Viên nang 31 VNP48 Viên nang VNEP14 Viên nén 32 VSP48 Viên sủi VNP15 Viên nang 33 VNP50 Viên nang 10 VNP17 Viên nang 34 VNMP51 Viên nang 11 VNP19 Viên nang 35 VNMP52 Viên nang 12 VNP20 Viên nang 36 VNP53 Viên nang 13 VNP24 Viên nang 37 VNP54 Viên nang 14 VNP25 Viên nang 38 VNMP55 Viên nang 15 VNP26 Viên nang 39 VNMP56 Viên nang 16 VHP27 Viên hoàn 40 VHP57 Viên hoàn 17 VNP29 Viên nang 41 VNEP58 Viên nén 18 VNP32 Viên nang 42 VNEP59 Viên nén 19 VNP36 Viên nang 43 VNP60 Viên nang 20 VNP37 Viên nang 44 VNP61 Viên nang 21 VNP38 Viên nang 45 VNP62 Viên nang 22 VNP39 Viên nang 46 VNP63 Viên nang 23 VNP40 Viên nang 47 VNP64 Viên nang 24 VNP41 Viên nang 48 VNP65 Viên nang 65 Phụ lục Kết đo LC-MS/MS mẫu dương tính 3.1 Mẫu VNP04 Hình PL3.1 Sắc ký đồ mẫu dương tính VNP04 66 Hình PL3.2 Kết định danh Tadalafil mẫu VNP04 67 Hình PL3.3 Kết định danh Vardenafil mẫu VNP04 68 3.2 Mẫu VNP09 Hình PL3.4 Sắc ký đồ mẫu dương tính VNP09 69 Hình PL3.5 Kết định danh Tadalafil mẫu VNP09 70 3.3 Mẫu VNP15 Hình PL3.6 Sắc ký đồ mẫu dương tính VNP15 71 Hình PL3.7 Kết định danh Tadalafil mẫu VNP15 72 3.4 Mẫu VNP24 Hình PL3.8 Sắc ký đồ mẫu dương tính VNP24 73 Hình PL3.9 Kết định danh Tadalafil mẫu VNP24 74 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƯ NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ MEN PHOSPHODIESTERASE-5 TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM CÓ NGUỒN GỐC DƯỢC LIỆU BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP PHỔ RAMAN TĂNG CƯỜNG BỀ MẶT (TLC – SERS) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2022 ... dược liệu, tiến hành đề tài: ? ?Nghiên cứu định tính số chất ức chế men phosphodiesterase – trộn trái phép chế phẩm có nguồn gốc dược liệu sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC –. .. pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 12 1.2 .5 Một số ứng dụng phương pháp TLC – SERS 14 1.3 Một số phương pháp định tính chất ức chế PDE – trộn. .. định tính vardenafil tadalafil trộn lẫn chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 2.2.1.1 Xây dựng thẩm định quy trình định tính