KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC: SẮP XẾP THEO HỆ THỐNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ PROTEASE MỤC LỤC PHẦN MỘT. MỞ ĐẦU ................................................................................ 1 1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1 2. Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu ............................................................... 2 2.1. Mục tiêu của đề tài .................................................................................. 2 2.2. Nhiệm vụ của đề tài ................................................................................. 2 3. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 2 4. Tổng quan nghiên cứu vấn đề ..................................................................... 2 4.1. Lịch sử nghiên cứu về protease ................................................................ 2 4.2. Lịch sử nghiên cứu về chất ức chế protease ............................................. 4 5. Thời gian, nội dung và địa điểm nghiên cứu ............................................... 6 5.1. Thời gian và nội dung nghiên cứu ........................................................... 6 5.2. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 7 6. Phương pháp nghiên cứu. ........................................................................... 7 6.1. Phương pháp nghiên cứu lí thuyết ........................................................... 7 6.2. Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm .................................... 7 6.2.1. Phương pháp quang phổ UV – VIS....................................................... 7 6.2.2. Phương pháp chiết dịch thô bằng dung môi hữu cơ .............................. 8 6.2.3. Phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân protein ....................................................................................................................... 9 6.2.4. Xác định hoạt độ protase bằng phương pháp Anson ........................... 10 PHẦN HAI. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 13 Chương 1. Chất ức chế protease và hệ thống phân loại ........................... 13 1.1 Một số chất ức chế protease đã được nghiên cứu .................................... 13 1.2. Hệ thống chất ức chế protease đã được nghiên cứu ............................... 18 Chương 2. Kết quả xác định chất ức chế protease ................................... 22 2.1. Dùng phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân protein nhằm mục đích phát hiện sự có mặt chất ức chế protease. ................ 22 2.2. Sử dụng phương pháp Anson để xác định sự có mặt của chất ức chế protease. ....................................................................................................... 25 PHẦN BA. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 27 3.1. Kết luận ................................................................................................. 27 3.2. Kiến nghị ............................................................................................... 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC
NGUYỄN THỊ THẮM
SẮP XẾP THEO HỆ THỐNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ CHẤT
ỨC CHẾ PROTEASE
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
SƠN LA, NĂM 2013
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC
NGUYỄN THỊ THẮM
SẮP XẾP THEO HỆ THỐNG VÀ BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT MỘT SỐ CHẤT
ỨC CHẾ PROTEASE
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Người hướng dẫn: ThS Nguyễn Văn Dũng
SƠN LA, NĂM 2013
Trang 3Em xin cảm ơn anh Nguyễn Huy Hùng, các bạn: Hà Trà My, Trương Thị Thương, Cầm Thị Nho, Lường Minh Toàn, Phạm Thị Nương, Đinh Văn Lâm lớp K50 ĐHSP Sinh, Trường Đại học Tây Bắc đã giúp đỡ, ủng
hộ nhiệt tình cho em trong suốt thời gian qua
Đề tài của đã hoàn thành nhưng không thể tránh khỏi những thiếu sót
Em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của các thầy, cô giáo và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn
Trang 4MỤC LỤC
PHẦN MỘT MỞ ĐẦU 1
1 Đặt vấn đề 1
2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu 2
2.1 Mục tiêu của đề tài 2
2.2 Nhiệm vụ của đề tài 2
3 Đối tượng nghiên cứu 2
4 Tổng quan nghiên cứu vấn đề 2
4.1 Lịch sử nghiên cứu về protease 2
4.2 Lịch sử nghiên cứu về chất ức chế protease 4
5 Thời gian, nội dung và địa điểm nghiên cứu 6
5.1 Thời gian và nội dung nghiên cứu 6
5.2 Địa điểm nghiên cứu 7
6 Phương pháp nghiên cứu 7
6.1 Phương pháp nghiên cứu lí thuyết 7
6.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 7
6.2.1 Phương pháp quang phổ UV – VIS 7
6.2.2 Phương pháp chiết dịch thô bằng dung môi hữu cơ 8
6.2.3 Phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân protein 9
6.2.4 Xác định hoạt độ protase bằng phương pháp Anson 10
PHẦN HAI KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 13
Chương 1 Chất ức chế protease và hệ thống phân loại 13
1.1 Một số chất ức chế protease đã được nghiên cứu 13
1.2 Hệ thống chất ức chế protease đã được nghiên cứu 18
Chương 2 Kết quả xác định chất ức chế protease 22
2.1 Dùng phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân protein nhằm mục đích phát hiện sự có mặt chất ức chế protease 22
Trang 52.2 Sử dụng phương pháp Anson để xác định sự có mặt của chất ức chế
protease 25
PHẦN BA KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 27
3.1 Kết luận 27
3.2 Kiến nghị 27
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Trang 6PHẦN MỘT MỞ ĐẦU
1 Đặt vấn đề
Enzyme là những chất xúc tác sinh học do cơ thể sống tổng hợp nên Chúng xúc tác cho các phản ứng hóa sinh Nhờ có enzyme mà các quá trình hóa sinh xảy ra nhạy và với tốc độ rất nhanh trong những điều kiện sinh l í bình thường (nhiệt độ cơ thể và pH môi trường tế bào)
Enzyme có ở trong mọi sinh vật và là động lực của mọi quá trình sống Hay có thể nói enzyme là những chất mà dưới tác dụng của chúng các phản ứng hóa sinh được thực hiện nhanh chóng với nhịp điệu, trình tự rõ ràng và chính xác trong quá trình trao đổi vật chất của cơ thể sống
Lịch sử enzyme đã có từ rất lâu, ngay từ thế kỷ XIX đã có những nghiên cứu ghi nhận sự hiện diện của chất xúc tác sinh học này trong quá trình tiêu hóa ở nước bọt, dạ dày và ruột Năm 1850, Pasteur đã nhận định quá trình lên men được một yếu tố xúc tác là ferment Sau này yếu tố trên được thống nhất gọi là enzyme Năm 1897, người ta đã chứng minh chính dịch chiết của
thành rượu Đó là bằng chứng về sự tham gia của bản thân enzyme trong quá trình lên men Năm 1926, lần đầu tiên Sammer đã thu được tinh thể enzyme Urease Năm 1930, Northrop thu được tinh thể Pepsin và Trypsin [26]
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm, lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm fomat, làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da, y tế, nông nghiệp…[29] Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công
bố về nghiên cứu và sử dụng protease, chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật Hiện nay, công nghệ enzyme ở nước ta còn khá mới mẻ, các đề tài nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nghiên cứu việc thu nhận enzyme,
sử dụng enzyme vào các công nghệ sản xuất và chế biến thực phẩm
Trang 7Nhằm phục vụ cho các công tác nghiên cứu chuyên sâu về protease,
chúng tôi thực hiện đề tài: “Sắp xếp theo hệ thống và bước đầu nghiên cứu tách chiết một số chất ức chế protease”
2 Mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu
2.1 Mục tiêu của đề tài
- Sắp hệ thống các chất ức chế protease
- Tách chiết và bước đầu nghiên cứu một số chất ức chế protease
2.2 Nhiệm vụ của đề tài
- Sưu tập các bài báo trong nước và ngoài nước, các tạp chí, các báo báo
có liên quan đến protease và các chất ức chế protease
- Sắp xếp các chất đã công bố theo một quy tắc nhất định
- Thực hiện tách chiết một số chất ức chế protease
- Thử khả năng ức chế enzyme của dịch chiết thu được
3 Đối tượng nghiên cứu
Chất ức chế protease trong dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc, quả Mướp đắng và hạt Gấc
4 Tổng quan nghiên cứu vấn đề
4.1 Lịch sử nghiên cứu về protease
Protease là các enzyme xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein, chuỗi polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển acid amin
Các protease từ động vật
Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả Từ thế kỷ XVIII, nhà tự nhiên học người Pháp là Reaunur đã làm thí nghiệm rất đơn giản và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt
có khả năng tiêu hóa thịt [11]
Năm 1836, Schwam đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị Tuy nhiên, mãi đến hơn 30 năm sau người ta mới tách được enzyme này [11]
Trang 8Năm 1857, Corvisart tách được trypsine từ dịch tụy Đây là protease đầu tiên thu nhận được ở dạng chế phẩm, trong chế phẩm vẫn còn lẫn nhiều protein khác [11]
Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colondion đã tách được trypsine với amylase tụy tạng Phương pháp này có ý nghĩa rất lớn trong nghiên cứu tinh chế enzyme và protein
Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm chymotrypsine (renin) Ngoài những enzyme của hệ tiêu hóa, các nhà khoa học cũng có những nghiên cứu đầu tiên về protease trong máu Schidt đã nêu giả thiết rằng trong máu có enzyme fibrin (ngày nay gọi là trombin) tham gia trong quá trình đông máu Ông đã tiến hành việc tách chiết enzyme này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm nhận được có tác dụng làm cho dung dịch fibrinogen đông lại nhanh chóng
là papain
Các protease từ vi sinh vật
Các protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm
1950, mặc dầu từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu protease vi vinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các công trình nghiên cứu protease của động vật và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế
Trang 9Trong thời gian gần đây người ta cũng đã có những phương pháp thích hợp để thu nhận chế phẩm không tan của protesae Kết quả này mở ra triển vọng to lớn trong nghiên cứu và các ứng dụng của các protease
4.2 Lịch sử nghiên cứu về chất ức chế protease
Trên thế giới
Các chất ức chế protease trong tự nhiên được báo cáo lần đầu tiên năm
1894 bởi Fermi và Pernossi khi hai nhà khoa học này phát hiện hoạt tính chống trypsine trong huyết thanh người
Tuy nhiên, những thành tựu trong nghiên cứu các chất ức chế chỉ thực sự được bắt đầu với những công trình nghiên cứu của Kunitz và Nothrop về chất
ức chế trypsin tụy bò Cùng với trypsin, sau này nhiều protease khác đã được
sử dụng để phát hiện các chất ức chế protease như: chymotrypsin, elastase, subtilisin và các protease tinh chế từ nấm [25]
Gần 40 năm, chất ức chế protease được xem như chất không tốt về dinh dưỡng Mãi đến năm 1980, Dr Walter Troll thuộc trường đại học y khoa (New York University Medical Center) đã khám phá rằng đậu nành nguyên sơ có khả năng ngăn cản không cho bệnh ung thư phát triển ở các loài động vật do tác dụng của chất ức chế protease Tiếp sau đó nhiều nhà khoa học đã khảo sát và thử nghiệm chất ức chế protease từ đậu nành trong phòng thí nghiệm và thấy rằng nó có tác dụng chống lại sự phát triển mầm ung thư kết tràng (colon), ung thư phổi, ung thư tuyến tụy và ung thư miệng [25]
Năm 1987, Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute)
đã nhận thấy vai trò quan trọng của chất ức chế protease như một loại thuốc chữa bệnh ung thư Chúng ngăn cản sự tác động của một số genes di truyền gây nên chứng ung thư Ngoài ra chúng còn có tác dụng bảo vệ các tế bào cơ thể không cho hư hại, gây nên bởi môi trường xung quanh như tia nắng phóng
xạ, các gốc tự do, chất có thể tấn công ADN [11]
7/11/2002, tại New York, Theo một nghiên cứu gần đây thì chất ức chế protease do bạch cầu chế tiết (Secretory leukocyte protease inhibitor, SLPI) một protein được tìm thấy trong nước bọt và nơi khác có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa sự lây truyền HIV/AIDS qua sữa mẹ [11] Các báo cáo trước đây cho thấy SLPI có khả năng bảo vệ tế bào không bị nhiễm HIV trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên, nồng độ SLPI trong nước bọt
ở trẻ nhũ nhi có ảnh hưởng đến nguy cơ lây truyền HIV-1 từ mẹ sang con hay không thì chưa được rõ
Trang 10Tiến sĩ Carey Farquhar, thuộc Trường Đại học Washington ở Seattle và cộng sự đang tiến hành nghiên cứu đo lường nồng độ của SLPI trong các mẫu nước bọt từ 188 trẻ nhũ nhi của các bà mẹ bị nhiễm HIV Các mẫu nước bọt này được lấy lúc sinh và lúc 1, 3, 6 tháng tuổi
Ngày 20 tháng 1 năm 2006, các nhà khoa học Coralie E Halls, Sally W Rogers, Mohammed Oufattole, Ole Ostergard, Birte Svenssonb, John C Rogersa làm việc tại Viện Hóa học Sinh học, Đại học bang Washington, Mỹ
đã công bố đề tài nghiên cứu về Kunitz – một chất ức chế cysteine protease tinh chế từ Cauli ower và Arabidopsis Đề tài này đã nghiên cứu về trình tự gen tổng hợp chất ức chế Kunitz và kiểm tra hoạt động của chúng trong một
số môi trường khác nhau [11]
Đến nay, các chất ức chế protease đã được tìm thấy rộng rãi trong tự nhiên từ nguồn thực vật, động vật, vi khuẩn Có thể nói không ở tổ chức sống nào là không tồn tại các chất ức chế protease và nhiều chất ức chế protease đã được tổng hợp nhân tạo
Một số công trình nghiên cứu ứng dụng của chất ức chế protease vào các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như:
“Sử dụng các chất ức chế protease trong xét nghiệm hiện kháng nguyên”
của Thurgau, Viện Công nghệ sinh học tại Đại học Constance, Kreuzlingen, Thụy Sĩ [29]
“Kháng virus hoạt động của các chất ức chế protease chống lại Toxoplasma
gondii” Bộ môn Ký sinh trùng, Viện Y học Nhiệt đới, Pedro Kouri, Havana,
Cuba
“Phân lập chất ức chế Pepsin từ rễ của cây Anchusa strigosa” của Sở
Khoa học sinh học, Khoa Khoa học, Đại học Jordan, Amman, Jordan [14]
“Nghiên cứu về một số chất ức chế protease aspartic: quy định tổng hợp protease nội sinh trong giai đoạn vận động nảy mầm trong hạt giống Vigna radiate” của Phòng khoa học Sinh hóa, phòng thí nghiệm và hóa chất quốc
gia, Ấn Độ do Aarohi Kulkarni, Mala Rao thực hiện [18]
Ở Việt Nam
Một số luận văn, đề tài, báo cáo khoa học cũng nghiên cứu về chất ức chế protease trên khía cạnh điều trị căn bệnh ung thư hoặc phương pháp tách chiết và sử dụng các thực phẩm chứa các chất ức chế protease vào đời sống như:
Trang 11Báo cáo “Chiết xuất và phân lập các isoflavonoid từ đậu nành Glycine max” [28]
Luận văn “Polyphenol và hoạt độ ức chế của một số serine proteinase từ thân, hạt gỗ Vang (Caesalpinia sappan L.) và một số cây thuốc khác” Tác
giả Nguyễn Minh Thắng - Trường Đại học Quốc gia Hà Nội Theo tác giả, ở
Việt Nam nghiên cứu cũng cho thấy trong dịch nuôi cấy Pseudomonas có ít nhất 5 protein (polypeptide) có hoạt tính phân giải protein ở pH kiềm [11]
“Nghiên cứu điều tra các chất ức chế proteinase ở các phần khác nhau của thân và hạt cây Tô mộc (Caesalpinia sappan L)” Do Hoàng Thu Hà và
Phạm Thị Trân Châu thực hiện Công trình này nghiên cứu tác dụng của dịch
chiết từ các phần khác nhau của thân và hạt cây Tô mộc (C.sappan) đến hoạt
độ của một số loại proteinase [27]
Luận văn: “Tìm hiểu về Bromelain enzyme, chiết suất và ứng dụng” [27] Luận văn: “Sản xuất sữa chua đậu nành bổ sung tảo SPIRULINA” [27]
Tại Sơn La
Hiện nay chưa có công trình khoa học nào nghiên cứu về chất ức chế protease Bên cạnh đó đã có ứng dụng thuốc ức chế trong điều trị bệnh HIV
và một số bệnh khác tại các bệnh viện [25]
5 Thời gian, nội dung và địa điểm nghiên cứu
5.1 Thời gian và nội dung nghiên cứu
Tháng 9 – tháng
10 /2012
Chọn đối tượng nghiên cứu
Sưu tầm tài liệu Viết đề cương
Chọn được đối tượng thích hợp
Tìm được tài liệu Hoàn thành đề cương đề tài
Tháng 3 – tháng 4
/2013
Thực hiện tách chiết một số chất ức chế protease
Tách chiết thành công một
số chất ức chế protease
Trang 125.2 Địa điểm nghiên cứu
Phòng thực hành Bộ môn Thực vật – Di truyền – Hóa sinh – Phương pháp
6 Phương pháp nghiên cứu
6.1 Phương pháp nghiên cứu lí thuyết:
+) Thu thập tài liệu:
Thu thập tất cả các tài liệu có liên quan tới đề tài như:
- Tài liệu nghiên cứu về protease
- Tài liệu nghiên cứu về chất ức chế protease
+) Phân tích và tổng hợp lí thuyết
- Tổng hợp các chất thu được sau khi nghiên cứu lí thuyết
- Phân tích: trên cơ sở những tài liệu thu thập được, phân tích và lựa chọn thông tin cần thiết cho đề tài
6.2 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
6.2.1 Phương pháp quang phổ UV – VIS [4]
Phương pháp này dùng để định lượng các hợp chất chính xác và thuận tiện nhất
Phương pháp này dựa trên sự hấp hấp thụ ánh sáng của một số hợp chất tại vùng bước sóng nhất định và hàm lượng của chất đó được tính ra theo nguyên tắc của định luật Lambert – Beer
Phổ hấp thụ UV – VIS là phổ hấp thụ các chất tan ở trạng thái dung dịch đồng thể của một dung môi nhất định như: nước, metanol, benzen, toluen, cloroform, Vì thế muốn thực hiện phép phổ này cần phải:
- Hòa tan chất phân tích trong một dung môi phù hợp
- Chiếu vào dung dịch mẫu chứa hợp chất cần phân tích một chùm bức
xạ đơn sắc có mức năng lượng phù hợp để cho chất phân tích hay sản phẩm của nó hấp thụ bức xạ để tạo ra phổ UV – VIS của nó
- Đo cường độ của chùm sáng sau khi đã qua dung dịch mẫu nghiên cứu Phương trình cơ bản của của phép đo định lượng theo phổ UV – VIS là:
A = ε.l.C (ε.l = const vậy A = f(C) hàm bậc nhất)
Trang 13Bằng cách chuẩn bị một dãy màu có nồng độ tăng dần và biết chính xác
mối quan hệ A – C) và dung dịch màu của chất cần xác định nồng độ trong điều kiện phân tích như dãy dung dịch chuẩn Nghiên cứu chọn điều kiện phù hợp nhất đo độ phổ của các mẫu chuẩn và mẫu phân tích như các thông số về thời gian, môi trường, loại cuvet, Đo độ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn, dựng đường chuẩn độ theo hệ tọa độ A – C sau đó đo độ hấp thụ
Nguyên tắc:
ứng hiện màu ở cả hai bình trong điều kiện thí nghiệm thích hợp hoàn toàn
6.2.2 Phương pháp chiết dịch thô bằng dung môi hữu cơ [5]
Nguyên tắc:
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch Ngược lại, các dung môi với hằng
số điện môi nhỏ (aceton, ethanol…) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm
và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton, ancol vào dung dịch chứa protein Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của
Trang 14dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzyme bằng phương
pháp sấy nhẹ bằng quạt gió
Nguyên liệu và hóa chất:
Mẫu đã được cắt nhỏ
Etanol 96%
Máy li tâm
Cách làm:
Lấy một lượng mẫu, thái nhỏ, cho vào bình có lắp ống làm lạnh, cho cồn
(vẫn giữ nguyên ống làm lạnh), thay ống làm lạnh bằng nút đậy kín
6.2.3 Phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân protein [5]
Nguyên tắc:
Dựa vào phản ứng Xiorenxen để bao vây nhóm amin tự do; chuẩn độ nhóm cacboxil tự dobằng kiềm có nồng độ xác định Từ lượng kiềm chuẩn
độ, tính lượng Nitơ amin tương ứng
Nguyên liệu, hóa chất:
chất ức chế, timolphtalein 1% dung dịch foocmol gồm 1ml timolphtalein 1% với 50ml foocmol 40% và vài giọt NaOH 0,1N, dung dịch màu xanh nhạt
Cách làm:
Lấy hai bình nón (V=100ml), cho vào mỗi bình 2g cơ tươi đã nghiền nát
của proteinase có trong cơ Thêm vào bình 1 (đối chứng) 10ml dung dịch axit tricloaxetic 10% để kìm hãm hoạt động của enzyme Cho vào mỗi bình 2ml
thêm vào bình 2: 10ml dung dịch chất ức chế để kìm hãm hoạt động của enzyme Dùng ống đong đo dung tích mẫu (V) Lọc dung dịch trong từng bình, đo lại dung tích dịch lọc, chuyển sang các bình tương ứng với bình thí nghiệm (2) và bình kiểm tra (1) Thêm vào mỗi bình chứa dịch lọc 10ml foocmaldehit và 5 giọt tomolphtalein để làm chất chỉ thị màu Chuẩn độ bằng NaOH 0,2N đến khi xuất hiện màu xanh mực cửu long thì dừng lại
Trang 15Tính kết quả:
X: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu (mg %)
ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn
Nguyên liệu và hóa chất:
- Đệm Sorensen pH=7,6
- Dung dich casein 1%
- Dung dịch axit tricloaxetic 10%
Trang 16Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosine chuẩn 1 mM/l
Lắc và để yên 10 phút, đem đo mật độ quang học ở 720nm
Vẽ đồ thị sự biến thiên mật độ quang học theo lượng tyrosine ở các ống
Trang 17Lắc và để yên 10 phút, đem đo mật độ quang học ở 720nm
