6. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Dùng phương pháp chuẩn độ foocmol để đánh giá mức độ thủy phân
phân protein nhằm mục đích phát hiện sự có mặt chất ức chế protease.
2.1.1. Thực hiện trên thân cây Tô mộc (Caesalpinia sappan) [9]. Giới: Plantae
Bộ: Fabales Họ: Fabaceae Chi: Caesalpinia Loài: C. sappan
Cây Tô mộc (Caesalpinia sappan): hay còn có tên là cây Vang, tô phượng, vang nhuộm, co vang, mạy vang. Là một loài thực vật thân gỗ nhỏ, cao khoảng 5 - 10m, cho gỗ rất rắn, có màu đỏ nâu ở phần lõi và trắng ở phần ngoài, được tìm thấy ở khu vực Đông Nam Á.
Kết quả thí nghiệm:
Sự chênh lệch hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu trong trường hợp bổ sung dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 1: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu khi không bổ sung và có bổ sung dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc (Caesalpinia sappan) (đơn vị: mg%)
Trung bình Thí nghiệm bình thường (Xi) 48,76 ± 0,042
Thí nghiệm bổ sung dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc (X’i)
28,20 ± 0,039
23
Nhận xét: Hàm lượng nitơ amin có trong mẫu tỉ lệ thuận với mức độ thủy phân protein. Trong trường hợp có bổ sung dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc thấy được hàm lượng nitơ amin thấp đáng kể (trung bình: 57,83%) so với thí nghiệm ở điều kiện bình thường. Đồng nghĩa là quá trình thủy phân protein bị ức chế.
Như vậy: Trong dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc có chất ức chế protease.
2.1.2. Thực hiện trên quả Mướp đắng (Momordica charantia) [9]. Giới: Plantae
Bộ: Cucurbitales Họ: Cucurbitaceae Chi: Momordica Loài: M. charantia
Mướp đắng (Momordica charantia): hay còn gọi là khổ qua, là cây leo mọc ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có quả ăn được, thuộc loại đắng nhất trong các loại rau quả.
Kết quả thí nghiệm:
Sự chênh lệch hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu trong trường hợp bổ sung dịch chiết protein từ quả Mướp đắng được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 2: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu khi không bổ sung và có bổ sung dịch chiết protein từ quả Mướp đắng (Momordica charantia)
(đơn vị: mg%)
Trung bình Thí nghiệm bình thường (Xi) 50,40 ± 0,043
Thí nghiệm bổ sung dịch chiết protein từ quả Mướp đắng (X’i)
24,32 ± 0,041
24
Nhận xét: Hàm lượng nitơ amin có trong mẫu tỉ lệ thuận với mức độ thủy phân protein. Trong trường hợp có bổ sung dịch chiết protein từ quả Mướp đắng thấy được hàm lượng nitơ amin thấp đáng kể (trung bình là 48,25%) so với trường hợp không bổ sung dịch chiết.
Như vậy: Trong dịch chiết protein từ quả Mướp đắng có chất ức chế protease.
2.1.3. Thực hiện trên hạt Gấc (Momordica cochinchinensis) [9]. Giới: Plantae
Bộ: Cucurbitales Họ: Cucurbitaceae Chi: Momordica
Loài: M. cochinchinensis
Gấc là loài cây thân thảo dây leo thuộc chi Mướp đắng. Đây là một loại cây đơn tính khác gốc, tức là có cây cái và cây đực riêng biệt. Cây gấc leo khỏe, chiều dài có thể mọc đến 15 m. Thân dây có tiết diện góc. Lá gấc nhẵn, thùy hình chân vịt phân ra từ 3 đến 5 dẻ, dài 8 - 18cm. Hoa có hai loại: hoa cái và hoa đực. Cả hai có cánh hoa sắc vàng nhạt. Quả hình tròn, màu lá cây, khi chín chuyển sang màu đỏ cam, đường kính 15 – 20 cm. Vỏ gấc có gai rậm. Bổ ra mỗi quả thường có sáu múi. Thịt gấc màu đỏ cam. Hạt gấc màu nâu thẫm, hình dẹp, có khía.
Kết quả thí nghiệm
Sự chênh lệch hàm lượng nitơ amin trong mẫu nghiên cứu trong trường hợp bổ sung dịch chiết protein từ hạt Gấcđược thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3: Hàm lượng nitơ amin trong mẫu khi không bổ sung và có bổ sung dịch chiết protein từ hạt Gấc (Momordica cochinchinensis) (đơn vị: mg%)
Trung bình Thí nghiệm bình thường (Xi) 63,09 ± 0,043
Thí nghiệm bổ sung dịch chiết protein từ hạt Gấc (X’i)
35,23 ± 0,059
25
Nhận xét: Hàm lượng nitơ amin có trong mẫu tỉ lệ thuận với mức độ thủy phân protein. Trong trường hợp có bổ sung dịch chiết protein từ hạt Gấc thấy được hàm lượng nitơ amin thấp trung bình 55,84% so với trường hợp không bổ sung dịch chiết.
Như vậy: Trong dịch chiết protein từ hạt Gấc có chất ức chế protease.
2.2. Sử dụng phương pháp Anson để xác định sự có mặt của chất ức chế protease.
2.2.1. Thực hiện trên cây Tô mộc (Caesalpinia sappan)
Sự thay đổi đơn vị hoạt độ của protease khi bổ sung thêm dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 4:Đơn vị hoạt độ của protease trong điều kiện bình thường và điều kiện có bổ sung dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc (UI/ml)
Trung bình
Điều kiện bình thường 0,232 ± 0,0035
Điều kiện có bổ sung dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc
0,073 ± 0,0025
Độ chênh lệch (%) 31,47
Nhận xét: Trong điều kiện bình thường hoạt độ của protesae có giá trị cao hơn hoạt độ của protease khi được bổ sung dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc trung bình là 31,47%
Như vậy: Trong dịch chiết protein từ thân cây Tô mộc có chứa chất ức chế protease. Làm giảm hoạt độ của protease.
2.2.2. Thực hiện trên quả Mướp đắng (Momordica charantia)
Sự thay đổi đơn vị hoạt độ của protease khi bổ sung thêm dịch chiết protein từ quả Mướp đắng được thể hiện ở bảng sau
26
Bảng 5: Đơn vị hoạt độ của protease trong điều kiện bình thường và điều kiện có bổ sung dịch chiết protein từ quả Mướp đắng (UI/ml)
Trung bình
Điều kiện bình thường 0,231 ± 0,0049
Điều kiện có bổ sung dịch chiết protein từ quả Mướp đắng
0,085 ± 0,0033
Độ chênh lệch (%) 36,796
Nhận xét: Trong điều kiện bình thường hoạt độ của protesae có giá trị cao hơn hoạt độ của protease khi được bổ sung dịch chiết protein từ quả Mướp đắng trung bình là 36,796%
Như vậy: Trong dịch chiết protein từ quả Mướp đắng có chứa chất ức chế protease. Làm giảm hoạt độ của protease.
2.2.3. Thực hiện trên hạt Gấc (Momordica cochinchinensis)
Sự thay đổi đơn vị hoạt độ của protease khi bổ sung thêm dịch chiết protein từ hạt Gấc được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 6: Đơn vị hoạt độ của protease trong điều kiện bình thường và điều kiện có bổ sung dịch chiết protein từ hạt Gấc (UI/ml)
Trung bình
Điều kiện bình thường 0,231 ± 0,0030
Điều kiện có bổ sung dịch chiết protein từ hạt Gấc
0,062 ± 0,0026
Độ chênh lệch (%) 26,389
Nhận xét: Trong điều kiện bình thường hoạt độ của protesae có giá trị cao hơn hoạt độ của protease khi được bổ sung dịch chiết protein từ hạt Gấc trung bình là 26,389%
Như vậy: Trong dịch chiết protein từ hạt Gấc có chứa chất ức chế protease.
27
PHẦN BA. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.1. Kết luận
-Có 5 dạng cấu tạo của chất ức chế protease:
+ Dạng chất ức chế protease có bổ sung thêm các thành phần các thành phần vô cơ trong khi sử dụng như: HCl, H2SO4,…
+ Dạng chất ức chế là axit hữu cơ + Dạng chất ức chế là amino axit + Dạng chất ức chế là amin
+ Dạng chất ức chế gồm các chuỗi polypeptide phức tạp - Có thể thu chất chất ức chế từ nhiều nguồn khác nhau:
+ Ở thực vật: từ rễ, thân cây Tô mộc, hạt hoặc hạt trong giai đoạn nảy mầm ở hạt giống Vigna radiate.
+ Ở động vật: từ các cơ quan như: niêm mạc dạ dày,...
+ Ở vi sinh vật: các chủng vi khuẩn như Steptomyces, Bacillus.sp,… - Trong dịch chiết thân cây Tô mộc, quả Mướp đắng và hạt Gấc có mặt chất có bản chất là protein có tác dụng ức chế protease.
- Các chất ức chế không làm ngừng hoạt động của enzyme mà chúng chỉ làm giảm hoạt độ của enzyme.
3.2. Kiến nghị
- Tiếp tục triển khai nghiên cứu chuyên sâu về chất ức chế protease từ các đối tượng nghiên cứu trong khóa luận: Tô mộc, Mướp đắng, Gấc để phục vụ cho các hoạt động khác của đời sống và các ngành công nghiệp.
- Mở rộng nghiên cứu về chất ức chế protease trên các đối tượng khác nhau.
- Đi sâu vào nghiên cứu chất ức chế protease trên các nhóm sinh vật khác nhau (động vật, thực vật và vi sinh vật)
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phạm Thị Trân Châu, 1998. Thực hành Hóa sinh học. NXB Giáo dục.
2. Phạm Thị Trân Châu – Trần Thị Áng, 2009. Hóa sinh học. NXB Giáo dục
3. Trần Bá Cừ - Nguyễn Việt Long – Đặng Văn Sử - Trần Kim Yến, 2004. Từ điển giải nghĩa sinh học. NXB Khoa học và Kỹ thuật.
4. Nguyễn Tinh Dung, 2009. Hóa phân tích (phần ba). NXB Giáo dục. 5. Nguyễn Văn Mùi, 2011. Thực hành Hóa sinh học. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
6. Nguyễn Văn Mùi, 2002. Xác định hoạt độ enzym. NXB Khoa học và kỹ thuật.
7. Phan Tuấn Nghĩa, Giáo trình Hóa sinh học thực nghiệm. NXB Giáo dục Việt Nam.
8. Huỳnh Quang Phước – Ngô Đại Hiệp – Trần Thị Ngọc Mai – Trần Thị Hồng Hạnh – Nguyễn Thị Thu Hà, Tài liệu thực hành phân tích thực phẩm. Trường Đại học Kỹ thật Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.
9. Hoàng Thị Sản, 1999. Phân loại thực vật. NXB Giáo dục.
10. Lã Thành – Trung Dũng, 1994. Từ điển Anh – Việt. NXB Thành phố Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Minh Thắng, 2009. Polyphenol và hoạt đô ức chế một số serine proteinase từ thân, hạt gỗ Vang (Caesalpinia Sappan L.) và một số cây thuốc khác. Đại học Quốc gia Hà Nội.
12. Nguyễn Anh Tuấn – Hà Thanh Toàn – Lê Văn Khoa, 2012. Tạp chí khoa học. Trường Đại học Cần Thơ.
13. Wen-Dee Chiang - May-June Tsou - Zong-Yao Tsai - Tsun-Chung Tsai, 2005. Angiotensin I-converting enzyme inhibitor derived from soy protein hydrolysate and produced by using membrane reactor. Department of Tourism and Hospitality Management, Kainan University, Taiwan, ROC.
14. Ben M.Dunn – Bruce Kammermann – Kenneth R.McCurry, 1983.
Pepsin inhibitor from roots of Anchusa strigosa. Department of Biological Sciennces, Faculty Sciennce, University of Jordan, Amman, Jordan.
15. Trevor F.Ford – John Hermon – Taylor and David A.W Grant, 1982.
A sensitive fluorometric assay for the simultaneous estimation of pepsin and pepsinogen in gastric mucosa. Department of surgery, st, Georgre’s Hospital Medical school, Cranmer Terrace, London.
16. J.C.Gripon,1976. Inactivation of Penicinillium roqueforti acid protease by specific pepsin inhibitiors. Laboratoire de Biochimie Microbienne, France.
17. Coralie E. Halls - Sally W. Rogers - Mohammed Oufattole - Ole Ostergard - Birte Svensson - John C. Rogers, 2006. A Kunitz-type cysteine protease inhibitor from cauli ower and Arabidopsis. Institute of Biological Chemistry, Washington State University, Pullman, USA.
18. Aarohi Kulkarni - Mala Rao, 2009. Differential elicitation of an aspartic protease inhibitor: Regulation of endogenous protease and initial events in germination in seeds of Vigna radiate. Division of Biochemical Sciences, Natinal Chemical Laboratory, India.
19. Christos loannis Mekras, 1989. Inhibition of pepsin y polyions and c.d studies. Chemistry Department, Imperial College of Sciennce, Technology and Medicine, University of London.
20. Maysoon Rassam - William A. Laing, 2006. The interaction of the 11S globulin-like protein of kiwi fruit seeds with pepsin. The Horticultural and Food Research Institute of New Zealand, New Zealand.
21. Vinod Vathipadiekal - Perunthottathu K. Umasankar - Milind S. Patole - Mala Rao, 2009. Molecular cloning, over expression, and activity studies of a peptidic HIV-1 protease inhibitor: Designed synthetic gene to functional recombinant peptide. Division of Biochemical Sciences, National Chemical Laboratory, India.
22. dongyvietbac.com.vn › Kiến thức y khoa › Dược
23. http://inventors.about.com/library/inventors/bl_protease_inhibitors.htm 24. http://www.doko.vn/luan-van 25. http://www.soyte.sonla.gov.vn 26. http://www.wis.egeek/what-is-a-protease-inhibitors.htm 27. UpdateBook.VN-luanvan 28. Tailieu.vn
PHỤ LỤC