Xây dựng phương pháp xác định một số chất ức chế men phosphodiesterase 5 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng bắc ký lớp mỏng hiệu năng cao và sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ raman tăng cường bề mặt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ MEN PHOSPHODIESTERASE – TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP QUANG PHỔ RAMAN TĂNG CƢỜNG BỀ MẶT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC HÀ NỘI 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT ỨC CHẾ MEN PHOSPHODIESTERASE – TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƢỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG KẾT HỢP QUANG PHỔ RAMAN TĂNG CƢỜNG BỀ MẶT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 8720210 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà PGS TS Lê Văn Vũ HÀ NỘI 2018 LỜI CẢM ƠN Lời tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà, người thầy hướng dẫn bảo tận tình cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Văn Vũ – trung tâm Khoa học vật liệu, khoa Vật lý trường Đại học Khoa học Tự nhiên đóng góp ý kiến giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh - giảng viên trường Đại học Dược Hà Nội NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – giảng viên khoa Dược trường Đại học Y-Dược Huế động viên giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn phòng Nghiên cứu Phát triển Công ty cổ phần Traphaco giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, phòng Đào tạo Sau Đại học, , thầy cô giáo, kỹ thuật viên mơn Hố phân tích - Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đồng nghiệp ln bên cạnh ủng hộ, khích lệ tạo động lực cho tơi q trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2018 Học viên NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Tổng quan thực trạng trộn trái phép chất ức chế PDE – chế phẩm đông dược giới Việt Nam 1.1.1.Trên giới 1.1.2.Tại Việt nam 1.2 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.2.1 Chất ức chế PDE – 1.2.2 Sildenafil 1.2.3 Tadalafil 1.2.4 Vardenafil 10 1.3 Tổng quan phương pháp phân tích 11 1.3.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 11 1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao 12 1.3.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt 14 1.4 Một số phương pháp định tính, định lượng chất ức chế PDE - trộn chế phẩm nguồn gốc từ dược liệu 20 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 24 2.1.1 Nguyên vật liệu dùng nghiên cứu 24 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24 2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 25 2.2 Phương pháp nghiên cứu 25 2.2.1 Xây dựng quy trình định tính, định lượng sildenafil, tadalafil, vardenafil trộn trái phép chế phẩm đông dược HPTLC 25 2.2.2 Thẩm định phương pháp 27 2.2.3 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 28 2.2.4 Xây dựng quy trình định tính sildenafil trộn trái phép chế phẩm đông dược phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt (TLC – SERS) 28 2.2.5 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 30 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 30 3.1 Xây dựng thẩm định phương pháp HPTLC 31 3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện HPTLC 31 3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lý mẫu 33 3.1.3 Thẩm định phương pháp 35 3.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 41 3.2 Xây dựng thẩm định phương pháp định tính sildenafil TLC – SERS 46 3.2.1 Khảo sát điều kiện SERS 46 3,2,2, Đánh giá phương pháp 51 3.2.3 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 52 PHẦN 4: BÀN LUẬN 55 4.1 Phương pháp HPTLC 55 4.1.1 Lựa chọn phương pháp phân tích 55 4.1.2 Lựa chọn xử lý mẫu 56 4.1.3 Thẩm định phương pháp 56 4.1.4 Ứng dụng phương pháp HPTLC để phân tích mẫu thực 57 4.2 Phương pháp TLC-SERS 58 4.2.1 Lựa chọn phương pháp 58 4.2.2 Xây dựng quy trình định tính sildenafil TLC – SERS 58 4.2.3 Đánh giá phương pháp 59 4.2.4 Ứng dụng phương pháp TLC – SERS để phân tích mẫu thực 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DAD Hiệp hội nhà hóa học phân tích thức (Association of Official Analytical Chemists) Detector mảng diod (Diode-array detector) ESI Ion hóa tia điện (electrospray ionization) ICH Hội đồng hòa hợp quốc tế (International Council for Harmonisation) AOAC Sắc ký lớp mỏng hiệu cao (High performance thin layer HPTLC chromatography) HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao (High performance liquid chromatography) LOD Giới hạn phát (Limit of detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of quantitation) MS Phổ khối (Mass spectrometry) MS/MS Khối phổ hai lần (tandem mass spectrometry) NMR Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance) PDE – Phosphodiesterase – Quang phổ Raman tăng cường bề mặt (Surface- enhanced Raman SERS spectroscopy) Nhóm cơng tác khoa học phục vụ phân tích thuốc bị thu giữ (Scientific SWGDRUG Working Group for the Analysis of Seized Drugs) TEM Kính hiển vi điện tử truyền qua (Transmission Electron microscopy) TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) TPBVSK Thực phẩm bảo vệ sức khỏe DANH MỤC HÌNH Hình1.1 Biểu đồ tỉ lệ loại thuốc trộn trái phép thực phẩm chức Mỹ Hình1 Sơ đồ biểu diễn chế tác dụng chất ức chế PDE-5 Hình1 Cấu trúc hóa học Sildenafil citrat Hình1 Cấu trúc hóa học tadalafil Hình1 Cấu trúc hóa học vardenafil dihydroclorid 10 Hình1 Sơ đồ nguyên lý SERS 15 Hình Quy trình phân tích mẫu theo phương pháp TLC-SERS 19 Hình Kết khảo sát hệ dung môi pha động 31 Hình Kết khảo sát hệ dung môi pha động 32 Hình 3 Kết phổ UV chất phân tích 33 Hình Sơ đồ xử lý mẫu phân tích 35 Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc HPTLC 36 Hình Sắc ký đồ analog đánh giá tính chọn lọc phương pháp 36 Hình 3.7 Sắc ký đồ analog xác định LOD 41 Hình Sắc kí đồ phân tích mẫu chế phẩm đông dược thị trường 42 Hình3 Kết chồng phổ mẫu dương tính sildenafil 43 Hình 10 Kết chồng phổ UV mẫu âm tính với sildenafil 43 Hình3 11 Kết chồng phổ UV mẫu dương tính với tadalafil 43 Hình3 12 Kết chồng phổ UV mẫu dương tính với vardenafil 44 Hình 13 Hình ảnh đo TEM hỗn dịch keo bạc M5 nước 46 Hình 3.14 Phổ hấp thụ UV – VIS hỗn dịch keo bạc M5 nước 47 Hình 15 Kết khảo sát nồng độ keo bạc 47 Hình 16 Kết khảo sát thể tích nhỏ kheo bạc …………………….…………48 Hình 17 Kết khảo sát vị trí chiếu tia laser 49 Hình 18 Hình ảnh phổ SERS sildenafil methanol nồng độ khác 49 Hình 19 Hình ảnh phổ SERS đánh giá độ chọn lọc 51 Hình 20 Phổ SERS mẫu nghi ngờ có chứa sildenafil…………… ……… 54 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Một số nghiên cứu phát chất ức chế PDE – trộn trái phép chế phẩm đông dược 20 Bảng Kết khảo sát hiệu suất chiết chất phân tích dạng mẫu 33 Bảng Kết đánh giá độ thích hợp hệ thống phương pháp HPTLC 37 Bảng 3 Kết đánh giá khoảng tuyến tính chất phân tích 38 Bảng Kết khảo sát độ đúng, độ xác ngày khác ngày phương pháp 39 Bảng Kết khảo sát LOD, LOQ chất phân tích 41 Bảng3 Kết định lượng chất mẫu thực 44 Bảng Các đỉnh đặc trưng tỷ lệ cường độ SERS đỉnh sildenafil 50 Bảng Kết xác định giới hạn phát sildenafil 52 Bảng Bảng đỉnh đặc trưng tỉ lệ cường độ SERS đỉnh mẫu dương tính sildenafil 53 ĐẶT VẤN ĐỀ Hội thảo Quốc tế chuyên đề "Cập nhật tiến điều trị Rối loạn cương dương" bệnh viện Nam học muộn Hà Nội tổ chức ngày 21/05/2017 đưa số liệu khảo sát thực năm 2017: Có 50% nam giới bị rối loạn cương dương độ tuổi từ 40 - 70 Theo ước tính đến năm 2025, số lượng nam giới mắc rối loạn cương dương cán mốc 320 triệu người Phần lớn nam giới mắc bệnh e ngại, ngại khám, ngại chia sẻ nên thường tự mua thuốc uống Hiện loại thuốc tổng hợp thường dùng để điều trị rối loạn cương dương sildenafil (Viagra), tadalafil (Cialis), vardenafil (Levitra), avanafil (Stendra) Tuy nhiên, từ xa xưa người có thuốc dân gian dùng để điều trị cho đàn ông yếu sinh lý Do thị trường tồn nhiều loại thuốc đông dược thực phẩm chức có nguồn gốc từ dược liệu dùng để điều trị rối loạn cương dương Bên cạnh ưu điểm giá hợp lý, an toàn nguồn gốc từ thiên nhiên, tình trạng chế phẩm đông dược gồm thuốc đông dược, thực phẩm chức bị trộn trái phép thuốc tân dược diễn Việc đe dọa nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng mà ảnh hưởng đến uy tín sở sản xuất đơng dược Bởi vì, việc định loại thuốc để điều trị rối loạn cương dương cho bệnh nhân cần có theo dõi chặt chẽ bác sỹ liều dùng thời gian sử dụng Do đó, nhu cầu cấp thiết đặt phát triển phương pháp nhanh chóng, có tính đặc hiệu cao để sàng lọc chế phẩm đông dược bị trộn lẫn thuốc tổng hợp hoá học Hiện Việt Nam phương pháp phổ biến dùng để phát sildenafil(SIL), tadalafil(TAD), vardenafil(VAR) hợp chất ức chế PDE5 tương tự HPLC – DAD, đặc biệt LC – MS LC – MS/MS [6], có độ đặc hiệu cao, phù hợp với việc phân tích mẫu có thành phần phức tạp chế phẩm đông dược Trong năm gần đây, quang phổ Raman PHỤ LỤC Phụ lục Danh mục mẫu chế phẩm đông dƣợc điều trị hỗ trợ điều trị bệnh lý suy giảm chức sinh lý thị trƣờng ST T Mã SP Tên thuốc Số lô, số đăng ký,hạn dùng, nơi sản xuất Liều dùng Số ĐK: 20648/2015/ATTP-XNCB VNP02 Bổ thận PV (viên nang) Hạn dùng: 13/02/2020 Số lô: 10217 Công ty cổ phần Dược thảo Phúc viên/lần , lần/ ngày Vinh Số ĐK: 6835/2016/ATTP-XNCB Lộc Cường VNP03 Thần (viên nang) Hạn dùn g: 11/01/2020 Số lô: 10117 Công ty CPTM Dược VTYT Khải 1-2 viên /lần /ngày Hà VNP04 Mãnh nam Số ĐK : 25355/2014/ATTP-XNCB (viên nang) Cty TNHH dược phẩm Ngọc Khánh Sâm nhung bổ VNP05 thận TW3 (viên nang) Số ĐK: VD-24304-16 Hạn dùng:12/05/20 Số lô: 3917 Công ty cổ phần Trung ương viên /lân 2-3 viên/ lần, lần/ ngày Số ĐK:4583/2013/ATTP-XNCB VNP07 Khang Dược Số lô: 120119 viên/ lần , (viên nang) Hạn dùng: 12/01/2019 lần/ ngày Cơng ty TNHH Nam Dược Hồn Minh VHP08 Mạng (viên hồn) 10-20 Số ĐK:5618/2009/YT-CNTC viên/lần, Cơng ty TNHH Ngơ Q Thích lần / ngày Số ĐK: 1139/2015/ATTP-XNCB EVA'S Dream VNP09 (viên nang) Hạn dùng:20/9/2019 Số lô: 160902 viên/ lần, ngày/ lần Công ty TNHH SX TM Đại Phúc Nhân rocket 1h 10 VNP10 CP11 VNP12 Số ĐK: 25877/2017/ ATTP-XNCB công ty cổ phần thái dương 1-2 viên /lần /ngày (cao đặc) Nhà thuốc đơng y tâm minh đường thìa cà phê/ lần, lần /ngày sâm nhung cường lực tuệ minh Số ĐK: 8807/2017/ATTP-XNCB viên/lần, ngày lần (viên nang) cao bổ thận tâm minh đường (viên nang) công ty TNHH USAPHA số ĐK: 21949/2015/ATTP-XNCB HEADMAN 11 VNP15 (viên nang) Số lô:161208 Hạn dùng:8/12/2019 viên/ lần, ngày/ lần Công ty TNHH Dược Phẩm Dược Vương Số ĐK: 29505/2015/ATTP-XNCB 12 VNP16 BOSMEN Hạn dùng: 21/12/2018 (viên nang) Số lô: 11215 2-3 viên/ lần, lần/ ngày công ty cổ phần hóa dược việt nam Agot-M 13 VNP18 (viên nang) Sô ĐK: 16450/2017/ATTP-XNCB Viện Nghiên cứu, Đào tạo Tư vấn Khoa học Công nghệ 2-3 viên/ lần, lần/ ngày Số ĐK: 9921/2015/ATTP-XNCB 14 VNP21 Khang Dược Sâm(viên nang) Hạn dùng: 06/2020 viên/ lần , lần/ ngày Cơng ty TNHH Nam Dược 15 VNP22 Xích Thố Vương (viên nang) 16 VHP23 17 VNP24 18 VNP25 Số ĐK: 7546/2012/-YT-CNTC (viên hồn) cơng ty cổ phần thái dương Sevenmaxx Số ĐK: 644/2014/-YT-CNTC (viên nang) Nhập từ mỹ Nam Á Cường Thận Botamen 35+ 19 Công ty VISGERPHARM Rocket (viên nang) VNP30 Số ĐK: 8041/2014/-YT-CNTC (viên nang) Số ĐK:10675/2009/YT-CNTC viên / lần , lần /ngày gói/ lần, lần / ngày viên/ lần, ngày/ lần công ty TNHH TM dược phẩm nam viên/ lần, 1-2 lần/ tuần công ty dược phẩm thương mại phương đông viên/ lần, lần/ngày Hạn dùng: 20/3/2020 Esdogan 20 21 VNP31 VNP32 (Viên nang) Số ĐK: 5569/2015/ATTPXNCBcông ty cổ phần dược phẩm thương mại phương đông Sâm Nhung Bổ Thận Nam Dược Số ĐK: 10889/2016/ATTP-XNCB (viên nang) 22 VNP33 Số lô : 1020317 Ngọc Sâm Bổ Thận HP (viên nang) Công ty TNHH dược phẩm Ích Nhân Số ĐK: 7688/2014/-YT-CNTCcơng ty cổ phần dược liệu vật tư y tế hải phòng 1-2 viên/ lần, lần/ ngày viên/ lần, lần/ ngày 2-3 viên/ lần, lần/ ngày 23 VNP34 Hoạt Lực Bổ Thận (viên nang) 24 VNP35 Sâm Nhung Bổ Thận BV (viên nang) Số ĐK: 10330/2014/ATTPXNCBcông ty cổ phần dược phẩm dược liệu hà nội 2-3 viên/ lần, lần/ ngày Số ĐK: 17760/2017/ATTPXNCBcông ty TNHH dược phẩm hoàng liên 2-3 viên/ lần, lần/ ngày Phụ lục 2.1 Lượng chất/ vết (µg) 1,25 2,5 Sắc kí đồ analog đƣờng tuyến tính Sildenafil Sắc kí đồ analog 2.2 Lượng chất/ vết (µg) 0.3 0,5 0,75 0,9 Sắc kí đồ analog đƣờng tuyến tính tadalafil Sắc kí đồ analog 1,15 1,35 2.3 Lượng chất/ vết (µg) 0.3 0,55 0,75 0,95 Sắc kí đồ analog đƣờng tuyến tính vardenafil Sắc kí đồ analog 1,2 1,35 Phụ lục 3.1 Phương pháp LC-MS/MS: Sildenafil đươc tách cột UltraII C18 (100mm × 2,1 mm; 1,9µm), pha động gồm acid formic 0,1% nước (A) acid formic 0,1% acetonitril (B); tỉ lệ pha động: gradient (0 -7 phút, 30% B; phút, 70% B; 8,5 phút, 30% B; 12 phút, 30% B) thể tích tiêm mẫu µl, tốc độ dòng 0,3 ml/phút, thời gian 12 phút Chất phân tích phát detector MS/MS với nguồn ion hóa ESI (+), mảnh mẹ có m/z 475,2 mảnh 100,3 283,0; tỉ lệ mảnh 100,3 283,0 79,04% ±20%; 20,96% ±20% Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ MS Thông số Giá trị tối ƣu (đơn vị) Điện áp đầu phun 3500V Khí chắn 20psi Nhiệt độ nón 250C Khí ion hóa 40psi Nhiệt độ ion hóa 250C Khí ion hóa 45psi CID gas Ar 1.5mTorr Bảng 0.1 Điều kiện MS chất nghiên cứu Tên chất Ion mẹ (m/z) Ion (m/z) CE (eV) Tỉ lệ (%) Sildenafil 475,2 100,3 24 79,04 283,0 35 20,96 3.2 Sắc ký đồ LC- MS/MS mẫu thực Mẫu VNP03 Mẫu VNP04 Mẫu VNP09 Mẫu VNP10 Mẫu VNP15 Mẫu VNP24 Mẫu VNP25 ... phosphodiesterase -5 trộn trái phép chế phẩm đông dược sắc ký lớp mỏng hiệu cao sắc ký lớp mỏng kết hợp quang phổ Raman tăng cường bề mặt ’ Với mục tiêu : Xây dựng thẩm định quy trình định tính, định lượng... 1.3.2 Sắc ký lớp mỏng hiệu cao 12 1.3.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với quang phổ Raman tăng cường bề mặt 14 1.4 Một số phương pháp định tính, định lượng chất ức chế. .. trộn trái phép chế phẩm đông dược phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu cao; ứng dụng để phân tích số mẫu chế phẩm đông dược thị trường Xây dựng quy trình định tính sildenafil trộn trái phép chế phẩm