Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC MS MS

Trong các nhóm dược chất được nghiên cứu, nhóm thuốc giảm đau chống viêm không steroid và steroid là nhóm thuốc phổ biến hay được phát hiện trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược, t

GIẢM ĐAU CHỐNG VIÊM TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG LC- MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2017

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà

2 DS Thái Khoa Bảo Châu

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Hóa phân tích- Độc chất

2 Viện công nghệ dược phẩm quốc gia

HÀ NỘI 2017

DS Thái Khoa Bảo Châu

đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành đếnPGS.TS.Nguyễn Thị Kiều Anh và Ths.NCS Đào Thị Cẩm Minhngười đã động viên, nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích-Độc chất đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian làm thực nghiệm tại bộ môn.Tôi cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị cán bộ Viện công nghệ dược phẩm quốc gia và Trung tâm giám định ma tuý, Viện khoa học hình sự, Bộ công an đã tạo điều kiện hỗ trợ về thiết bị trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo đại học cùng toàn thể các thầy cô các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, quan tâm và tạo điều kiện giúp đỡ hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày18tháng 5năm 2017

Bùi Thị Thắm

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

2.1 Tổng quan các thuốc trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược 3

2.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu 5

2.2.1 Tổng quan về Paracetamol 5

2.2.2 Tổng quan về indomethacin 5

2.2.3 Tổng quan về piroxicam 6

2.2.4 Tổng quan về ketoprofen 7

2.2.5 Tác dụng và tác dụng không mong muốn của các thuốc thuộc nhóm chống viêm không steriod 7

2.3 Tổng quan các phương pháp định lượng các thuốc giảm đau chống viêm không steroid trộn trái phép trong đông dược 10

2.3.1 Trên thế giới 10

2.3.2 Tại Việt Nam 12

2.4 Tổng quan về sắc kí lỏng khối phổ 13

2.4.1 Sắc kí lỏng hiệu năng cao 13

2.4.2 Sắc kí lỏng khối phổ 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 18

NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 18

2.1.1 Hoá chất- chất chuẩn 18

2.1.2 Thiết bị 19

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Thu thập mẫu 20

2.2.2 Xử lý mẫu 20

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS 20

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng 21

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 22

3.1.1 Khảo sát điều kiện chiết 22

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc kí 25

3.2 Thẩm định quy trình phân tích 34

3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống 34

3.2.2 Độ đặc hiệu 35

3.2.3 Độ đúng 38

3.2.4 Độ lặp lại 39

3.2.5 Khoảng tuyến tính 40

3.2.6 LOD và LOQ 41

3.3 Ứng dụng phương pháp 42

BÀN LUẬN 45

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

ACN : Acetonitril

AOAC : Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thống (Association of Official Analytical Chemists)

AR : Thuốc thử phân tích (Analytical reagent)

ESI : Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

HPTLC : Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao (high performance thin layer chromatography – HPTLC)

LC/MS : Sắc ký lỏng khối phổ (Liquid chromatography – mass spectrometry)

LOD : Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ : Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

m/z : Khối lượng/ điện tích

MeOH : Methanol

PA : Tinh khiết phân tích (Pure analysis)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

TB : Trung bình

TLC : Sắc kí lớp mỏng (thin layer chromatography – TLC)

COX : cyclo-oxygenase

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1 1 Các phương pháp xác định NSAIDs trộn trong đông dược 11

Bảng 2 1 Các hóa chất- chất chuẩn 18

Bảng 2 2 Công thức mẫu trắng 20

Bảng 3 1 Các thông số máy MS 30

Bảng 3 2 Điều kiện chạy LC-MS của 4 chất phân tích 30

Bảng 3 3 Các chương trình pha động được khảo sát 31

Bảng 3 4 Kết quá đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS 35

Bảng 3 5 Kết quả đánh giá độ đúng của phương pháp 38

Bảng 3 6 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp 39

Bảng 3 7 Kết quả xây dựng đường chuẩn 4 chất nghiên cứu 40

Bảng 3 8 LOD và LOQ của 4 chất phân tích 41

Bảng 3 9 Kết quả nồng độ các chất trong các mẫu thử 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS với tứ cực chập ba. 14

Hình 1 2 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI 16

Hình 1 3 Tứ cực gập cong 16

Hình 2 1 Máy sắc kí Bruker EVOQ Qube 19

Hình 3 1 Sắc đồ khảo sát quy trình chiết 24

Hình 3 2 Phương pháp xử lí mẫu theo quy trình 4 25

Hình 3 3 Phổ khối của piroxicam 27

Hình 3 4 Phổ khối của ketoprofen 28

Hình 3 5 Phổ khối của indomethacin 29

Hình 3 6 Phổ khối hai mảnh con 65,1 và 110,1 của paracetamol 29

Hình 3 7 Sắc ký đồ phân tích 4 chất khảo sát thành phần pha động 33

Hình 3 8 Sắc ký đồ phân tích 4 chất khảo sát độ đặc hiệu của phương pháp37 Hình 3 9 Sắc đồ LOD của paracetamol 41

Hình 3 10 Sắc đồ LOQ của ketoprofen 41

Hình 3 11 Sắc đồ dương tính paracetamol mẫu HC08 43

Hình 3 12 Sắc đồ dương tính paracetamol và indomethacin mẫu BN01 43

Hình 3 13 Sắc đồ dương tính mẫu BN51 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các loại thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ đông dược ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thị trường trong nước và trên toàn thế giới Nó là một phần quan trọng của xu hướng thay thế dược phẩm tổng hợp Xu thế này đã khởi đầu từ cách đây 20 năm, như một nghiên cứu của Harvard gần đây đã phát hiện ra rằng một phần ba người được hỏi thừa nhận sử dụng ít nhất một liệu pháp thay thế trong quá khứ, và chi tiêu tại Mỹ cho những biện pháp thay thế này có thể lên tới 13,7 tỷ đô la trong một năm [14] Vì nó là những lựa chọn thay thế hoàn toàn tự nhiên, kinh tế và được người sử dụng tin rằng chúng an toàn hơn các thuốc tân dược Ở Việt Nam, nguồn tài nguyên cây thuốc dồi dào và nền y học cổ truyền lâu đời của nước ta cũng là một trong những yếu tố thuận lợi cho thuốc có nguồn gốc từ thảo dược ngày càng chiếm ưu thế so với các thuốc tân dược Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) có đến 80% của những người sống ở các nước đang phát triển vẫn dựa chủ yếu vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe của họ Ví dụ như dân số sử dụng thuốc đông dược để điều trị ban đầu chiếm 90% dân số của Ethiopia, chiếm 75% dân số của Mali, chiếm 70% ở Myannar, chiếm 70% ở Rawanda, chiếm 60% ở Tanzania, chiếm 60% ở Uganda [16] Vậy nên việc đánh giá mức độ an toàn của các sản phẩm đông dược ngày càng trở nên quan trọng Gần đây, một số báo cáo cho thấy các loại thuốc và thực phẩm chức năng có nguồn gốc đông dược đã được làm giả mạo bằng cách trộn các loại thuốc tổng hợp không được công bố hoặc những chất tương tự được cải biến về cấu trúc của chúng.Việc cố ý trộn lẫnthường xảy ra khi các chất tự nhiên cần thiết đang thiếu hoặc đắt hoặc khi nhà cung cấp dự định tăng cường hiệu quả dược lý cụ thể

Trong các nhóm dược chất được nghiên cứu, nhóm thuốc giảm đau chống viêm không steroid và steroid là nhóm thuốc phổ biến hay được phát hiện trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược, thực phẩm bảo vệ sức khỏe điều trị và hỗ trợ điều trị các bệnh về xương khớp, giải cảm, gut.Tại Singapore, nghiên cứu của Aik-Jiang Lau và cộng sự đã tiến hành phát hiện phenylbutazon, oxyphenylbutazon trộn lẫn trong chếphẩm đông dược bằng sắc ký hai lần khối phổ (LC-MS/MS) [20].Tại

Ấn Độ, nghiên cứu của Savaliya và cộng sự đã tiến hành định tính 25 dược chất gồm cả giảm đau, chống viêm steroid và khôngsteroid bằng LC-MS/TOF và định lượng các chất dương tính gồm diclofenac, dexamethason,piroxicam bằng HPLC[28] Các trường hợp sử dụng các thuốc đông dược điều trị bệnh xương khớp(viêm khớp dạng thấp) làm cho bệnh càng trở nên trầm trọng hơn được phát hiện trộn các thuốc giảm đau chống viêm phenylbutazon, diclofenac, prednisolon và paracetamol [31]

Do đó, hiện nay các nước phát triển khá mạnh các phương pháp định tính, định lượng và phát hiện được rất nhiều các nhóm thuốc tân dược được trộn lẫn trong thuốc đông dược, thực phẩm chức năng như LC-MS/MS, HPTLC, LC-

UV, NMR và LC-NMR[16].Nhưng khi nghiên cứu phát hiện các thuốc tân dược trộn lẫn trong thuốc đông dược thì nền mẫu pha tạp giữa các dược liệucó thành phần rất phức tạp nên chúng tôi chọn phương pháp LC/MS đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu cao để định tính và định lượng

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong thuốc đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc giảm đau chống viêm trộn trái phép trong chế phẩm thuốc đông dược bằng LC-MS/MS”

Với mục tiêu:

1 Xây dựng qui trình định tính, định lượng paracetamol, piroxicam, indomethacin và ketoprofen trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LC/MS

2 Ứng dụng phương pháp LC/MS để xác định paracetamol, piroxicam, indomethacin và ketoprofen trộn lẫn trong các chế phẩm đông dược

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan các thuốc trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược

Mặc dù thuốc đông dược đã sử dụng từ lâu, nhưng người sử dụng có rất ít kiến thức về thành phần, tác dụng dược lý, an toàn hiệu quả của nó Thuốc đông dược được tự do bán trong cửa hàng thực phẩm sức khỏe, trong siêu thị,

và được tiếp thị tràn lan trên các trang mạng Do quy định ít chặt chẽ, có nhiều thuốc thảo dược kém chất lượng và có tình trạng trộn với thuốc tổng hợp (tân dược) không khai báo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Liên minh Châu Âu (EU) ban hành một số hướng dẫn và các hành động liên quan đến an toàn và sử dụng thuốc thảo dược thích hợp.Ở nước ta, nhằm đảm bảo chất lượng dược liệu, chế phẩm đông dược sử dụng trong phòng và điều trị bệnh, Bộ Y tế đã ban hành nhiều văn bản chỉ đạo, thông tư hướng dẫn nhằm tăng cường công tác quản lý chất lượng, đáng chú ý là Thông tư 43/2014/TT- BYT ngày 24 tháng

11 năm 2014 Quy định về quản lý thực phẩm chức năng Đặc biệt, trong năm

2016 Quốc hội đã ban hành Luật Dược 2016 số 105/2016/QH13, trong đó dành riêng chương IV với 8 điều qui định về dược liệu và thuốc cổ truyền sản xuất

và lưu hành tại Việt Nam

Tuy nhiên, trong nhiều năm gần đây có nhiều báo cáo cho thấy tình trạng trộn lẫn các thuốc tân dược trong đông dược ở các nước khá nhiều và đã gây ra nhiều tác dụng phụ nguy hiểm có thể gây tử vong cho người sử dụng.Các nhóm thuốc tân dược trộn lẫn trong đông dược Trung Quốc bao gồm nhóm giảm đau chống viêm steroid và không steroid (paracetamol, diclofenac, indomethacin, aspirin), thuốc chống co giật, thuốc rối loạn chức năng cương dương, thuốc hạ đường huyết được báo cáo tại tìm thấy các nước Hà Lan, Bỉ, New Zealand, Úc, Nhật Bản, Anh, Đài Loan, Mỹ[30]

Chế phẩm đông dược thường phân chia theotác dụng dược lý như nhóm thần kinh cơ; nhóm thuốc chữa các bệnh về Âm, về Huyết; nhómthuốc điều kinh, an thai; nhóm thuốc thanh nhiệt, giải độc, tiêu ban, lợi thuỷ… Khi các nhómthuốc dược chất được trộn trái phép thường có tác dụng dược lý gần

giống tác dụng dược lý củachế phẩm đông dược, gây sự nhầm lẫn tác dụng của chế phẩm với dược chất.Các hoạt chất tân dược được dùng để trộn lẫn bao gồm nhiều nhóm hợp chất khác nhau, trong đó đáng chú ý là: Nhóm hoạt chất tăng cường khả năng sinh lý (sildenafil và dẫn chất sildenafil, tadalafil và homosildenafil) [8],[12], [15],[21], [22], [23], [27] Nhóm phenylbutazon, caffein và oxyphenbutazon [20] Nhóm Corticoid (dexamethason, prednisolon, betamethason…)[13], [28], [34] Nhóm thuốc kháng Histamin (clopheniramin, ) Nhóm thuốc an thần gây ngủ (diazepam) [23] Nhóm thuốc giảm béo (sibutramin, phenolphthalein, N-mono-desmethyl sibutramin) [12], [17], [25], [32] Nhóm thuốc hạ glucose-huyết (metformin, gliclazid, ) [12], [19], [24] Nhóm thuốc hạ huyết áp (nifedipin, amlodipin,propranolon ) [23], [24], [29].Và nhóm lợi tiểu [35]

Trong đó, có các thuốc nhóm giảm đau chống viêm không steroid (diclofenac, ibuprofen, indomethacin, paracetamol, ketoprofen, piroxicam…) được phát hiện trộn trong các thuốc đông dược[18],[23], [28], [33], [34] Do nhóm thuốc có giá thành hợp lí và tác dụng dược lí mạnh nên được trộn nhiều trong chế phẩm đông dược Bên cạch đó nhóm thuốc chống viêm không steroid

có nhiều tác dụng không mong muốn Nênnhóm nghiên cứu lựa chọn 6 chất diclofenac, ibuprofen, indomethacin, paracetamol, ketoprofen, piroxicam để xây dựng phương pháp xác định các chất này trong chế phầm đông dược Trong khuôn khổ luận văn dưới đây sẽ trình bày phương pháp xác định 4 chất paracetamol, piroxicam, ketoprofen và indomethacinđược trộn trong đông dược bằng LC/MS sử dụng ion hóa phun điện tích dương ESI(+)

2.2 Tổng quan về đ

2.2.1 Tổng quan về Paracetamol

- Công thức hóa học: C8

- Khối lượng phân tử: M= 151,2

- Tên khoa học:N-(4- hydroxyphenyl) acetamid

- Tính chất:Bột kết tinh tr

pKa= 9,51 Hơi tan trong nư

cloroform,ether, methylen clorid, d

dịch hòa trong nước có pH kho

- Liều dùng:Liều dùng cho ngư

c có pH khoảng 5,3 -5,6[2], [6]

u dùng cho người lớn và trẻ em trên 11 tuổi, u

650 mg, cứ 4 - 6 giờ một lần, nhưng không quá 4g m

indomethacin

, nóng chảy ở khoảng 170oC,

ớc sôi, rất khó tan

m, ethanol 96% Dung

i, uống hoặc đưa vào

n, nhưng không quá 4g một ngày[2],

- Công thức phân tử: C19

- Khối lượng phân tử: M=

- Tên khoa học: Acid 1 –

nước, tan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol Dung d

dioxan- nước (2:1) có pKa kho

- Liều dùng:Người lớn u

đa 40 mg/ngày) hoặc đ

19H16ClNO4 M= 357,8

–(4-clorobenzoyl)-5-methoxy-2-methylindol

t tinh trắng đến vàng (không bền với ánh sáng)

c tế không tan trong nước, tan trong cloroforaceton Bền trong môi trường trung tính hoặc acid y

m mạnh

C – 162oC

n ứng của nhân indol, nhân thơm và clo hữ0,075 g/ngày, chia 3 lần sau khi ăn hoặc là đặ0,05 g hay 0,1 g vào buổi tối [6]

piroxicam

15H13N3O4S

M= 331,4

-Hydroxyl-2-methyl-N–(pyridine-2-yl)-2H dioxid

t tinh màu vàng nhạt, vị đắng, không mùi Thựtan trong methylen clorid, khó tan trong ethanol Dung d

2:1) có pKa khoảng 6,3.Nhiệt độ nóng chảy khoả

n uống 10-30 mg/ngày, một lần vào bữa ăn

c đặt thuốc đạn 1 viên vào buổi tối trước khi đi ng

methylindol-3-yl acetic

i ánh sáng), không mùi hay hầu

c, tan trong cloroform, hơi tan trong

c acid yếu, phân hủy

Đau cấp: Tiêm bắp ngày 1

vài ngày rồi chuyển sang u

2.2.4 Tổng quan về ketoprofen

- Công thức phân tử: C16

- Khối lượng phân tử: M=

- Tên khoa học: Acid 2-(

- Tính chất: Bột kết tinh tr

tan trong aceton, ethanol, và methylen clorid

- Liều dùng: Vài ngày đ

bữa ăn Sau dùng liều duy trì 150

hai loại COX-1 và COX

p ngày 1 ống(nếu đau quặn thì có thể tiêm 2

n sang uống hoặc nạp đạn [6]

ketoprofen

16H14O3: M= 254,3

(3- benzoylphenyl) propionic[2], [3]

t tinh trắng hoặc gần như trắng, thực tế không tan trong nư

on, ethanol, và methylen clorid [2], [6]

Vài ngày đầu dùng liều tấn công 300 mg, chia làm 3 l

u duy trì 150-200 mg, hoặc nạp ngày 1, 2 viên thu

100 mg

bong gân, viêm gân, hư khớp, ngày bôi 2 lần [6]

ng và tác dụng không mong muốn của các thuốc thu viêm không steriod

ng và cơ chế tác dụng

m đau, hạ sốt, chống viêm: Nhóm thuốc này có tác d

ng viêm ở những mức độ khác nhau Thuốc ức ch) là enzym xúc tác việc sản xuất một số chất trung gian, đ

ất gây ra phản ứng đau, sốt, viêm Có hai dthành dạ dày, thành mạch, thận và COX-2 có ở t

c ức chế COX-2 thì có tác dụng điều trị, thu

1 thì gây ra tác dụng phụ Các thuốc chống viêm không ch

1 và COX-2, bao gồm ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxicam,

tiêm 2 ống) chỉ dùng trong

không tan trong nước, dễ

n công 300 mg, chia làm 3 lần/ngày, uống sau

ngày 1, 2 viên thuốc đạn Liều

c thuộc nhóm chống

c này có tác dụng giảm

c chế cyclo-oxygenase

t trung gian, đặc biệt là

t, viêm Có hai dạng enzym COX

tổ chức viêm hay tổn , thuốc tác dụng lên

ng viêm không chọn lọc ức chế cả

m ibuprofen, indomethacin, naproxen, piroxicam,

diclofenac, ketoprofen Sự khác nhau giữa các thuốc chống viêm không steroid chủ yếu là các biểu hiện của tác dụng không mong muốn Các thuốc có tính chọn lọc ít gây các tác dụng phụ, còn tác dụng chống viêm, giảm đau giống như các thuốc không chọn lọc Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 có thể gây các tác dụng phụ ở thận giống như các thuốc không chọn lọc Ngoài ra các thuốc ức chế chọn lọc không có tác dụng ức chế tiểu cầu kết dính, còn các thuốc ức chế không chọn lọc có tác dụng ức chế kết dính tiểu cầu nhưng có thể hồi phục được, trái với acid acetylsalicylic

Tác dụng hạ nhiệt: Do ức chế trung tâm điều hòa nhiệt ở vùng dưới đồi, gây

giãn mạch ngoại biên, tăng tỏa nhiệt và tăng tiết mồ hôi

Tác dụng giảm đau của nhóm thuốc này chỉ đối với triệu chứng đau nhẹ do viêm như đau đầu, đau răng, đau dây thần kinh, đau khớp, đau cơ [6]

b) Tác dụng không mong muốn

Các tác dụng phụ do ức chế tổng hợp prostaglandin

Rối loạn dạ dày-ruột: Thuốc chống viêm không steroid với mức độ khác nhau ức

chế COX-1 làm giảm tổng hợp prostaglandin ở dạ dày dẫn đến ức chế sản sinh ra chất mucin (yếu tố bảo vệ dạ dày), tạo điều kiện cho HCl và pepsin của dịch vị gây tổn thương cho niêm mạc Ngoài ra các thuốc chống viêm không steroid còn tác động trực tiếp hủy hoại các tế bào biểu mô tiêu hóa, gây thủng ổ loét do phần lớn chúng đều là những acid

Trên hệ tiết niệu: Ức chế prostaglandin ở thận làm giảm tưới máu nuôi thận, giảm

mức lọc cầu thận, giải phóng các renin, ảnh hưởng tới việc di chuyển ion và trao đổi nước, gây nên các rối loạn chức năng tiểu cầu thận, viêm thận mô kẽ, suy thận cấp

Trên hệ huyết học: Tăng nguy cơ chảy máu, kéo dài thời gian đông máu, có thể gây

ra hiện tượng xuất huyết dưới da do ức chế ngưng kết tiểu cầu

Với thai phụ: Dễ gây quái thai ở 3 tháng đầu, ở 3 tháng cuối có thể làm tăng thời

gian mang thai, có thể gây đóng sớm ống động mạch, chảy máu trong tử cung, nguy hiểm cho sản phụ

Với những người bị phù hoặc có xu hướng phù: Như suy tim, suy thận mạn, suy gan

có thể gây tình trạng giữ nước nặng nếu điều trị bằng nhóm thuốc này

Các tác dụng phụ không do ức chế tổng hợp prostaglandin

Trên hệ thần kinh: Có thể gây ù tai, điếc thoáng qua, say thuốc Ngoài ra thuốc có

thể gây dị ứng, gây cơn hen giả vì thuốc ức chế COX nên làm tăng các chất chuyển hóa theo đường lipooxygenase (tăng leucotrien) Rối loạn chức năng gan, rối loạn

về máu theo kiểu nhiễm độc tế bào (mất bạch cầu hạt)

Trên hệ tim mạch: Các thuốc ức chế COX-2 và liều cao các thuốc chống viêm

không steroid truyền thống có nguy cơ gây nhồi máu cơ tim [3]

2.3 Tổng quan các phương pháp định lượng các thuốc giảm đau chống

viêmkhông steroid trộn trái phép trong đông dược

2.3.1 Trên thế giới

Hiện nay có nhiều phương pháp xác định các thuốc trộn trong đông dược như LC-MS/MS, HPTLC, LC-UV, NMR và LC-NMR Các phương pháp phổ biến tiến hành định lượng các thuốc giảm đau chống viêm trộn trong chế phẩm đông dược

tham khảo được tổng hợp trong bảng 1.1

Bảng 1 1 Các phương pháp xác định NSAIDs trộn trong đông dược

Detector: ESI-MS và bước sóng phát hiện 254 nm

Pha động: Đệm 10 mM ammonium formate, pH 3,0 (A): acetonitrile (B)

Toluen: 1% CTAB trong MeOH : n-propanol: acid formic (14:1:3:2)

n-hexane : ethyl acetate : acid acetic (7: 2,5: 0,5)

2.3.2 Tại Việt Nam

Mặc dù các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm steroid đã được quan tâm

từ rất lâu và đã có nhiều nhóm nghiên cứu tại Việt Nam đã tiến hành xây dựng các phương pháp phát hiện các chất giảm đau chống viêm steroid trộn trái phép trong chế phẩm đông dược Các phương pháp đã được xây dựng phát hiện các thuốc này như LC-UV [4], [5], [7], TLC [8] và LC-MS tiêm trực tiếp mẫu vào khối phổ [10] Nhưng các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêm không steroid có rất ít nghiên cứu xây dựng phương pháp phát hiện các chất này trộn trái phép trong chế phẩm đông dược Hơn nữa, số nghiên cứu tiến hành trên các mẫu đông dược là thực phẩm chức năng chưa nhiều chủ yếu tiến hành trên các mẫu đông dược

Chúng tôi chỉ tìm thấy 2 nghiên cứu đã công bố về phát hiện các chất thuộc nhóm giảm đau chống viêmkhông steroid trộn lẫn trong chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng:

Nghiên cứu của Cao Công Khánh đã tiến hành địnhlượng silbutramin, furosemid, piroxicam, dexamethason trong thực phẩm chức năng bằng HPLCtrên các dạng viên nén, nang và lỏng cho thấy có 5 mẫu dương tính sibutramin, không cópiroxicam, dexamethason và furosemid trong 20 mẫu thu thập trên thị trường [7] Năm 2016, nhóm nghiên cứu của chúng tôi tại trường đại học Dược Hà Nội đã thực hiện xây dựngphương pháp phân tích paracetamol, piroxicam, diclofenac, indomethacin trộn lẫn trong chếphẩm đông dược bằng HPTLC với hệ dung môi triển khai n-hexan: ethyl acetat: acid acetic(6:2,5:1,5), phát hiện tại bước sóng 254

nm và quét phổ UV trong khoảng 200 – 700 nm của vếtchất dương tính được tách

ra so với phổ chuẩn và đã xác định 1 mẫu dương tính vớiparacetamol chứa 37,64 mg/liều trong 29 mẫu thu thập trên thị trường [9]

Bên cạnh đó, các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng có mặt trên thị trường trong nước hiện nay rất đa dạng, nhiều thành phần, không được kiểm soát chặt chẽ được bán tràn lan trên mạng, trong siêu thị… nên có nguy cơ cao các sản phẩm này được làm giả gây ra nhiều tác dụng không muốn khi sử dụng cho người dùng

Việc sử dụng HPTLC và LC-UV có nhiều ưu điểm xong bên cạnh đó cũng có những hạn chế nhất định Bên cạnh đó, nhóm nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành xác định một số chất giảm đau chống viêm không steroid trộn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp TLC và HPTLC [9] Trong nghiên cứu sử dụng TLC phát hiện các mẫu dương tính nhưng khi mẫu được đưa vào chồng phổ trong phương pháp HPTLC thì không trùng phổ với phổ chất chuẩn Do vậy khi dùng phương pháp TLC xuất hiện trường hợp dương tính giả Đồng thời, có các mẫu được xác định bằng phương pháp HPTLC không trùng phổ với phổ chất chuẩn nhưng khi đưa vào phân tích bằng phương pháp HPLC có kết quả dương tính Do vậy khi sử dụng phương pháp HPTLC có những trường hợp âm tính giả Từ đó, ta thấy trên một nền mẫu có tính chất rất phức tạp như chế phẩm đông dược, có thể có các thành phần trong nền mẫu không tách hoàn toàn ra khỏi pic chính chất phân tích nên có thể dẫn đến việc đôi khi bị nhầm lẫn trong phân tích định tính và định lượng Bên cạnh đó phương pháp LC/MS có độ nhạy và độ đặc hiệu cao đã được ứng dụng nhiều trên thế giới nhưng chưa được ứng dụng nhiều trong nước ta để phân tích các thuốc giảm đau chống viêm không steroid trong các chế phẩm đông dược Trong đề tài này, phương pháp LC/MS được sử dụng định tính và định lượng các thuốc giảm đau chống viêm không steroid trong chế phẩm đông dược để cải thiện độ nhạy và độ đặc hiệu so với các phương pháp khác, giúp cho kết luận có độ tin cậy cao hơn

b Nguyên tắc

Mẫu phân tích được hòa tan trong dung môi và được cho qua cột bằng một dòng chất lỏng liên tục (pha động) Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di chuyển

qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất tan với pha tĩnh và pha động Nhờ tốc độ di chuyển qua cột khác nhau, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải, làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng [1]

c Cấu tạo máy HPLC

Hình 1 1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS với tứ cực chập ba

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là phương pháp nghiên cứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đó dựa trên

sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong một điện trường hoặc

từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnh hưởng rất lớn đối với chuyển động trong điện trường hay từ trường của ion Nếu biết được điện tích của ion thì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó

Nguồn ion hóa

Tứ cực thứ nhất Buồng va chạm

Tứ cực thứ hai

b Thiết bị khối phổ (Đầu dò khối phổ)

- Bộ nạp mẫu: Chuyển các mẫu cần phân tích vào nguồn ion hoá của thiết bị khối

phổ.Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký

- Bộ nguồn ion hóa: Có nhiệm vụ ion hoá phân tử trung hoà thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phânmảnh phân tử trung hoà thành cácmảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mangnăng lượng cao.Ionphântửvàcácmảnhionlàcácphântửcókhối

lượngtừđóngườitatínhđượcsốkhốiz=m/e(khốilượngion/điệntích)

So với các kĩ thuật ion hóa đòi hỏi áp suất thấp như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục (Continuous Flow- Fast Atom Bombardment CF- FAB) hay tia nhiệt (Thermospray- TS), kĩ thuật ion hóa áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Ionization- API) có ưu điểm hơn Ngoài ra, API ion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc hợp chất cần phân tích nhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Với API có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùy theo yêu cầu phân tích

Có ba kiểu hình thành ion: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI)

Trong đó, kiểu ion hóa phun điện tử (ESI) thực hiện ở áp suất khí quyển Các mẫu thử trong dung dịch được đưa vào nguồn ion qua một ống mao quản mà ở đầu ống này có một điện thế có thể lên đến 3500V Đồng thời, các dung dịch mẫu này được phun sương dưới tác động của một dòng khí Kết quả là tạo ra các hạt mang điện tích và được gia tốc đến điện cực Kỹ thuật này phù hợp cho chất phân cực, không bền với nhiệt và nghiên cứu các phân tử sinh học có khối lượng tới 100 000Da

Hình 1 2 Sơ đồ tạo ion dương bằng nguồn ESI

- Bộ phận phân tích khối (mass analyzer): Sau khi được tạo thành thì các ion sẽđược gia tốc và tách riêng theo tỷ số m/z nhờ tác dụng của điện trường và từ trường để đi đến bộ phận phát hiện

Một số bộ phân tích khối thường dùng: Tứ cực (Quadrupole), Bẫy ion (Ion trap), Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube)

Hình 1 3 Tứ cực gập cong

Trong đó, bộ phân tích khối Tứ cực (Quadrupole): Có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét

sẽ đi thẳng tới detector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực

Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ Tứ cực Q1, Q3 làm nhiệm vụ phân tích

khối, tứ cực Q2 là ngăn để cho các ion va chạm, tạo ra các ion mảnh nhỏ hơn, khí dùng cho va chạm thường là khí argon Kỹ thuật phân tích khối phổ kiểu này được gọi là khối phổ hai lần MS/MS và thường được dùng để khẳng định cấu trúc các chất hữu cơ và phân tích hỗn hợp nhiều thành phần

- Bộ phận phát hiện ion (detector): Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

- Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system): Làmộthệthốngbaogồmhệthốngkếtnốivàthunhậndữliệuthôvà

phầnmềmkiểmsoát,điềukhiểnthiếtbị,quátrìnhphântíchvàtínhtoán,xử

lý,báocáo,kếtxuấtdữliệuthôvừathuđược Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :

 Quét toàn phổ (SCAN):

Khi thao tác với chế độ scan, đầu dò sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích Thường dùng để nhận danh hay phân tích khi chất phân tích có nồng độ đủ lớn Đối với đầu

dò khối phổ ba tứ cực, chế độ Full scan MS thường được lựa chọn để khảo sát ion

mẹ, chế độ Full scan MS/MS quét tất cả các ion con tạo thành thường được sử dụng

để xác định ion con cho tín hiệu ổn định và bền nhất

 SRM (Selected Reaction Monitoring) và MRM (Multiple Reaction Monitoring)

Đối với khối phổ ba tứ cực, là máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS-MS), 2

kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được sử dụng là SRM và MRM

SRM: Cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện MRM: Trên thực tế, do yêu cầu về mặt kỹ thuật đối với phân tích vi lượng nên các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên, do vậy kỹ thuật ghi phổ MRM thông dụng hơn SRM Đầu tiên, cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

16 Nước cất 2 lần Siêu lọc

2.1.2 Thiết bị

- Máy sắc ký lỏng khối phổ BRUKEREVOQ Qube- Mỹ

Hình 2 1 Máy sắc kí Bruker EVOQ Qube

Máy sắc kí khối phổ bao gồm các bộ phận:

- Cân phân tích XPE105 Mettler Toledo (chính xác đến 0,01mg)- Thụy Sĩ

- Cân kĩ thuật XP 320C PRESICA- Thụy Sĩ

- Máy ly tâm HERMLE Z306- Đức

- Máy siêu âm DAIHAN- WUC A22H- Hàn Quốc

- Thiết bị đuổi dung môi bằng khí N2 HANON- Đài Loan

- Máy lắc xoáyVORTEX ZX3- Italy

- Máy soi UV KUBOTA 6500

- Các dụng cụ thủy tinh trong phân tích class A- Đức

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Mẫu trắng: Nền mẫu trắng tự tạo từ các vị dược liệu Thành phần và hàm

lượng các vị dược liệu được xây dựng dựa trên tần suất của các dược liệu trong các bài thuốc dân gian và các chế phẩm đông dược

Bảng 2 2 Công thức mẫu trắng

Dược liệu Khối

lượng (g)

Dược liệu Khối

lượng (g)

Dược liệu Khối

lượng (g)

Độc hoạt 1,2 Tần giao 0,8 Ngưu tất 1,2 Phòng phong 1,2 Đương quy 1,2 Đỗ trọng 1,2 Tang kí sinh 1,0 Đảng sâm 1,2 Quế chi 1,2

Tế tân 0,8 Phục linh 1,2 Sinh địa 1,2 Bạch thược 1,2 Cam thảo 0,6 Phụ tử chế 1,0

Mẫu thử: Một số chế phẩm và thực phẩm chức năng đông dược dạng viên

nang, viên nén, bột, hoàn cứng dùng trong hỗ trợ điều trị các bệnh xương khớp thu thập trên thị trường Việt Nam

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Khảo sát dung môi rửa loại tạp: H2O và ether dầu hỏa

Dung môi chiết: Methanol

2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng bằng LC-MS/MS

Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

a Khảo sát điều kiện khối phổ:

Tiến hành phân tích trên thiết bị có bộ phân tích khối dạng tứ cực chập ba Lựa chọn nguồn ion, thế ion hóa, ion mẹ, điều kiện phân mảnh và các ion con để phân tích được đồng thời 4 chất trong hỗn hợp Khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời 04 chất: paracetamol, piroxicam, ketoprofen, indomethacin

b Khảo sát điều kiện sắc ký:

Khảo sát các điều kiện cột sắc ký, thành phần và tỷ lệ pha động, thể tích tiêm để có thể tách và phát hiện đồng thời 4chấtnghiên cứu, sắc ký đồ sắc nét và thời gian phân tích không quá dài

2.2.4 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng

Tiến hành thẩm định phương pháp trên mẫu tự tạo chứa các chất nghiên cứu với các chỉ tiêu:

- Độ đặc hiệu của phương pháp

- Phần mềm Microsoft Excel để tính toán và xử lý thống kê

- Một số công thức tính các giá trị thống kê:

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Khảo sát điều kiện chiết

Mẫu có nguồn gốc đông dược nên cần phải xử lí mẫu trước khi xác định Theo thống kê cách xử lí mẫu chung thường dùng để xử lí mẫu đông dược tiến hành phương pháp LC/MS đơn giản không có các bước làm sạch tạp dược liệu, chiết hoạt chất với dung môi (methanol, acetonitril) hoặc hỗn hợp dung môi với H2O, sau đó được ly tâm, lọc và pha loãng đối với các dạng viên nang, viên nén, bột Với chế phẩmở dạng lỏng đơn giản chỉ cần pha loãng với dung môi Trước khi chiết các mẫu được nghiền nhỏ và làm đồng nhất [11], [13], [17], [18], [21], [22], [23], [28], [33]

Tiến hành khảo sát các quy trìnhkhác nhau:

Cân8 phần mỗi phần 0,5g dược liệu tương đương 1/2 liều chỉ định ghi trên nhãn sản phẩm Thêm vào mỗi phần 1ml dung dịch chuẩn paracetamol nồng độ 1mg/ml Sau

đó sấy khô và tiến hành theo các quy trình khác nhau dưới đây:

Quy trình 1: Thêm 25ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút, ly tâm

6000vòng/phút trong 10 phút, sau đó lọc lấy dịch

Quy trình 2: Thêm 20ml ether dầu hỏa, lắc xoáy 5 phút, ly tâm 6000

vòng/phút trong 5 phút, sau đó gạn, sấy khô Thêm 25ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút, sau đó lọc lấy lọc dịch

Quy trình 3: Thêm vào 20ml H2O, lắc xoáy 5 phút, ly tâm 6000vòng/phút trong 5 phút, sau đó gạn, sấy khô Thêm 25ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm

10 phút, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút sau đó lọc lấy dịch

Quy trình 4: Thêm 20ml ether dầu hỏa, lắc xoáy 5 phút, ly tâm 6000

vòng/phút trong 5 phút, sau đó gạn, sấy khô Thêm 25ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó lọc lấy dịch lọc cho chảy qua cột silica và thu dịch chảy qua

Quy trình 5: Thêm vào 20ml H2O, lắc xoáy 5 phút, ly tâm 6000vòng/phút trong 5 phút, sau đó gạn, sấy khô Thêm 25ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm

10 phút, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút, sau đó lọc lấy dịch cho chảy qua cột C18 và thu dịch lọc

Quy trình 6: Thêm 25ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút, ly tâm

6000vòng/phút trong 10 phút, sau đó lọc dịch lọc cho chảy qua cột silica giữ 1/2 dịch (6.1), lấy 1/2 dịch còn lại cho chảy chậm qua cột C18 và thu dịch chảy qua (6.2)

Quy trình 7: Thêm 20ml ether dầu hỏa, lắc xoáy 5 phút, ly tâm 6000

vòng/phút trong 5 phút, sau đó gạn, sấy khô Thêm 25 ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút, sau đó lọc dịch lọc cô cạn, hòa tan bằng n-butyl acetat chạy qua cột silica, lấy dịch lọc

Quy trình 8: Thêm 20ml ether dầu hỏa, lắc xoáy 5 phút, ly tâm 6000

vòng/phút trong 5 phút, sau đó gạn, sấy khô Thêm vào 20ml H2O, lắc xoáy 5 phút,

ly tâm 6000vòng/phút trong 5 phút, sau đó gạn, sấy khô Thêm 25ml methanol, lắc xoáy 5 phút, siêu âm 10 phút, ly tâm 6000vòng/phút trong 10 phút,lọclấy dịch lọc Sau đó lấy 2ml dịch mỗi quy trình xử lí, cô nito đến cắn, sau đó thêm 100 µl methanol lắc xoáy đều đem chấm sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi:n-hexan: ethyl acetat: acid acetic( 6: 2,5: 1,5), phát hiện dưới đèn UV 254 nm

Kết quả: Dịch chiết các quy trình xử lí mẫu 1, 2, 4, 6 cho vết paracetamol lên

đậm.Bên cạnh đó thì các dịch chiết được rửa với nướcở các quy trình xử lí mẫu 3, 5,

8 cho vết paracetamol nhưng vết mờ nhạt hơn dịch chiết không được rửa với H2O Mặc dù paracetamol rất ít tan trong nước nhưng khi rửa quá trình lắc xoáy có thể làm nước ấm lên làm tăng độ tan của paracetamol Hơn nữa paracetamol nếu được trộn thì sẽ được trộn ở hàm lượng cao ở ngưỡng tan được trong nước ấm, cho thấy paracetamol bị chuyển một phần vào H2O khi rửa nên không dùng nước để rửa do gây mất mẫu.Dịch chiết cách 7 cho vết rất mờ nhạt, do paracetamol sau khi cô cạn không tan lại được hết vào dung môi n butyl acetat

mẫu theo các quy trình

paracetamol, piroxicam, ketoprofen và indomethacin

chấm sắc kí với hệ dung môi: n

ửa với nước và ether dầu hỏa cũng được thu l

c kí thu được cho thấy dịch rửa với ethernhạt đồng thời có xuất hiện các vết bẩn củnên dùng ether dầu hỏa để rửa loại tạp

: Các quy trình xử lí mẫu 1, 2, 4, 6 không gây mấ

o sát các quy trình xử lí mẫu với chuẩn paracetamol, tiquy trình 1, 2, 4, 6 đồng thời thêm 1ml mỗi dung dparacetamol, piroxicam, ketoprofen và indomethacin có nồng đ

dung môi: n-hexan: ethyl acetat: acid acetic (6: 2,ương pháp đã được nhóm nghiên cứu thẩm đ

: Dịch chiết cách 1; b: paracetamol chuẩn; c: d: dịch chiết cách 4; f: ketoprofen chuẩn; g: d: indomethacin chuẩn; i: dịch chiết cách 6.2

lí mẫu 1, 2, 6.1 cho vết lẫn nhiều tạp dược li

c chảy chậm qua cột C18 nhưng cho vết không squy trình 4 mà chi phí cho cột C18 cao nên dùng cột C18 là không c

c lọc qua cột silicagel cho vết sạch

Hình 3 1 Sắc đồ khảo sát quy trình chiết

c thu lại và đem chấm

i ether dầu hỏa cho vết

a dược liệu cho thấy

ất mẫu nhiều

n paracetamol, tiến hành xử lí

dung dịch 4 chất chuẩn

ng độ 1mg/ml Kết quả hexan: ethyl acetat: acid acetic (6: 2,5: 1,5) như

m định trong giai đoạn

: dịch chiết cách 2; : dịch chiết cách 6.1;

t cách 6.2

c liệu Dịch chiết quy

t không sạch hơn so với

t C18 là không cần thiết.Quy

t

Đồng thời dịch chiết các quy trình trên được pha loãng và tiến hành phân tích bằng LC/MS để tính hiệu suất chiết Kết quả cho thấy hiệu suất của các quy trình trên với mỗi chất đều lớn hơn 85%

Kết luận: Do mẫu chạy LC/MS cần được xử lí tương đối sạch trước khi được

tiêm vào hệ thống nên chúng tôi chọnquy trình xử lí mẫu 4 cho mẫu sạch và hiệu suất phù hợp

Hình 3 2 Phương pháp xử lí mẫu theo quy trình 4

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện sắc kí

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc (4000 ng/ml): Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất paracetamol, piroxicam, ketoprofen và indomethacin cho vào các bình định mức 10ml, hòa tan bằng dung môi methanol: H2O (50: 50 ) thu được dung dịch chuẩn mỗi chất nồng độ 1 mg/ml Tiến hành pha loãng thành các dung dịch có nồng

độ 4000 ng/ml

Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (1000 ng/ml): Trộn 4 dung dịch chuẩn gốc đơn trên với thể tích bằng nhau tạo thành dung dịch hỗn hợp nồng độ 1000 ng/ml

a Điều kiện khối phổ

Để xác định các thuốc tân dược trộn trong thuốc đông dược bằng MS/MS cần phải xác định được ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) Với kỹ thuật ion hóa ESI, chế độ ion dương, các ion phân tử thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+, một số trường hợp thêm hai proton [M-2H]++ Sau đó, cần phải xác định được các ion con tạo thành từ ion mẹ trên

LC-để định tính và định lượng

Từ các dung dịch chu

chuẩn nồng độ 2000 ng/ml ti

ch chuẩn gốc đơn 4000 ng/ml, pha loãng thành các dung d

2000 ng/ml tiến hành khảo sát ở chế độ scan và product ion

Hình 3 3 Phổ khối của piroxicam a) Phổ khối MS/MS với mảnh mẹ 332,1 b) Phổ khối MS/MS với 2 mảnh con 95,0 và 120,9

ãng thành các dung dịch scan và product ion

332,1

nh con 95,0 và 120,9