Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định vi khuẩn bacillus laterosporus trong chế phẩm sinh học

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC” HÀ NỘI - 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC” Sinh viên thực : ĐỖ THỦY NGUYÊN Lớp : K64CNSHA MSV : 642333 Giảng viên hƣớng dẫn : TS NINH THỊ THẢO Bộ mơn : CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT HÀ NỘI - 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thực thời gian từ 07/2022 – 12/2022 dƣới hƣớng dẫn TS Ninh Thị Thảo, giảng viên Bộ môn Công nghệ sinh học Thực Vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tất số liệu kết nghiên cứu khóa luận trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình nghiên cứu nƣớc Các tài liệu trích dẫn đƣợc rõ nguồn đƣợc nêu mục tài liệu tham khảo Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023 Sinh viên Đỗ Thủy Nguyên i LỜI CẢM ƠN Lời xin cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đội ngũ giảng viên, cán giảng dạy công tác Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tôi vô biết ơn thầy, cô khoa Công nghệ sinh học, đặc biệt Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật giảng dạy, hƣớng dẫn tạo điều kiện để tơi hồn thành chƣơng trình học, thực tập nghề nghiệp khố luận tốt nghiệp Tơi xin bày tỏ kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Ninh Thị Thảo định hƣớng nghiên cứu, tận tình dạy, giúp đỡ, hỗ trợ tơi suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Thứ hai, tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS Đinh Trƣờng Sơn, cô ThS Phạm Thị Thu Hằng thầy cô khác công tác môn Công nghệ sinh học Thực vật giúp đỡ tơi thời gian thực khố luận Cuối muốn gửi lời cảm ơn đến Bố, Mẹ, gia đình bạn bè thực khố luận môn Công nghệ sinh học Thực vật khuyến khích, động viên, hỗ trợ, tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khố luận tốt nghiệp Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng 02 năm 2023 Sinh viên Đỗ Thủy Nguyên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC HÌNH VII DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VIII TÓM TẮT IX PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus laterosporus 2.2 Lịch sử phát 2.3 Thể ký sinh (parasporal body) 2.4 Đặc tính đối kháng 2.5 Các đặc tính cơng dụng khác 12 2.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Bacillus laterosporus 12 2.7 Các phƣơng pháp nghiên cứu xác định Bacillus laterosporus 14 2.8 Giới thiệu chế phẩm sinh học “Kaito Nano Hữu Cơ” 16 PHẦN ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 18 3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 18 3.1.3 Dụng cụ thiết bị nghiên cứu 19 iii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.1.4 Hóa chất 20 3.2 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.2.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ chế phẩm sinh học 21 3.2.2 Phƣơng pháp làm thuần, giữ giống 23 3.2.3 Nội dung 2: Đánh giá đặc điểm hình thái đặc điểm hóa sinh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định 24 3.2.4 Nội dung : Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus tuyển chọn phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA PCR với mồi đặc hiệu 28 3.2.5 Phần mềm xử lý số liệu 31 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Kết phân lập vi khuẩn 34 4.1.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ pha loãng mẫu ban đầu đến kết phân lập vi khuẩn 34 4.1.2 Ảnh hƣởng nồng độ pha loãng mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 36 4.1.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ xử lý mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 37 4.1.4 Ảnh hƣởng thời gian xử lý mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 39 4.2 Khảo sát đặc điểm sinh học phản ứng hóa sinh chủng vi khuẩn tuyển chọn 41 4.2.1 Đánh giá đặc điểm hình thái mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định 41 4.2.2 Phân tích đặc tính hóa sinh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định 46 4.3 Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 57 iv Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 4.3.1 Kết tách chiết DNA 57 4.3.3 Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phƣơng pháp phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 61 4.5 Tính tốn tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus chế phẩm sinh học 62 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 5.1 Kết luận 64 5.2 Kiến nghị 64 TAI LIỆU THAM KHẢO 65 v Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến phát triển vi khuẩn sau 20h nuôi cấy 34 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng độ pha loãng mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 20h nuôi cấy 36 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng độ nhiệt độ xử lý mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 20h nuôi cấy 38 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng độ thời gian xử lý mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 20h nuôi cấy 40 Bảng 4.5 Đặc điểm hình thái tế bào 20 mẫu phân lập 43 Bảng 4.6 Đặc điểm hóa sinh 20 mẫu vi khuẩn phân lập 55 Bảng 4.7 Mật độ khuẩn lạc Bacillus laterosporus chế phẩm sinh học 63 vi Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Ảnh nhuộm Gram tế bào Bacillus laterosporus dƣới kính hiển vi (https://microbiology-micro.blogspot.com/2011/07/brevibacilluslaterosporus.html) Hình 2.2 Hình thái khuẩn lạc Bacillus laterosporus (https://microbiologymicro.blogspot.com/2011/07/brevibacillus-laterosporus.html) Hình 2.3 Túi bào tử vi khuẩn Bacillus laterosporus SW: thành túi bào tử; Sp: bào tử; SC: vách bào tử; CSPB: thể ký sinh hình xuồng (Ruiu cs., 2013) Hình 3.1 Sản phẩm Kaito Nano Hữu Cơ 18 Hình 4.2 Kết nhuộm Gram tế bào mẫu vi khuẩn phân lập “ T10” đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi 42 Hình 4.3 Hình thái khuẩn lạc mẫu vi khuẩn phân lập 43 Hình 4.4 Kết thử nghiệm phản ứng MR 47 Hình 4.5 Kết thứ nghiệm phản ứng VP 48 Hình 4.6 Kết khả biến dƣỡng citrate 20 mẫu phân lập 50 Hình 4.7 Hoạt tính sinh enzyme protease mẫu vi khuẩn tuyển chọn 52 Hình 4.8 Kết xác định hoạt tính enzyme amylase 54 Hình 4.9 DNA tổng số chủng tuyển chọn 57 Hình 4.10 Sản phẩm PCR với mồi 27F 1492R 58 Hình 4.12 Kết so sánh trình tự cơng cụ BLAST NCBI 60 Hình 4.13 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen cpbB 61 vii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt CSPB CT DNA Diễn giải chữ viết tắt Canoe-Shaped Parasporal Body Công thức Deoxyribonucleic acid ĐC Đối chứng LB Luria Bertani Broth ml Milliliter mg Milligram MR Methyl Red RNA Ribonucleic acid TCVN VP PCR µg µl Tiêu chuẩn Việt Nam Voges-Proskauer Polymerase chain reaction Microgram Microliter viii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 15 T15 + + - + + 16 T16 - - - + + 17 T17 + - + + + 18 T18 + - - + + 19 T19 - - - + + 20 T20 + + - + + Ghi chú: (-) : phản ứng âm tính khơng có khả (+) : phản ứng dƣơng tính có khả Theo mô tả Nivetha Halka (2017), Ghazanchyan cs (2018) đặc điểm hình thái hố sinh vi khuẩn Bacillus laterosporus bao gồm hình thành khuẩn lạc có dạng hình trịn, phẳng, nhẵn (trơn), màu trắng màu be với rìa hình thoi có kết âm tính với phản ứng MR-VP, khơng có khả biến dƣỡng citrate, có khả sinh enzyme ngoại bào nhƣ protease amylase Đối chiếu đặc điểm hình thái hố sinh 20 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định nghiên cứu này, mẫu vi khuẩn T7, T10, T12, T16, T19 có đặc điểm tƣơng đƣơng đồng với mô tả Nivetha Halka (2017), Ghazanchyan cs (2018) Do vậy, nhận định mẫu T7, T10, T12, T16, T19 vi khuẩn Bacillus laterosporus dựa mô tả đặc điểm hình thái sinh hố 56 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 4.3 Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 4.3.1 Kết tách chiết DNA DNA tổng số mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập T7, T10, T12, T16, T19 đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Masoomi-Aladizgeh cs (2016) có cải tiến, sau DNA đƣợc hồ tan 50 μl nƣớc cất vô trùng DNA tổng số sau tách chiết đƣợc điện di gel agarose để kiểm tra độ tinh tính ngun vẹn (Hình 4.9) Kết cho thấy gel agarose ghi nhận băng vạch mẫu vi khuẩn Điều cho thấy trình tách DNA mẫu vi khuẩn thành công, DNA tổng số nguyên vẹn không đứt gãy, đạt tiêu chuẩn để sử dụng làm khn phản ứng PCR Hình 4.8 DNA tổng số mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus tuyển chọn 57 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 4.3.2 Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA 16S rRNA vùng mã hóa RNA ribosome đƣợc xác định đoạn gen đƣợc bảo tồn tất tế bào Đây vùng linh họat, thay đổi trình tự nucleotide vùng đƣợc ứng dụng nhiều khảo sát di truyền dòng vi khuẩn Trong mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập, lựa chọn mẫu vi khuẩn (T10) để kiểm tra có mặt đoạn gen 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F 1492R phƣơng pháp PCR (Hình 4.10) Hình 4.9 Sản phẩm PCR nhân đoạn 16S rRNA từ mẫu vi khuẩn T10 Ghi chú: Đối chứng trắng sản phẩm PCR sử dụng nƣớc cất thay cho DNA khuôn; Ladder kb Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA đƣợc gửi xác định trình tự Trình tự đoạn gen 16S rRNA sau đƣợc BLAST NCBI cho thấy trình tự 16S rRNA chủng T10 có tỷ lệ tƣơng đồng với vi khuẩn Bacillus laterosporus 90,80% Bacillus sp 99% Trình tự 16S rRNA tìm thấy nhiều lồi vi khuẩn khác trình tự đoạn gen sinh vật có khoảng cách di truyền xa tìm thấy có giống Do chúng tơi nhận thấy việc sử dụng trình tự 16S rRNA khơng thể định danh đƣợc đến loài Bacillus 58 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an laterosporus mức độ tƣơng đồng lồi chi Bacillus cao Hình 4.11 Trình tự 16S rRNA mẫu vi khuẩn T10 59 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.12 Kết so sánh trình tự 16S rRNA mẫu vi khuẩn T10 công cụ BLAST NCBI 60 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 4.3.3 Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phƣơng pháp phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu Để xác nhận mẫu vi khuẩn phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus cấp độ phân tử, xác định diện gen đặc trƣng cho vi khuẩn Bacillus laterosporus gen cpbB mã hóa cho protein phức hợp SC-CSPB có trọng lƣợng phân tử khoảng 14 kDa phƣơng pháp PCR DNA tổng số mẫu vi khuẩn T10, T12, T16, T19 có kết đánh giá đặc điểm hình thái đặc điểm hóa sinh đƣợc cho giống đặc tính Bacillus laterosporus theo mô tả Ghazanchyan cs (2018), Nivetha Halka (2017) đƣợc sử dụng làm khuôn phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen cpbB Hình 4.13 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen cpbB Ghi chú: Đối chứng trắng phản ứng PCR không bổ sung DNA; đối chứng âm phản ứng PCR sử dụng DNA tổng số vi khuẩn Bacillus thuringiensis; T10, T12, T16 T19: phản ứng PCR sử dụng DNA tổng số tách chiết từ mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus T10, T12, T16 T19; Ladder 100bp 61 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Kết cho thấy sản phẩm PCR đối chứng trắng không cho vạch băng, nhiên đối chứng âm sử dụng DNA vi khuẩn Bacillus thuringiensis làm khuôn xuất vạch băng khoảng 50 bp vạch băng xuất giếng có DNA mẫu vi khuẩn phân lập Đây vạch băng primer dimer Ở giếng có chứa sản phẩm PCR sử dụng DNA khuôn mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus T10, T12, T16 T19, cho thấy vạch băng đặc hiệu với kích thƣớc khoảng 600bp Trong vạch băng khơng xuất sản phẩm PCR sử dụng DNA vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Đối chứng âm, hình 4.12) Bacillus thuringiensis loại vi khuẩn có khoảng cách di truyền gần với vi khuẩn Bacillus laterosporus Kết phân tích trình tự 16S rRNA mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus T10 nghiên cứu cho thấy mức độ tƣơng đồng đến 98,93% với vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Hình 4.11) Có thể khẳng định gen cpbB đặc hiệu cho vi khuẩn Bacillus laterosporus hồn tồn sử dụng phƣơng pháp PCR nhân gen để định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus Nhƣ vậy, dựa kết để xác định mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus đặc điểm hình thái, đặc điểm hóa sinh phân tích diện gen đặc trƣng vi khuẩn Bacillus laterosporus phƣơng pháp PCR khẳng định mẫu vi khuẩn phân lập T7, T10, T12, T16 T19 vi khuẩn Bacillus laterosporus 4.5 Tính tốn tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus chế phẩm sinh học Tổng số N vi khuẩn Bacillus laterosporus đƣợc nhận dạng có mẫu thử đƣợc tính theo cơng thức (TCVN 8736:2011): Trong đó: 62 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an ƩC tổng khuẩn lạc đếm đƣợc tất đĩa đƣợc giữ lại từ nồng độ pha lỗng liên tiếp; V thể tích mẫu cấy đĩa, tính mililit (ml); n1 số đĩa có nồng độ pha lỗng thứ nhất; n2 số đĩa có nồng độ pha lỗng thứ hai; d hệ số pha loãng tƣơng ứng với độ pha lỗng thứ Làm trịn số kết có đƣợc, giữ lại số có nghĩa Ở chúng tơi tính số khuẩn lạc dựa tỉ lệ 1:19 với nồng độ pha loãng tỉ lệ 10-7 10-8, kết đƣợc làm tròn đến số nguyên gần Kết đƣợc thể bảng 4.7 Bảng 4.7 Mật độ khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus laterosporus chế phẩm sinh học Công thức Tổng số Số khuẩn lạc vi Thể tích thí nghiệm khuẩn lạc khuẩn Bacillus mẫu nuôi laterosporus cấy Đĩa 1:19 10-7 108 10-8 43 Đĩa 121 51 N(CFU/g) đĩa (ml) Đĩa Đĩa 20 23 0,1 0,1 2,7 × 109 Kết cho thấy mật độ khuẩn lạc trung bình chế phẩm sinh học khoảng 2,7 × 109 Theo nhƣ nhà sản xuất cơng bố in bao bì, mật độ khuẩn lạc trung bình vi khuẩn Bacillus laterosporus tối thiểu 2,5 tỉ bào tử/gram Kết nghiên cứu cho thấy, tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus chế phẩm sinh học phù hợp với thông tin nhà sản xuất 63 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Chúng đề xuất sử dụng phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus từ chế phẩm sinh học nhƣ sau: Hòa tan mẫu NaCl 0,85% theo tỷ lệ 1:9/1:19/1:29/1:39 (w/v), xử lý mẫu 70-90℃ 5-7 phút ni cấy 100µl độ pha lỗng 10-7 môi trƣờng LB - 20 mẫu vi khuẩn phân lập đƣợc lựa chọn để đánh giá đặc điểm hình thái hố sinh Kết cho thấy, mẫu vi khuẩn bao gồm T7, T10, T12, T16, T19 có đặc điểm hình thái sinh hóa giống nhƣ mô tả Ghazanchyan cs (2018), Nivetha Halka (2017) vi khuẩn Bacillus laterosporus, bao gồm: khuẩn lạc tròn, màu be trắng, viền ria, nhẵn, phẳng, tế bào Gram dƣơng, hình que, kết âm tính với phản ứng MR-VP, khơng có khả biến dƣỡng citrate có khả sinh enzyme ngoại bào protease amylase - Phân tích PCR sử dụng cặp mồi nhân gen cpbB cho thấy mức độ đặc hiệu cao với loài vi khuẩn Bacillus laterosporus, điều chứng tỏ sử dụng gen cpbB làm dấu hiệu nhận diện vi khuẩn Bacillus laterosporus mức độ phân tử 5.2 Kiến nghị - Các phƣơng pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus thí nghiệm hóa sinh cần đƣợc nghiên cứu thêm - Cần nghiên cứu thêm gen đặc hiệu cho vi khuẩn Bacillus laterosporus - Cần đóng góp phát triển phƣơng pháp phát định lƣợng Bacillus laterosporus chế phẩm sinh học khác có chứa Bacillus laterosporus Việt Nam 64 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Alippi, A.M and Reynaldi, F.J (2006) Inhibition of the growth of Paenibacillus larvae, the causal agent of American foulbrood of honeybees, by selected strains of aerobic spore-forming bacteria isolated from apiarian sources J Invertebr Pathol 91: 141-146 Anitha K.K., Raja Kumar K.N., and Narasimha R.C.H (2014) Adverse effects of chemical fertilizers and pesticides on human health and environment, Journal of Chemical and Pharmaceutical Sciences (2014) 150-151 Aoyagi, T., Yoshida, S., Matsuda, N., Ikeda, T., Hamada, M and Takeuchi, T (1991) Leuhistin, a new inhibitor of aminopeptidase M, produced by Bacillus laterosporus BMI156±14F1 I Taxonomy, production, isolation, physicochemical properties and biological activities J Antibiot, 44: 573-578 Barsby, T., Kelly, M.T and Andersen, R.J (2002) Tupuseleiamides and basiliskamides, new acyldipeptides and antifungal polyketides produced in culture by a Bacillus laterosporus isolate obtained from a tropical marine habitat J Nat Prod, 65: 1447-1451 Brogden, K.A (2005) Antimicrobial peptides: Pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? Nat Rev Microbiol, 3: 238-250 Chandel, S., Allan, E.J and Woodward, S (2010) Biological control of Fusarium oxysporum f.sp lycopersici on tomato by Brevibacillus brevis J Phytopathol, 158: 470-478 Danielsson J., Reva O.and Meijer J (2007) Protection of oilseed rape (Brassica napus) toward fungal athogens by strains of plant - associated Bacillus amyloliquefaciens, Microbial Ecology, 54 (1): 134-140 Desjardine, K.; Pereira, A., Wright, H., Matainaho, T., Kelly, M and Andersen, R.J (2007) Tauramamide, a lipopeptide antibiotic produced in culture by 65 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Brevibacillus laterosporus isolated from a marine habitat: Structure elucidation and synthesis J Nat Prod, 70: 1850-1853 Djukic, M., Poehlein, A., Thürmer, A and Daniel, R (2011) Genome sequence of Brevibacillus laterosporus LMG 15441, a pathogen of invertebrates J Bacteriol, 193: 5535-5536 10.Fan B., Carvalhais L.C., Becker A., Fedoseyenko D., Von Wirén N and Borriss R (2012) Transcriptomic profiling of Bacillus amyloliquefaciens FZB42 in response to maize root exudate, BMC Microbiology, 12: 116 11.Fitz-James, P.C and Young, I.E (1958) Morphological and chemical studies of the spores and parasporal bodies of Bacillus laterosporus J Biophys Biochem Cytol, 4: 639-649 12.Ghazanchyan, N L., Kinosyan, M H., Tadevosyan, P E., Khachaturyan, N S., and Afrikian, E G (2018) Brevibacillus laterosporus as perspective source of new bioinsecticides Annals of Agrarian Science, 16(4), 413–415 13.Gomare, S.S and Govindwar, S.P (2009) Brevibacillus laterosporus MTCC 2298: A potential azo dye degrader J Appl Microbiol, 106: 993-1004 14.Gupta R., Beg Q.K and Lorenz P (2002) Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, 59 (1): 15-32 15.Hannay, C.L (1957) The parasporal body of Bacillus laterosporus Laubach J Biophys Biochem Cytol, 3: 1001-1010 16.Holail, H., Al-Bahadly, A and Olama, Z (2011) Detoxification of hexavalent chromium Cr(VI) by Bacillus laterosporus and its application in Lebanese waste water WIT Trans Ecol Environ, 153: 233-242 17.Hong, H.A., Duc, L.H and Cutting, S.M The use of bacterial spore formers as probiotics FEMS Microbiol, 29: 813-835 66 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 18.Houpikian P and Raoult D (2002) Traditional and molecular techniques for the study of emerging bacterial diseases: one laboratory's perspective Emerg Infect Dis, 8(2):122-131 19.Idris, H.A., Labuschagne, N and Korsten, L (2008) Suppression of Pythium ultimum root rot of sorghum by rhizobacterial isolates from Ethiopia and South Africa Biol Contr, 45: 72-84 20.Jeyaseelan, A., Sivashanmugam, K and Jayaraman, K (2008) Comparative applications of bioreactor and shake flask system for the biodegradation of tannin and biotreatment of composite tannery effluents Pollut, 27: 371-375 21.Kamika, I and Momba, M.N.B (2011) Comparing the tolerance limits of selected bacterial and protozoan species to nickel in wastewater systems Sci Total Environ, 410-411, 172-181 22.Kamiyama, T., Umino, T., Nakamura, Y., Itezono, Y., Sawairi, S., Satoh, T and Yokose, K (1994) Bacithrocins A, B and C, novel thrombin inhibitors J Antibiot, 47: 959-968 23.Kuznetsova, N.I., Azizbekyan, R.R., Konyukhov, I.V., Pogosyan, S.I and Rubin, A.B (2008) Inhibition of photosynthesis in cyanobacteria and plankton algae by the bacterium Brevibacillus laterosporus metabolites Dokl Biochem Biophys, 421: 181-184 24.Lim, J.G and Park, D.H (2001) Degradation of polyvinyl alcohol by Brevibacillus laterosporus: Metabolic pathway of polyvinyl alcohol to acetate J Microbiol Biotechnol, 11: 928-933 25.Li, X., Wang, Z., Dong, X., Wang, G and Jia, Y (2011) Bioactivity quantification of a novel antimicrobial peptide by agar diffusion bioassay In Proceedings of the 2011 International Conference on New Technology of Agricultural Engineering, 5943979:1096-1099 67 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 26.Masoomi-Aladizgeh, F., Jabbari, L., Nekouei, R K., Aalami, A (2016) A Simple and Rapid System for DNA and RNA Isolation from Diverse Plants Using Handmade Kit 27.Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Đƣờng, Hồng Hải Vũ Thị Hồn, (2007) Giáo trình Sinh học đất Nhà xuất Giáo Dục, trang 133-137 28.Nivetha L and Halka Jayachandran (2017) Isolation and identification of Brevibacillus lactosporum from soil and evaluation of their antibiotic properties International Journal of Advanced Research in Biological Sciences, 4(6): 93-98 29.Oliveira E.J., Rabinovitch L., Monnerat R.G., Passos L.K and Zahner V (2004) Molecular characterization of Brevibacillus laterosporus and its potential use in biological control Appl Environ Microbiol, 70(11): 6657-64 30.Porubcan, R.S (2003) Administering Bacillus laterosporus to increase poultry feed conversion and weight gain U.S Patent, 29: 624 31.Prasanna, L., Eijsink, V.G.H., Meadow, R and Gaseidnes, S (2013) A novel strain of Brevibacillus laterosporus produces chitinases that contribute to its biocontrol potential Appl Microbiol Biotechnol, 97: 1601-1611 32.Qin, C., Xu, C., Zhang, R., Niu, W and Shang, X (2010) On-resin cyclization and antimicrobial activity of Laterocidin and its analogues Tetrahedron Lett, 51: 1257-1261 33.Reda, A.B and Ashraf, T.A.H (2010) Optimization of bacterial biodegradation of toluene and phenol under different nutritional and environmental conditions J Appl Sci, 6: 1086-1095 34.Ruiu, L (2013) Brevibacillus laterosporus, a Pathogen of Invertebrates and a Broad-Spectrum Antimicrobial Species, 4: 476-492 35.Ruiu, L., Satta, A and Floris, I (2013) Emerging entomopathogenic bacteria for insect pest management Bull Insectology, 66: 181-186 68 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 36.Ruiu, L., Floris, I., Satta, A., and Ellar, D J (2016) Toxicity of a Brevibacillus laterosporus strain lacking parasporal crystals against Musca domestica and Aedes aegypti Biological Control, 43(1) : 136–143 37.Saikia, R., Gogoi, D.K., Mazumder, S., Yadav, A., Sarma, R.K., Bora, T.C and Gogoi, B.K (2011) Brevibacillus laterosporus strain BPM3, a potential biocontrol agent isolated from a natural hot water spring of Assam, India Microbiol, 166: 216±225 38.Singh D., Sharma A and Saini G K (2013) Biochemical and molecular characterisation of the bacterial endophytes from native sugarcane varieties of Himalayan region Biotech 3(3): 205-212 39.Singh, P.K., Chittpurna, Ashish, Sharma, V., Patil, P.B and Korpole, S (2012) Identification, purification and characterization of laterosporulin, a novel bacteriocin produced by Brevibacillus sp strain GI-9 PLoS One, 7: 31498 40.Sharma, V., Singh, P.K., Midha, S., Ranjan, M., Korpole, S and Patil, P.B (2012) Genome sequence of Brevibacillus laterosporus strain GI-9 J Bacteriol, 194: 1279 41.Shoji, J., Sakazaki, R., Wakisaka, Y., Koizumi, K and Mayama, M (1976) Isolation of a new antibiotic, laterosporamine (Studies on antibiotics from the genus Bacillus XIII) J Antibiot, 29: 390-393 42.Song, Z., Liu, K., Lu, C., Yu, J., Ju, R and Liu, X (2011) Isolation and characterization of a potential biocontrol Brevibacillus laterosporus Afr J Microbiol, 5: 2675-2681 43.Umezawa, K and Takeuchi, T (1987) Spergualin: A new antitumour antibiotic Biomed Pharmacother, 41: 227-232 44.Wen, J., XiangHu, H., ChangLing, L and JiaHui, Z (2013) Research on algicidal effect of bioactive metabolites of Brevibacillus laterosporus on Oscillattoria sp in shrimp pond J Fish Chin, 37: 465-472 69 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn