Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định vi khuẩn bacillus laterosporus trong phân bón hữu cơ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS TRONG PHÂN BÓN HỮU CƠ” HÀ NỘI – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC -*** KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS LATEROSPORUS TRONG PHÂN BÓN HỮU CƠ” Sinh viên thực : VŨ THỊ NHƢ QUỲNH Lớp : K64CNSHA MSV : 642422 Giảng viên hƣớng dẫn : TS NINH THỊ THẢO Bộ mơn : CƠNG NGHỆ THỰC VẬT Hà Nội -2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu khoa học: “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định vi khuẩn bacillus laterosporus phân bón hữu cơ” tơi thực từ 6/2022 đến tháng 12/2022 hướng dẫn TS Ninh Thị Thảo – Giảng viên Bộ môn Công nghệ thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam Số liệu kết nghiên cứu đề tài hoàn toàn trung thực, chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khoa học nước quốc tế Các tài liệu tham khảo trích dẫn rõ ràng Mọi giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên thực Vũ Thị Nhƣ Quỳnh i LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực tập Bộ môn Công nghệ Thực vật – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, anh chị, bạn bè phịng thí nghiệm mơn, nỗ lực, cố gắng thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến TS Ninh Thị Thảo, Giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tinh thần, cung cấp tài liệu, thông tin khoa học cần thiết, liên quan đến đề tài cho Thứ hai, xin gửi lời cảm ơn đến thầy TS Đinh Trường Sơn, cô ThS Phạm Thị Thu Hằng thầy cô môn CNSH Thực vật giúp đỡ cung cấp kiến thức khoa học hữu ích thời gian thực khóa luận Tơi muốn cảm ơn người bạn đồng hành phịng thí nghiệm tơi hỗ trợ đáng kể họ Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn vô hạn tới công sinh thành, dưỡng dục bố mẹ Cảm ơn gia đình người bạn thân bên, tiếp thêm động lực, nguồn cổ vũ lớn lao cho suốt thời gian qua Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên thực Vũ Thị Nhƣ Quỳnh ii C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii TÓM TẮT ix PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bacillus laterosporus 2.1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus laterosporus 2.1.2 Lịch sử phát 2.1.3 Đặc điểm hình thái 2.2 Thể ký sinh (parasporal body) 2.1.5 Khả kháng khuẩn 2.1.6 Khả gây bệnh cho động vật không xương sống 2.1.7 Các công dụng khác 2.2 Phương pháp nghiên cứu để định danh vi khuẩn 2.2.1 Phương pháp truyền thống 2.2.2 Phương pháp đại PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 10 3.1 Vật liệu 10 3.2 Thời gian địa điểm nguyên cứu 10 iii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 3.3 Vật liệu thí nghiệm 10 3.3.1 Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm 10 3.3.2 Hóa chất 11 3.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 12 3.4.1 Nội dung 1: Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu 12 3.4.2 Phương pháp làm thuần, giữ giống 14 3.4.3 Nội dung 2: Đánh giá đặc điểm hình thái sinh hóa mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập từ phân bón hữu 15 3.4.4 Nội dung 3: Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus phương pháp xác định trình tự 16S rRNA phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 18 PHẦN : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus laterosporus từ phân bón hữu 21 4.1.1 Ảnh hưởng nồng độ pha loãng mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 21 4.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết phân lập vi khuẩn 23 4.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ xử lý mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 26 4.1.4 Ảnh hưởng thời gian xử lý mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 30 4.2 Đánh giá hình thái sinh hóa mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định phân lập từ phân bón hữu 31 4.2.1 Lựa chọn mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định 31 4.2.2 Đánh giá đặc điểm hình thái mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định 32 4.2.3 Phân tích đặc tính hóa sinh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định 34 4.2.4 Tổng hợp kết khảo sát đặc điểm hóa sinh 40 4.3 Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 42 4.3.1 Kết tách chiết DNA 42 4.3.2 Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phương pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA 43 iv Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 4.3.3 Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 45 4.4 Tính tốn tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus phân bón hữu 47 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 5.1 Kết luận 49 5.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 v Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 11 Bảng 4.1: Ảnh hưởng nồng độ pha loãng mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 20h nuôi cấy 21 Bảng 4.2: Ảnh hưởng tỷ lệ lấy mẫu đến phát triển vi khuẩn 23 Bảng 4.3: Ảnh hưởng nhiệt độ xử lý mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 20h nuôi cấy 27 Bảng 4.4: Ảnh hưởng thời gian xử lý mẫu đến phát triển 30 Bảng 4.5: Danh sách 20 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định sử dụng để đánh giá đặc điểm hình thái hóa sinh 32 Bảng 4.6: Đặc điểm hình thái tế bào 20 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định 33 Bảng 4.7:Đặc điểm hóa sinh 20 khuẩn lạc tuyển chọn 41 Bảng 4.8: Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trưng phân bón hữu 48 vi Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1: (A): Ảnh nhuộm Gram, (B): Hình thái vi khuẩn Bacillus laterosporus, (C): Hình thái khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus laterosporus Hình 2.2: Túi bào tử SW vi khuẩn Bacillus laterosporus, túi bào tử; sp:- bào tử; SC:- áo bào tử; CSPB:- thể parasporal hình xuồng Hình 4.1: Hình thái khuẩn lạc mẫu vi khuẩn phân lập môi trường LB 33 Hình 4.2: Kết nhuộm Gram khuẩn lạc Q2 34 Hình 4.3: Kết thử nghiệm phản ứng MR 35 Hình 4.4: Kết thử nghiệm phản ứng VP 36 Hình 4.5: Kết thử nghiệm khả biến dưỡng citrate 37 Hình 4.6: Kết thử nghiệm khả sinh enzyme protease 38 Hình 4.7: Kết thử nghiệm khả sinh enzyme amylase 40 Hình 4.8: DNA tổng số mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus 43 Hình 4.9: Kết sản phẩm PCR mồi 16S 44 Hình 4.10: Kết so sánh trình tự 16S rRNA mẫu vi khuẩn Q11 công cụ BLAST NCBI 45 Hình 4.11: PCR mồi đặc hiệu 46 vii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Diễn giải chữ viết tắt CSPB Canoe-Shaped Parasporal Body CT Công thức DNA Deoxyribonucleic acid ĐC Đối chứng LB Luria Bertani Broth MR Methyl red RNA Ribonucleic acid PCR Polymerase chain reaction TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam 10 VP Voges – Proskauer viii Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.7: Kết thử nghiệm khả sinh enzyme amylase Kết hình 4.7 cho thấy, tổng số 20 mẫu vi khuẩn có 10 mẫu bao gồm Q1, Q2, Q4, Q6, Q10, Q11, Q13, Q14, Q15, Q16 hình thành vịng vơ khuẩn, chứng tỏ mẫu có khả tổng hợp enzyme amylase Tuy nhiên, khả sinh tổng hợp enzyme amylase mẫu vi khuẩn khác nhau, thể qua kích thước đường kính vịng vơ khuẩn khác Các mẫu Q6, Q13, Q14, Q15, Q16 tạo vịng vơ khuẩn lớn, mẫu Q1, Q2, Q4, Q10, Q11 tạo vịng vơ khuẩn bé 10 mẫu vi khuẩn gồm Q3, Q5, Q7, Q8, Q9, Q12, Q17, Q18, Q19, Q20 khơng hình thành vịng vơ khuẩn mơi trường ni cấy, chứng tỏ mẫu khơng có khả sinh enzyme amylase 4.2.4 Tổng hợp kết khảo sát đặc điểm hóa sinh Sau kiểm tra phản ứng hóa sinh 20 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập giả định theo mô tả (Nivetha & cs., 2017) với thí nghiệm phản ứng MP-VP, khả biến dưỡng citrate, khả sinh enzyme protease amylase, đặc điểm hoá sinh 20 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosprorus phân lập giả định tổng hợp bảng 4.7 40 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 4.7:Đặc điểm hóa sinh 20 mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus giả định tuyển chọn Tên Phản ứng Phản ứng Khả Khả Khả chủng MR VP biến sinh protease sinh amylase dƣỡng citrate Q1 - - - - + Q2 - - - + + Q3 + - + + - Q4 + + + + + Q5 - - - + - Q6 - - - + + Q7 - - - - - Q8 + - - - - Q9 + + - - - Q10 - - + - + Q11 - - - + + Q12 + - + + - Q13 - - + + + Q14 + + - + + Q15 + - - + + Q16 + - - + + Q17 + - - - - Q18 - - + - - Q19 + + - + - Q20 + - + - - Ghi chú: (+): phản ứng dương tính có khả (-): phản ứng âm tính khơng có khả 41 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Theo nghiên cứu Nivetha & cs (2017), vi khuẩn Bacillus laterosporus âm tính với phản ứng MR, âm tính với phản ứng VP, khơng có khả biến dưỡng citrate, có khả sinh enzyme protease amylase Từ kết bảng 4.7, có mẫu vi khuẩn bao gồm Q2, Q6, Q11 mang đặc điểm hóa sinh mơ tả Nivetha & cs (2017) vi khuẩn Bacillus laterosporus Từ kết bảng 4.6 bảng 4.7, kết hợp đặc điểm hình thái hóa sinh, kết luận mẫu vi khuẩn Q2, Q6, Q11 vi khuẩn Bacillus laterosporus 4.3 Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phƣơng pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 4.3.1 Kết tách chiết DNA DNA tổng số mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập Q2, Q6, Q11 tách chiết theo phương pháp Aalami & cs (2016) DNA tổng số sau tách chiết điện di để kiểm tra độ tinh tính nguyên vẹn DNA μl DNA trộn với μl loading dye điện di gel agarose 1% đệm TAE điện 80V 45 phút Kết cho thấy gel agarose ghi nhận băng vạch mẫu vi khuẩn, vạch băng sáng rõ nét, chứng tỏ DNA tổng số nguyên vẹn không đứt gãy, đạt tiêu chuẩn để sử dụng làm khuôn phản ứng PCR 42 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.8: DNA tổng số mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus tuyển chọn 4.3.2 Định danh mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide 16S rRNA Giải trình tự nucleotide gen 16S rRNA kĩ thuật sinh học phân tử sử dụng phổ biến để xác định loài vi sinh vật (Patel, 2001) Để xác định danh pháp đến mức loài mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập, đoạn gen 16S rRNA khuếch đại phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu (27F 1492R) theo quy định nêu phần phương pháp nghiên cứu Sản phẩm PCR sau kiểm tra gel agarose 1% Trong mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus phân lập, lựa chọn mẫu vi khuẩn (Q11) để xác định trình tự 16S rRNA 43 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.9: Sản phẩm PCR nhân đoạn 16S rRNA từ mẫu vi khuẩn Q11 Chú thích: Đối chứng trắng sản phẩm PCR sử dụng nước cất thay cho DNA khuôn; Ladder kb 16S rRNA chủng vi khuẩn sau tách chiết dùng cho phản ứng PCR khuếch đại trình tự gen 16S rRNA cặp mồi 27F 1492R 16S rRNA vùng mã hóa RNA ribosome xác định đoạn gen bảo tồn tất tế bào Đây vùng linh hoạt, thay đổi trình tự nucleotide vùng ứng dụng nhiều khảo sát di truyền dòng vi khuẩn Kết cho thấy xuất vạch băng sáng rõ nét, so với ladder 1kb, băng sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1500 bp, phù hợp với kích thước tính tốn lý thuyết Vì vậy, kết luận khuếch đại thành công đoạn gen 16S rRNA Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA gửi xác định trình tự Dựa sở liệu NCBI, trình tự 16S rRNA mẫu vi khuẩn Q11 tương đồng với loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus mức độ cao, ví dụ 97% với vi khuẩn Bacillus subtilis, 98% với vi khuẩn Bacillus inaquosorum Do gen RNA ribosome 16S có mặt nhiều chủng vi khuẩn khác với mức độ tương đồng cao, cách xác định giải trình tự 16S rRNA khơng định danh đến loài Bacillus laterosporus 44 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Hình 4.10: Kết so sánh trình tự 16S rRNA mẫu vi khuẩn Q11 công cụ BLAST NCBI 4.3.3 Định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus phƣơng pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu Do kết giải trình tự 16S rRNA khơng định danh đến lồi để xác nhận chủng phân lập Bacillus laterosporus cấp độ phân tử, xác định diện gen đặc trưng cho vi khuẩn Bacillus 45 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an laterosporus gen cpbB mã hóa cho protein phức hợp SC-CSPB có trọng lượng phân tử khoảng 14 kDa (Chelliah & cs., 2019) Phương pháp PCR sử dụng để nhân gen cpbB sử dụng cặp mồi đặc hiệu với DNA tổng số DNA mẫu vi khuẩn Q2, Q6, Q11 Hình 4.11: Sản phẩm PCR sử dụng mồi đặc hiệu nhân gen cpbB Chú thích: Đối chứng trắng phản ứng PCR khơng bổ sung DNA; đối chứng âm phản ứng PCR sử dụng DNA tổng số vi khuẩn Bacillus thuringiensis; Q2, Q6 Q11: phản ứng PCR sử dụng DNA tổng số tách chiết từ mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus Q2, Q6 Q11; Ladder 100 bp Từ hình 4.11, cho thấy sản phẩm PCR đối chứng trắng không cho vạch băng Kết PCR đối chứng âm sử dụng DNA vi khuẩn Bacillus thuringiensis làm khuôn xuất vạch băng khoảng 50bp vạch băng xuất giếng có DNA mẫu vi khuẩn phân lập Đây vạch băng primer dimer Tuy nhiên, kết PCR mẫu vi khuẩn Q2, Q6 Q11 với mồi cho vạch băng rõ ràng, sắc nét có kích thước khoảng 600bp, phù hợp với kích thước lý thuyết Trong vạch băng khơng xuất sản phẩm PCR sử dụng DNA vi khuẩn Bacillus thuringiensis (đối chứng âm, hình 4.11) Bacillus thuringiensis loại vi khuẩn có khoảng cách di truyền gần với vi khuẩn Bacillus laterosporus Kết phân tích trình tự 16S rRNA mẫu vi khuẩn Bacillus laterosporus Q11 nghiên cứu cho thấy mức 46 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an độ tương đồng đến 98% với vi khuẩn Bacillus thuringiensis Như vậy, khẳng định gen cpbB đặc hiệu cho vi khuẩn Bacillus laterosporus hồn tồn sử dụng phương pháp PCR nhân gen để định danh vi khuẩn Bacillus laterosporus Như vậy, dựa kết để xác định chủng vi khuẩn Bacillus laterosporus đặc điểm hình thái, đặc điểm hóa sinh phân tích diện gen đặc trưng cpbB vi khuẩn Bacillus laterosporus phương pháp PCR khẳng định chủng vi khuẩn phân lập Q2, Q6, Q11 vi khuẩn Bacillus laterosporus 4.4 Tính tốn tổng số vi khuẩn Bacillus laterosporus phân bón hữu Tổng số N vi khuẩn Bacillus laterosporus nhận dạng có mẫu thử tính theo cơng thức (TCVN 8736:20110): Trong đó: C tổng khuẩn lạc đếm tất đĩa từ nồng độ pha loãng liên tiếp; V thể tích mẫu cấy đĩa, tính mililit (ml); d hệ số pha lỗng tương ứng với độ pha lỗng thứ Làm trịn số kết có được, giữ lại số có nghĩa Ở đây, chúng tơi tính số khuẩn lạc dựa tỉ lệ 1:9 với nồng độ pha loãng tỉ lệ 10-7, 10-8, kết làm tròn đến số nguyên gần Kết thể bảng 4.8 47 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Bảng 4.8: Mật độ khuẩn lạc Bacillus laterosporus phân bón hữu Cơng thức thí nghiệm 1:9 Tổng số khuẩn lạc Số khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus laterosporus Đĩa Đĩa Đĩa Đĩa 10-7 73 89 16 19 Thể tích mẫu ni cấy vào đĩa (ml) 0,1 10-8 38 43 0,1 N (CFU/g) 2,1 × 109 Kết bảng 4.8 cho thấy mật độ khuẩn lạc trung bình phân bón hữu “Nấm đối kháng Trichoderma” khoảng 2,1x109 Mật độ tất khuẩn lạc phân bón 10x109 Cho thấy lượng khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus laterosporus sản phẩm phù hợp với công bố nhà sản xuất 48 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Các phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus phân bón hữu sau: Hịa tan mẫu dung dịch NaCl 0,85% theo tỷ lệ 1:9/1:19/1:29 (w/v); xử lý mẫu 80-90℃ 3-10 phút nuôi cấy 100µl độ pha lỗng 10-6, 10-7, 10-8 mơi trường LB kết đĩa nuôi cấy phù hợp với tiêu chuẩn TCVN 6404:2016 - 20 mẫu vi khuẩn phân lập lựa chọn để đánh giá đặc điểm hình thái hố sinh Kết cho thấy mẫu vi khuẩn bao gồm Q2, Q6, Q11 có đặc điểm hình thái sinh hóa giống mơ tả Nivetha & cs (2017), Ghazanchyan & cs (2018) vi khuẩn Bacillus laterosporus khuẩn lạc dạng hình trịn, màu be trắng, viền ria, nhẵn, phẳng, tế bào Gram dương, tế bào có dạng hình que, kết âm tính với phản ứng MR-VP, khơng có khả biến dưỡng citrate có khả sinh enzyme ngoại bào protease amylase - Trình tự gen 16S rRNA mẫu vi khuẩn Q11 có kích thước phân tử khoảng 1500bp kết giải trình tự 16S rRNA cho thấy mức độ tương đồng cao mẫu vi khuẩn Q11 với loài vi khuẩn chi Bacillus Do đó, việc sử dụng trình tự 16S rRNA khơng thể định danh đến lồi Bacillus laterosporus mức độ tương đồng loài Bacillus cao - Phân tích PCR sử dụng cặp mồi nhân gen cpbB cho thấy mức độ đặc hiệu cao với lồi vi khuẩn Bacillus laterosporus, sử dụng gen cpbB làm dấu hiệu nhận diện vi khuẩn Bacillus laterosporus mức độ phân tử 5.2 Kiến nghị - Nghiên cứu thêm để tìm mơi trường đặc hiệu để xác định xác vi khuẩn Bacillus laterosporus - Các phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus laterosporus thí nghiệm hóa sinh cần nghiên cứu thêm - Cần đóng góp phát triển phương pháp phát định lượng Bacillus laterosporus phân bón hữu khác có chứa Bacillus laterosporus Việt Nam 49 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng (2010) Vi sinh vật học NXB Giáo dục Việt Nam Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Đường, Hồng Hải Vũ Thị Hồn, 2007 Giáo trình Sinh học đất Nhà xuất Giáo Dục, trang 133-137 Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6404:2016 (ISO 7218:2007-1:2013) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8736:2011 thuốc thú y - Phương pháp định lượng tổng số bào tử Bacillus Võ Thị Thứ (1996) Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn Bacillus Adegunloye, D.V.; Adetuyi, F.C.; Akinyosoye, F.A.; Doyeni, M.O (2007) Microbial analysis of compost using cowdung as booster Pak J Nutr (2007), 6, 506- 510 Balouiri M., Sadiki M & Ibnsouda S K (2016) Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Journal of pharmaceutical analysis 6(2): 71-79 Barbieri, G., Ferrari, C., Mamberti, S., Gabrieli, P., Castelli, M., Sassera, D., Ursino, E., Scoffone, V C., Radaelli, G., Clementi, E., Sacchi, L., Ferrari, E., Gasperi, G., & Albertini, A M (2021) Identification of a Novel Brevibacillus laterosporus Strain With Insecticidal Activity Against Aedes albopictus Larvae Frontiers in Microbiology, 12(February 2021), 1–12 Djukic, M.; Poehlein, A.; Thürmer, A.; Daniel, R (2011) Genome sequence of Brevibacillus laterosporus LMG 15441, a pathogen of invertebrates J Bacteriol , 193, 5535±5536 10.Ghazanchyan, N L., Kinosyan, M H., Tadevosyan, P E., Khachaturyan, N S., & Afrikian, E G (2018) Brevibacillus laterosporus as perspective source of new bioinsecticides Annals of Agrarian Science,16(4), 415 50 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 11.Hannay, C.L (1957) The parasporal body of Bacillus laterosporus Laubach J Biophys Biochem Cytol, 3: 1001-1010 12.Hayet, S., Sujan, K M., Mustari, A., & Miah, M A (2021) Hematobiochemical profile of turkey birds selected from Sherpur district of Bangladesh Int J Adv Res Biol Sci, 8(6), 1–5 13.Hong, H.A.; Duc, L.H.; Cutting, S.M (2005), The use of bacterial spore formers as probiotics FEMS Microbiol Rev: 29, 813±835 14.Houpikian P Raoult D (2002) Traditional and Molecular Techniques for the Study of Emerging Bacterial Diseases: One Laboratory‟s Perspective Dis 8(2): 122–31 15.Iurlina, M.O.; Fritz, R (2005) Characterization of microorganisms in Argentinean honeys from different sources Int J Food Microbiol 105, 297-304 16.Janda, J Michael Sharon L Abbott.(2007) Trình tự gen 16S rRNA để xác định vi khuẩn phịng thí nghiệm chẩn đoán: Plus, hiểm họa cạm bẫy Tạp chí Vi sinh lâm sàng, Hiệp hội Vi sinh học Hoa Kỳ 17.Järvinen AK, Laakso S, Piiparinen P, Aittakorpi A, Lindfors M, Huopaniemi L, et al (2009) Xác định nhanh mầm bệnh vi khuẩn xét nghiệm dựa PCR microarray Vi sinh BMC 9:161 18.Khan, M.R.; Saha, M.L.; Afroz, H (2001) Microorganisms associated with gemstones Bangladesh J.Bot 30, 93-96 19.Marche MG, Mura ME, Falchi G, Ruiu L (2017) Spore surface proteins of Brevibacillus laterosporus are involved in insect pathogenesis Sci Rep Mar 3;7:43805 20.Miljkovic, M., Jovanovic, S., O‟Connor, P M., Mirkovic, N., Jovcic, B., Filipic, B., Dinic, M., Studholme, D J., Fira, D., Cotter, P D., & Kojic, M (2019) Brevibacillus laterosporus strains BGSP7, BGSP9 and BGSP11 isolated from silage produce broad spectrum multi- antimicrobials PloS One, 14(5) 51 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 21.Nivetha L and Halka Jayachandran (2017) Isolation and identification of Brevibacillus lactosporum from soil and evaluation of their antibiotic properties International Journal of Advanced Research in Biological Sciences, 4(6): 93-98 22.Oliveira E.J., Rabinovitch L., Monnerat R.G., Passos L.K and Zahner V (2004) Molecular characterization of Brevibacillus laterosporus and its potential use in biological control Appl Environ Microbiol, 70(11): 6657-64 23.Patel, J B., 2001 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory Molecular diagnosis, (4): 313321 24.Porubcan, R.S (2003) Administering Bacillus laterosporus to increase poultry feed conversion and weight gain U.S Patent, 29: 624 25.R K; Aalami, Masoomi-Aladizgeh, F; Jabbari, L; Nekouei (2016) A Simple and Rapid System for DNA and RNA Isolation from Diverse Plants Using Handmade Kit February 2016 26.Raymundo, A.K.; Capistrano, B.G.; Aquino, A (1997) Isolation, characterization and identification of bacteria from lahar Philipp Agric Sci., 80, 57-64 27.Ren ZZ, Zheng Y, Sun M, Liu JZ, Wang YJ (2007); Purification and properties of an antimicrobial substance from marine Brevibacillus laterosporus Lh-1 Acta microbiologica Sinica 47:997–1001 28.Román-Blanco, C.; Sanz-Gómez, J.J.; López-Díaz, T.- M.; Otero, A.; García-López, M.-L (1999) Numbers and species of Bacillus during the manufacture and ripening of Castellano cheese Milchwissenschaft 54, 385-388 29.Román-Blanco, C.; Sanz-Gómez, J.J.; López-Díaz, T.- M.; Otero, A.; García-López, M.-L (1999) Numbers and species of Bacillus during the manufacture and ripening of Castellano cheese Milchwissenschaft 54, 385-388 52 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an 30.Roy, D.K.; Singh, G.P.; Sahay, A.; Sahay, D.N.; (2006) Suryanarayana, N Leaf surface microflora fortasar crop improvement Indian Silk 45, 19-21 31.Roy, D.K.; Singh, G.P.; Sahay, A.; Sahay, D.N.; Suryanarayana, N (2006) Leaf surface microflora for tasar crop improvement Indian Silk 45, 19±21 32.Ruiu, L, Floris, I., Satta, A., & Ellar, D J (2007) Toxicity of a Brevibacillus laterosporus strain lacking parasporal crystals against Musca domestica and Aedes aegypti Biological Control, 43(1), 136– 143 33.Ruiu, L (2013) Brevibacillus laterosporus, a Pathogen of Invertebrates and a Broad-Spectrum Antimicrobial Species (2013) Insects 2013, 4, 476-492; 34.Saikia, R., Gogoi, D.K., Mazumder, S., Yadav, A., Sarma, R.K., Bora, T.C and Gogoi, B.K (2011) Brevibacillus laterosporus strain BPM3, a potential biocontrol agent isolated from a natural hot water spring of Assam, India Microbiol, 166: 216±225 35.Saminathan, D & J S Narayanan, 2015 Isolation & classical identification of potent extracellular alkaline protease producing alkalophilic Bacillus spp from coastal regions of Tamil Nadu African Journal of Microbiology Research, (12): 847-854 36.Sarkar, P.K.; Hasenack, B.; Nout, M.J.R (2002) Diversity and functionality of Bacillus and related genera isolated from spontaneously fermented soybeans (Indian Kinema) and locust beans (African Soumbala) Int J Food Microbiol., 77, 175- 186 37.Sharma, A.; Rao, C.L.S.N.; Ball, B.K.; Hasija, S.K (1996)Characteristics of extracellular proteases produced by Bacillus laterosporus and Flavobacterium sp isolated from gelatin-factory effluents World J Microbiol Biotechnol 12, 615-617 53 Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn C.vT.Bg.Jy.Lj.Tai lieu Luan vT.Bg.Jy.Lj van Luan an.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an.Tai lieu Luan van Luan an Do an Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhd.vT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.LjvT.Bg.Jy.Lj.dtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn.Stt.010.Mssv.BKD002ac.email.ninhddtt@edu.gmail.com.vn.bkc19134.hmu.edu.vn