Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định đồng thời salbutamol ractopamine và clenbuterol trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu năng hai lần khối phổ

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số (2016) 1-6 Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định đồng thời Salbutamol, Ractopamine Clenbuterol thức ăn chăn nuôi kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu hai lần khối phổ Nguyễn Thị Hà1, Nguyễn Văn Lượng1, Đỗ Khắc Hải2, Lê Thị Quỳnh1, Nguyễn Kiều Hưng2,* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Cục Cảnh sát Phòng, chống Tội phạm Môi trường, Bộ Công an Nhận ngày 25 tháng năm 2016 Chỉnh sửa ngày 28 tháng năm 2016; Chấp nhận đăng ngày 12 tháng năm 2016 Tóm tắt: Bài báo giới thiệu phương pháp xác định đồng thời salbutamol, ractopamine clenbuterol sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu khối phổ hai lần (UPLC/MS/MS) đạt độ nhạy độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh Mẫu chiết dung dịch đệm K2HPO4, làm mẫu qua cột pha rắn SCX định lượng UPLC/MS/MS Khẳng định chất nghiên cứu ion đặc trưng, phương pháp phê duyệt theo định 657/2002/EC Cộng đồng chung Châu Âu, đáp ứng yêu cầu Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT ngày 15/02/2016 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn quy định kiểm tra, giám sát xử lý vi phạm chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist chăn ni Từ khóa: Salbutamol, ractopamine, clenbuterol; UPLC/MS/MS; TACN truyền thông quan tâm Đây chất dùng để chữa bệnh cho người, cấm sử dụng thực phẩm Mặc dù bị cấm người dân sử dụng rộng rãi Việt Nam, dạng pha trực tiếp vào thức ăn cho gia súc trộn lẫn với thực phẩm chế biến Khi ăn thực phẩm có chất này, bị chóng mặt, ù tai, nhịp tim nhanh, mệt mỏi, lâu dài có nguy mắc bệnh ung thư, ảnh hưởng tới nòi giống, gây hệ lụy nặng nề cho tương lai sau Việc nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định nhóm beta-agonist thức ăn chăn ni nhiều tác giả thực [1-4] Mỗi phương pháp nghiên cứu mà tác giả đưa Đặt vấn đề∗ Trong thời gian qua, tình trạng vi phạm pháp luật sản xuất, kinh doanh, lạm dụng kháng sinh, sử dụng chất cấm chăn nuôi gia súc, gia cầm diễn biến phức tạp, có chiều hướng gia tăng diện rộng địa phương, vấn đề nan giải thách thức quan quản lý Đặc biệt, việc sử dụng chất cấm nhóm beta - agonist (salbutamol, clenbuterol, ractopamine) gây xúc dư luận, người dân, quan quản lý, phương tiện _ ∗ Tác giả liên hệ ĐT.: 84-904271277 Email: hungnk@vnu.edu.vn N.T Hà nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số (2016) 1-6 dựa kỹ thuật khác Bài báo gới thiệu phương pháp xác định đồng thời salbutamol, ractopamine clenbuterol sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu khối phổ hai lần (UPLC/MS/MS) đạt độ nhạy độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh Mẫu chiết dung dịch đệm K2HPO4, làm mẫu qua cột pha rắn SCX định lượng UPLC/MS/MS Khẳng định chất nghiên cứu ion đặc trưng, phương pháp phê duyệt theo định 657/2002/EC Cộng đồng chung Châu Âu [5], đáp ứng yêu cầu Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT ngày 15/02/2016 Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn quy định kiểm tra, giám sát xử lý vi phạm chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist chăn ni chuẩn gốc hỗn hợp có nồng độ 400ng/ml pha metanol, bảo quản -200C, sử dụng tháng Dung dịch chuẩn làm việc pha từ chuẩn gốc hồn hợp nồng độ 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 10ng/ml metanol nước với 0,1% axit focmic, pha trước sử dụng Pha động A metanol, pha động B nước với 0,1% axit focmic 2.2 Thiết bị: Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ UPLC-MS/MS (Waters, Mỹ), gồm phận bơm, tiêm mẫu tự động, điều nhiệt cột, khử khí, ghép nối khối phổ Waters Acquity TQ Detector phần mềm xử lý Masslynx 4.1 Cột sắc ký Acquity UPLC(R)BEH C18 2.1x100mm, 1,7µm, (Waters, Mỹ) Chương trình pha động bắt đầu 95%B, giữ 1,3 phút, giảm xuống 65%B 7,3 phút kết thúc điều kiện ban đầu, tổng thời gian chạy phút, tốc độ dịng 0,3ml/phút, thể tích tiêm 10µl Nhiệt độ cột 30oC Chế độ phân tích đa kênh MRM, kiểu ion hóa dương, nhiệt độ nguồn 150oC, nhiệt độ khử dung mơi 350oC, dịng khử khí 600L/Hr Điện mao quản 0,5kV, điện cone 25V, áp suất chân không 3,8.e-3mbar Thời gian lưu salbutamol, ractopamine clenbuterol 4,23; 5,99 6,34 phút (Hình 1) Năng lượng phân mảnh ion đặc trưng trình bày Bảng Thực nghiệm 2.1 Hoá chất: Acetonitril, metanol (MeOH), K2HPO4, focmic axit loại dùng cho HPLC (Merck, Đức); NH4OH loại dùng cho phân tích (Trung Quốc); Nước tinh khiết dùng cho HPLC (Merck, Đức); Chuẩn salbutamol sulfate 99% (Dr.Ehrenstorfer GmbH, Đức); ractopamine hydrochloride 99,8% (Dr.Ehrenstorfer GmbH, Đức); Clenbuterol hydrochloride 99,8% (Dr.Ehrenstorfer GmbH, Đức) Dung dịch 20_1_16_STD_5ppb MRM of 11 Channels ES+ TIC 1.27e6 5.98 100 % 4.21 6.34 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 Time Hình Sắc đồ chuẩn hỗn hợp salbutamol, ractopamine clenbuterol nồng độ 5µg/l N.T Hà nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số (2016) 1-6 Bảng Năng lượng phân mảnh hỗn hợp salbutamol, ractopamine clenbuterol Tên chất ion sơ cấp (m/z) Salbutamol 240,03 Clenbuterol 276,96 Ractopamine 302,03 ion thứ cấp (m/z) 120,81 130,05 147,95 165,98 131,87 167,75 202,89 106,94 120,93 135,97 164,02 Thời gian Dwell (s) 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 0,025 Điện Cone (V) 24 24 24 24 22 22 22 26 26 26 26 Năng lượng Cone (eV) 36 32 24 16 40 34 16 36 24 28 20 Chi chú: ion gạch chân ion dùng để định lượng 6.168e+005 100 m/z 276.97 -> 202.89 5.919e+006 16 100 % % 2.0 17.6 33.2 48.8 64.4 80.0 Collision Energy / eV 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 Hình Collision Energy Optimization (m/z 276,97 -> 202,89) 2.3 Quy trình xử lý mẫu: Cân xác 1,0g phần mẫu thử đồng cho vào ống ly tâm 50ml Thêm xác 10ml KH2PO4 0,1M, vortex phút cho mẫu, ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút (to phịng), sau gạn lấy phần dịch Tiếp tục chiết lặp lại lần nữa, gộp toàn dịch chiết, ly tâm 5000 vòng/phút 10 phút, dung dịch đem làm qua cột SCX, hoạt hóa MeOH; H2O, sau nạp hết mẫu qua cột, rửa tạp 3ml H2O, 3ml MeOH:H2O (10:90), rửa giải NH4OH 5% Thổi khơ dung dịch khí ni tơ, hịa cặn xác 1ml dung mơi pha động, lọc qua màng lọc 0,22µm, khử khí tiến hành đo máy UPLC/MS/MS Kết thảo luận 3.1 Khảo sát kết ảnh hưởng mẫu q trình phân tích Trong phân tích LC/MS/MS, mẫu ảnh hưởng lớn đến độ xác kết phân tích, từ giai đoạn chuẩn bị mẫu đến giai đoạn định lượng đầu dò khối phổ (hiệu suất tạo ion) Vì vậy, việc khảo sát ảnh hưởng mẫu q trình phân tích quan trọng Kết bảng cho thấy diện tích píc ion dung dịch chuẩn dung dịch thêm chuẩn vào mẫu sau xử lý tương tự nhau, điều chứng tỏ khơng có hiệu ứng giai đoạn tạo ion đầu dò khối phổ 4 N.T Hà nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số (2016) 1-6 Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng mẫu q trình phân tích Chất phân tích Salbutamol Ractopamine Clenbuterol Nồng độ (µg/kg) Dung dịch chuẩn Thêm vào mẫu sau xử lý Dung dịch chuẩn Thêm vào mẫu sau xử lý Dung dịch chuẩn Thêm vào mẫu sau xử lý A148 A166 A148 A166 A164 A121 A164 A121 A203 A167 A203 A167 33942 15089 31692 14457 22948 16936 24166 18233 8309 1792 8025 1674 51196 22718 51012 23304 33052 26574 32413 25391 14073 3185 12589 3290 82995 36956 80763 35204 52218 40506 50124 40574 22206 5089 23187 5263 0,999, độ thu hồi điểm chuẩn thỏa mãn yêu cầu ( ≤ 10%) 3.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi: Đánh giá độ thu hồi dựa vào mẫu thêm chuẩn mức nồng độ 3,0µg/kg; 5,0µg/kg 7,0µg/kg Sử dụng đường chuẩn để tính tốn Tại nồng độ, thực chiết độc lập, nồng độ phân tích lần, ngày khác 3.2 Khảo sát khoảng tuyến tính đường chuẩn: Đường chuẩn thực mẫu trắng thêm chuẩn (phương pháp thêm chuẩn) nồng độ 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 10µg/kg Kết cho thấy đường chuẩn salbutamol, ractopamine clenbuterol tuyến tính khoảng từ 1,0 - 10µg/kg Giá trị R2> Compound name: Salbutamol Correlation coefficient: r = 0.999676, r^2 = 0.999353 Calibration curve: 22839.5 * x + 3654.13 Res ponse type: External Std, Area Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Compound name: Ractopamine Correlation coefficient: r = 0.997910, r^2 = 0.995824 Calibration curve: 10943.4 * x + -1088.84 Response type: External Std, Area Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None 2.00 5.0 Residual Residual 1.00 0.00 -1.00 0.0 -5.0 -2.00 -10.0 Conc Conc 100000 Response Response 80000 150000 100000 50000 -0 -0.0 60000 40000 20000 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Conc 10.0 -0 -0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Hình Đường chuẩn định lượng salbutamol ractopamine Bảng Kết khảo sát hiệu suất thu hồi tính mẫu thức ăn chăn ni Nồng độ mẫu (µg/kg) Salbutamol HTB (%) RSD% (n = 6) 72,70 4,22 87,24 2,56 89,33 3,32 Ractopamine HTB (%) RSD% (n = 6) 73,31 5,44 75,22 4,18 83,12 2,05 Clenbuterol HTB (%) RSD% (n = 6) 70,27 6,02 76,42 1,66 85,70 2,34 Conc 10.0 N.T Hà nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số (2016) 1-6 Bảng cho thấy hiệu suất thu hồi cao, salbutamol dao động khoảng 72,70 đến 89,33%; ractopamin dao động khoảng 75,22 83,12%; clenbuterol dao động từ 70,27 đến 85,70% Đáp ứng yêu cầu Quyết định 2002/657/EC (Khoảng chấp nhận từ 70 đến 110%) 3.4 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Tại Viêt Nam nay, mẫu thức ăn chăn ni coi dương tính với salbutamol, ractopamine clenbuterol có kết phân tích định lượng cao 10µg/kg Vì vậy, đề tài tiến hành khảo sát LOD nồng độ 2µg/kg Chuẩn bị 10 mẫu trắng thêm chuẩn hỗn hợp salbutamol, ractopamine clenbuterol nồng độ Xử lý mẫu phân tích theo điều kiện chọn, kết bảng Đánh giá tình hợp lý: Từ giá trị LOD tính được, tính Rtính tốn = x/LOD = 4,79 (salbutamol), 6,0 (ractopamine) 4,49 (clenbuterol), x giá trị trung bình Theo lý thuyết, Rtính tốn phải nằm khoảng < Rtính tốn < 10 nên nồng độ dung dịch mẫu trắng thức ăn chăn ni thêm chuẩn phù hợp, LOD tính đáng tin cậy, điều kiện thiết bị theo thời gian giảm độ nhạy nên lấy giá trị LOQ salbutamol, ractopamine clenbuterol 1,0µg/kg; 1,0 µg/kg 1,07µg/kg tương ứng 3.5 Độ dao động tỷ lệ cường độ ion mảnh ion Kết từ bảng cho thấy tỷ lệ cường độ ion salbutamol, ractopamine clenbuterol dung dịch mẫu nằm khoảng cho phép, phù hợp với định Hội đồng Châu Âu 2002/657/EC Bảng Kết khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng phương pháp Mẫu Salbutamol SPK 2-1 1,62 SPK 2-2 1,40 SPK 2-3 1,52 SPK 2-4 1,50 SPK 2-5 1,47 SPK 2-6 1,32 SPK 2-7 1,41 SPK 2-8 1,34 SPK 2-9 1,56 SPK 2-10 1,40 Trung bình 1,45 SD 0,10 LOD 0,30 LOQ 0,97 RTính tốn 4,79 Nồng độ (µg/kg) Ractopamin Clenbuterol 1,34 1,41 1,52 1,57 1,44 1,51 1,40 1,43 1,50 1,57 1,52 1,46 1,43 1,70 1,61 1,62 1,48 1,55 1,55 1,34 1,48 1,51 0,08 0,11 0,27 0,36 0,79 1,07 6,00 4,49 Bảng Kết khảo sát cường độ ion định lượng ion xác nhận Chất phân tích Salbutamol Ractopamine Clenbuterol Nồng độ (µg/l) Tỷ lệ ion dung dịch chuẩn Tỷ lệ ion mẫu Tỷ lệ ion dung dịch chuẩn Tỷ lệ ion mẫu Tỷ lệ ion dung dịch chuẩn Tỷ lệ ion mẫu 0,44 0,44 0,44 0,45 0,45 0,43 0,73 0,80 0,77 A121/A164 0,75 0,78 0,81 A167/A203 0,21 0,22 0,22 A167/A203 0,20 0,22 0,22 A166/A148 A166/A148 A121/A164 Khoảng dao động cho phép 0,42 - 0,44 0,62 - 0,93 0,21 - 0,24 N.T Hà nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số (2016) 1-6 Kết luận Đã tiến hành nghiên cứu xây dựng thành công phương pháp xác định đồng thời salbutamol, ractopamine clenbuterol thức ăn chăn nuôi sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC/MS/MS đạt độ nhạy độ chọn lọc cao, quy trình chiết mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh Phương pháp phê duyệt theo định 657/2002/EC Cộng đồng chung Châu Âu Phương pháp phù hợp để xác định dư lượng nhóm beta agonist thức ăn chăn ni ngưỡng địi hỏi thị trường Phương pháp áp dụng phân tích 93 mẫu thực tế khu vực miền Bắc Việt Nam [2] [3] [4] [5] Tài liệu tham khảo [1] In Kyungsung, Seo Jung Park, Kyutae Kang, Min Young Kim and Seongbeom Cho, Development and Application of a method for Rapid and Simultaneous determination of three β - agonist (Clenbuterol, ractopamine and Zilpaterol) using Liquid Chromatography - tandem Mass Spectrometry, Korean J Food Scie An, vol 35, No 1, pp 212 - 129 (2015) Uniterd States Deparment of Agriculture Food safety and Inspection Service, Office of Public Health Science, Determination and Confirmation of BetaAgonists by HPLC/MS/MS, Revision 07 (2016) Dickson LC, MacNeil JD, Lee S, Fesser AC, Determination of beta-agonist residues in bovine urine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry, J AOAC Int Vol 88(1), pp.46-56 (2005) Jirapa Setjintanin, Nuntana Klinsunthorn, Wantana Onpirom, Mongkol Chenchittikul, Determination of Beta-agonist Residues in Pork at the South-Middle Region, Medical Journal, Vol.25 No.4 (2006) Commission Decision 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results Simultaneous Dertermination of Beta-agonists (Salbutamol, Ractopamine and Clenbuterol) in Animal Feed Using Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry Nguyen Thi Ha1, Nguyen Van Luong1, Do Khac Hai2, Le Thi Quynh, Nguyen Kieu Hung2 VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Environment Police Department, Ministry of Public Security Abstract: A method based on ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC/MS/MS) as development for simply and rapid determination of the residues of three beta-agonist (salbutamol, ractopamine and clenbuterol) in animal feed The sample were extracted by kalidihydrophosphat and then analyzed in multiple reaction monitoring (MRM) mode Mobile phase was ultrapure water (containing 0,1% formic acid) Uder the optimized detection conditions, the linear range for salbutamol, ractopamine and clenbuterol are 1,0 - 10µg/L, the linear correlation coefficients are all more than 0,999 The limits of quantification of salbutamol, ractopamine and clenbuterol are 1,0; 1,0 and 1,07µg/kg respectively The recoveries of three betaagonists range from 70,27 - 89,33 with relative standard deviations (RSD) of 1.66 - 6.02% This method is simly, effective, sensitive, which is suitable for the determination and confirmation of three beta-agonists in animal feed Keywords: Salbutamol, ractopamine, clenbuterol; UPLC/MS/MS; Animal feed stuffs  ... Kết luận Đã tiến hành nghiên cứu xây dựng thành công phương pháp xác định đồng thời salbutamol, ractopamine clenbuterol thức ăn chăn nuôi sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu UPLC/MS/MS đạt độ... 32, Số (2016) 1-6 dựa kỹ thuật khác Bài báo gới thiệu phương pháp xác định đồng thời salbutamol, ractopamine clenbuterol sử dụng thiết bị sắc ký lỏng siêu hiệu khối phổ hai lần (UPLC/MS/MS) đạt... mẫu đơn giản, thời gian phân tích nhanh Phương pháp phê duyệt theo định 657/2002/EC Cộng đồng chung Châu Âu Phương pháp phù hợp để xác định dư lượng nhóm beta agonist thức ăn chăn ni ngưỡng đòi