Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định vi khuẩn bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học bio b

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC “BIO-B” Hà Nội – 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG CHẾ PHẨM SINH HỌC “BIO-B” Họ Tên : Đặng Trung Quân Lớp : K63CNSHD Mã sinh viên : 637351 Khoa : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : TS Ninh Thị Thảo Hà Nội – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan tồn kết nghiên cứu thực Số liệu kết khóa luận trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn ghi rõ nguồn gốc giúp đỡ cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực hiện, Đặng Trung Quân i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi LỜI CẢM ƠN vii PHẦN I GIỚI THIỆU 1.1 Lời nói đầu 1.2 Mục tiêu yêu cầu 1.2.1 Mục tiêu 1.2.2 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung vi khuẩn Bacillus thuringiensis 2.1.1 Lịch sử phát khám phá 2.1.2 Đặc điểm hình thái 2.1.3 Đặc điểm sinh hóa 2.1.4 Độc tố chế gây độc Bacillus thuringiensis 2.1.5 Phân loại gen sinh độc tố 10 2.2 Ứng dụng chế phẩm sinh học Bacillus thuringiensis 13 2.4 Các phương pháp nghiên cứu xác định Bacillus thuringiensis 16 2.5 Giới thiệu sản phẩm sinh học “Bio B” 18 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 3.1 Vật liệu 19 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 19 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm sinh học “Bio B” 19 3.3.2 Nội dung 2: Đánh giá đặc điểm hình thái sinh hoá mẫu vi khuẩn Bt giả định phân lập từ chế phẩm “Bio B” 21 3.3.3 Nội dung 3: Định danh vi khuẩn Bt giả định phương pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 22 3.3.4 Nội dung 4: Thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt 23 3.4 Định lượng hóa chất 24 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Phân lập Bacillus thuringiensis từ chế phẩm “Bio B” 26 4.1.1 Ảnh hưởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết phân lập vi khuẩn Bt 26 ii 4.1.2 Ảnh hưởng nồng độ pha loãng mẫu thử đến kết phân lập vi khuẩn Bt 27 4.2 Xác định vi khuẩn Bt phân lập dựa vào đặc điểm hình thái 30 4.2.1 Hình thái khuẩn lạc 30 4.2.2 Hình thái tế bào 31 4.3.2 Thử nghiệm catalase 35 4.4 Định danh vi khuẩn Bt phân lập phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu 38 4.5 Thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt 40 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 5.1 Kết luận 43 5.1 Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Phân loại gen Bt 12 Bảng 3.1 Các mồi PCR sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 4.1 Ảnh hưởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến phát triển vi khuẩn sau 18h nuôi cấy 26 Bảng 4.2 Ảnh hưởng độ pha loãng mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 18h nuôi cấy 28 Bảng 4.3 Mật độ khuẩn lạc có hình thái đặc trưng chế phẩm sinh học “Bio B” 28 Bảng 4.4: Đặc điểm hình thái chủng phân lập 34 Bảng 4.5 Kết thử nghiệm sinh hóa chủng phân lập giả định “BT” so với chủng chuẩn “4T1” 37 iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình thái khuẩn lạc Bacillus thuringiensis Hình 2.2 Ảnh hiển vi điện tử minh họa Bacillus thuringiensis var kurtsaki Hình 2.3 Bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis Hình 2.4 Tinh thể Bacillus thuringiensis Hình 2.5 Cơ chế hoạt động Bacillus thuringiensis sâu bướm Lepidoptera 10 Hình 2.6 Hình tóm tắt vật chủ độc tố Bt δ-endotoxins (Cry and Cyt) 12 Hình 3.1 Chế phẩm sinh học “Bio B” 19 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc chủng Bt chuẩn giả định 30 Hình 4.2 Kết nhuộm gram tế bào vi khuẩn quan sát kính hiển vi độ phóng đại 1000X 31 Hình 4.3 Bào tử tinh thể vi khuẩn Bt quan sát kính hiển vi ở độ phóng đại 1000X sau nhuộm với comassie 32 Hình 4.4 Kết phản ứng lecithinase 35 Hình 4.5 Kết phản ứng catalase 36 Hình 4.6 Kết phản ứng lên men sucrose 37 Hình 4.7 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Cry 38 Hình 4.8 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GroEl 39 Hình 4.9 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Gyrb 39 Hình 4.10 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen XRE 39 Hình 4.11 Kết phản ứng PCR khuẩn lạc với quy trình 1, 41 v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Diễn giải chữ viết tắt Bt CT DNA ICP LB LD MYP Bacillus thuringiensis Công thức Deoxyribonucleic acid Insecticidal crystal protein Luria Bertani Broth Lethal dose Mannitol egg yolk polymyxin PCR Polymerase chain reaction vi LỜI CẢM ƠN Trong thời gian tháng làm khố luận tốt nghiệp Khoa Cơng nghệ Sinh học Thực vật – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, quan tâm giúp đỡ dìu dắt tận tình Thầy Cô giáo, cán bộ, anh chị phịng thí nghiệm khoa nhóm sinh viên nghiên cứu với cố gắng nỗ lực thân, tơi có hội củng cố rèn luyện kiến thức kỹ học tập để hồn thành tốt khố luận Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy, cô giáo TS Ninh Thị Thảo hỗ trợ tơi hồn thành luận văn kiên nhẫn kiến thức Hơn nữa, hướng dẫn cô giúp đỡ thời gian viết luận văn Thứ hai, xin gửi lời cảm ơn đến tất thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học, đặc biệt Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật Thầy/cô cung cấp kiến thức khoa học kỹ thuật hữu ích cho Đây điều quan trọng giúp tơi thực thành cơng khóa luận Tơi muốn cảm ơn người bạn đồng hành phịng thí nghiệm tơi hỗ trợ đáng kể người Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới bạn bè người thân gia đình ln động viên, cổ vũ tinh thần giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi suốt q trình học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực hiện, Đặng Trung Quân vii TÓM TẮT Hiện nay, Bacillus thuringiensis (Bt) loài vi khuẩn sử dụng rộng rãi để kiểm sốt trùng gây hại nhiều chế phẩm sinh học, tạo nhiều loại độc tố khác trình phát triển chúng: ngoại độc tố nội độc tố Ngoại độc tố α, ngoại độc tố β (β-exotoxin), ngoại độc tố γ (γ- endotoxin) nội độc tố (-endotoxin) có hoạt tính diệt trùng đặc hiệu.“Bio B” chế phẩm sinh học có chứa Bacillus thuringiensis (Bt) thay loại thuốc hóa học ưu điểm chúng tính đặc hiệu cao cho trùng mục tiêu, an toàn đặc biệt thân thiện với môi trường Trong đề tài này, tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp tiếp cận khác bao gồm phân tích hình thái, đặc điểm sinh hóa phân tử để xác định định lượng Bt chế phẩm sinh học “Bio B” Vi khuẩn Bt giả định phân lập từ mẫu chế phẩm "Bio B" thể đặc trưng mặt hình thái khuẩn lạc, tế bào bào tử vi khuẩn Bt tương tự chủng chuẩn “4T1” Hơn nữa, chủng Bt cho phản ứng dương tính thử nghiệm lethicinase, sucrose catalase Ngồi ra, chúng tơi tính số khuẩn lạc dựa tỉ lệ 1:19 với nồng độ pha loãng tỉ lệ 10-4 10-5, kết làm tròn đến số nguyên gần (4,1x108) Kết cho thấy, tổng số vi khuẩn Bt chế phẩm sinh học “Bio B” phù hợp với thông tin nhà sản xuất Sự diện bốn gen Bt bao gồm XRE (gen điều hòa phiên mã), GroEL (gen protein chaperonin), GyrB (gen enzyme topoisomerase) Cry2 (gen protein tinh thể) mẫu Bt phân lập kiểm tra PCR cách sử dụng mồi đặc hiệu cụ thể Kết cho thấy băng ADN đặc thù tương ứng với gen mục tiêu: XRE (~ 246 bp), GroEL (~600 bp), GyrB (~ 221 bp), Cry2 (~ 700 bp) quan sát mẫu Bt phân lập Ngồi ra, chúng tơi thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc để định danh vi khuẩn Bt phương pháp PCR viii dụng nghiên cứu chủng Bt chuẩn khác nghiên cứu Kavitha cs (2011), Trương Phúc Hưng (2010), Mohamed (2018) Do đó, bước đầu chúng tơi khẳng định chủng phân lập giả định “BT” vi khuẩn gram dương có hình thái khuẩn lạc tế bào giống vi khuẩn Bt 4.2.3 Hình thái bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis có đặc tính điển hình là sản xuất protein tinh thể giai đoạn tĩnh chu kỳ sống Những tinh thể chứa nhiều độc tố Cry thể độc tính chống lại số lồi trùng (Schnepf cs., 1998; Feitelson cs., 1993; Estruch cs., 1996) Trong nghiên cứu này, tiến hành nhuộm tế bào chủng vi khuẩn Bt với chất nhuộm comassie nhằm quan sát bào tử tinh thể nhóm vi khuẩn Kết hình thái bào tử tinh thể chủng vi khuẩn Bt thể hình 4.3 Chủng chuẩn “4T1” Chủng phân lập giả định “BT” Hình 4.3 Bào tử tinh thể vi khuẩn Bt quan sát kính hiển vi ở độ phóng đại 1000X sau nhuộm với comassie Hình 4.3 cho thấy diện tinh thể nội bào tử hai chủng vi khuẩn Bt chuẩn phân lập từ chế phẩm “Bio B” Mặt khác, dòng Bt giả định thể đặc điểm tinh thể bào tử tương tự chủng Bt chuẩn Các tinh thể có hình thoi, trịn, lệch tâm có nhiều hình dạng khác, bắt màu đầy đủ Bào tử có hình trụ hình trứng, đầu có màu đầu khơng có màu, dù bên hay bên ngồi Hình thái bào tử tinh thể dòng vi khuẩn phân 32 lập giả định “Bt” tương tự với chủng vi khuẩn Bt chuẩn nghiên cứu khác (Kavitha cs, 2011; Trương Phúc Hưng, 2010; Mohamed, 2018) Các đặc điểm hình thái chủng phân lập giả định “BT” chủng chuẩn “4T1” tóm tắt Bảng 4.4 33 Bảng 4.4: Đặc điểm hình thái chủng phân lập Chủng Đặc tính Chủng chuẩn “4T1” Chủng phân lập giả định “BT” Kích thước khuẩn lạc 2-3mm (nhỏ) 1-2 mm (nhỏ) Hình dạng khuẩn lạc Hình dạng trịn Hình dạng trịn Rìa khuẩn lạc Không đồng Không đồng Colony levation Tăng Tăng Màu khuẩn lạc Màu trắng đục Màu trắng đục Độ mờ khuẩn lạc Trong suốt Trong suốt Kết cấu khuẩn lạc Nhầy Nhầy Hình thái tế bào Gram dương, Gram dương, hình que, đầu tù hình que, đầu tù Sắp xếp tế bào Theo chuỗi riêng lẻ Theo chuỗi riêng lẻ Hình dạng bào tử Hình trụ hình trứng Hình trụ hình trứng Hình dạng tinh thể Hình thoi, trịn, lệch tâm Hình thoi, trịn, lệch tâm Như thể Bảng 4.4, chủng phân lập giả định “BT” có đặc tính hình thái tương tự chủng chuẩn “4T1” Hơn nữa, hai dịng phân lập có khả tạo nội bào tử độc tố protein đặc điểm điển hình vi khuẩn Bt 4.3 Xác định vi khuẩn Bt phân lập dựa vào đặc điểm sinh hóa Để xác nhận chủng phân lập giả định “BT” thuộc chi Bacillus, tiến hành thử nghiệm phản ứng sinh hóa bao gồm phản ứng lecithinase, phản ứng catalase phản ứng lên men sucrose 4.3.1 Kiểm tra khả sản sinh lecithinase Chúng tiến hành thử nghiệm khả sản sinh lecithinase mơi trường ni cấy MYP có chứa lịng đỏ trứng hai chất thị gồm mannitol đỏ phenol Kết quan sát thể Hình 4.4 34 Chủng chuẩn “4T1” Chủng phân lập giả định “BT” Hình 4.4 Kết phản ứng lecithinase Phản ứng dương tính (+) cho thấy vịng kết tủa lecithinase xung quanh khuẩn lạc Vi khuẩn lên men mannitol để tạo axit tạo màu vàng môi trường với màu đỏ phenol làm chất thị pH Vi khuẩn Bt không sử dụng mannitol nên môi trường xung quanh khuẩn lạc không thay đổi bị màu kiềm hóa nhẹ tạo thành khuẩn lạc màu hồng Lecithin có lịng đỏ trứng bị phân cắt lecithinase, dẫn đến hình thành vùng khuếch tán màu trắng đục kéo dài với môi trường khuẩn lạc xung quanh Hình 4.4 cho thấy hai đĩa tương ứng với hai chủng có khuẩn lạc màu hồng vòng lecithinase bao quanh khuẩn lạc Điều chứng tỏ hai chủng vi khuẩn có khả sản xuất lecithinase 4.3.2 Thử nghiệm catalase Catalase loại enzyme quan trọng việc bảo vệ tế bào khỏi bị ơxy hóa loại ôxy phản ứng (ROS) Hầu hết tất vi sinh vật hiếu khí sản xuất catalase Một số vi sinh vật kỵ khí, ví dụ Bt chứng minh có sản xuất catalas Để kiểm tra có mặt catalase vi khuẩn Bt phân lập, tiến hành phản ứng catalase với H2O2 nồng độ 3%, kết quan sát hình 4.5 35 Chủng chuẩn “4T1” Chủng phân lập giả định “BT” Hình 4.5 Kết phản ứng catalase Phản ứng dương tính (+) cho thấy có bọt khí sinh Các kết cho thấy phản ứng dương tính hình thành bọt khí mạnh nhanh, màu trắng sữa chủng "BT" giả định chủng chuẩn "4T1", chứng tỏ hai chủng vi khuẩn sản sinh catalase 4.3.3 Thử nghiệm lên men sucrose Thử nghiệm lên men sucrose tiến hành nhằm xác định khả vi sinh vật sử dụng nguồn cacbon định để phát triển Nguồn cacbon chia thành nhóm: đường đơn, đường đa rượu Nếu vi khuẩn không lên men, thuốc nhuộm phenol đỏ cịn khơng đổi màu Nếu q trình lên men xảy ra, tạo axit, pH giảm chuyển màu môi trường sang màu đỏ Kết thử nghiệm lên men đường sucrose thể hình 4.6 36 Hình 4.6 Kết phản ứng lên men sucrose Phản ứng dương tính (+): mơi trường chuyển màu từ đỏ cam thành hồng đỏ tươi Theo hình 4.6, vi khuẩn mơi trường sử dụng đường sucrose để phát triển tạo thành axit, làm giảm độ pH mơi trường ni cấy Do đó, hai mơi trường ni cấy có chứa vi khuẩn Bt giả định chủng chuẩn chuyển từ màu đỏ cam sang màu hồng đỏ tươi thay đổi màu sắc chất thị phenol đỏ Ngược lại, môi trường chứa nước cất (đối chứng âm), màu môi trường giữ nguyên Kết tổng hợp ba thử nghiệm sinh hoá chủng vi khuẩn phân lập chủng chuẩn thể bảng 4.5 Bảng 4.5 Kết thử nghiệm sinh hóa chủng phân lập giả định “BT” so với chủng chuẩn “4T1” Chủng chuẩn “4T1” Chủng phân lập giả định “BT” Sản xuất Lecithinase + + Thử nghiệm Catalase + + Lên men Sucrose + + Chủng Phản ứng 37 Như thấy từ Bảng 4.5, dịng phân lập giả định “Bt” thể đặc tính sinh hóa tương tự chủng chuẩn “4T1” khả sản xuất lecithinase, khả lên men sucrose diện catalase tế bào Tóm lại, thấy chủng “Bt” giả định phân lập từ chế phẩm vi sinh “Bio B” cho thấy đặc điểm khác biệt vi khuẩn Bt bao gồm đặc điểm khuẩn lạc, tế bào, bào tử tinh thể phản ứng sinh hóa (Baumann cs., 1984 ; Claus cs., 1986; Slepecky cs., 1992; Carlson cs., 1993; Hansen cs., 1998) 4.4 Định danh vi khuẩn Bt phân lập phương pháp PCR sử dụng mồi đặc hiệu Để xác nhận chủng phân lập Bacillus thuringiensis cấp độ phân tử, xác định diện số gen đặc trưng cho vi khuẩn Bt, bao gồm gen GroEL, GyrB, XRE, Cry phương pháp PCR (Chelliah cộng sự, 2019) sử dụng DNA tổng số tách chiết từ chủng vi khuẩn Kết sản phẩm PCR thể hình 4.7-4.10 Hình 4.7 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Cry 38 Hình 4.8 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GroEl Hình 4.9 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Gyrb Hình 4.10 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen XRE 39 Ghi chú: Đối chứng âm nước cất chủng ATCC79530 (Bacillus subtilis), NT 1.8 (B amyloliquefaciens), ATCC 25923 (S aureus ), ATCC 85922 (E.coli), đối chứng dương chủng vi khuẩn Bt chuẩn: 4T1, 4D4, 4T4 V, E, S, B, T1, DT, BM chủng Bt phân lập từ mẫu chế phẩm khác Chủng phân lập giả định nghiên cứu “B” Thang chuẩn DNA 1000bp Hình 4.7-4.10 cho thấy sản phẩm PCR nhân chủng vi khuẩn phân lập có kích thước tương tứng với kích thước sản phẩm PCR chủng vi khuẩn chuẩn bao gồm sản phẩm có kích thước 700bp tương ứng với gen Cry2 (Hình 4.7), kích thước 600 bp tương ứng với gen GroEL (Hình 4.8); kích thước 221 bp tương ứng với gen GryB (Hình 4.9); kích thước 246 bp tương ứng với gen XRE (Hình 4.10) Kết phản ứng PCR cho thấy chủng vi khuẩn Bt giả định mang gen đặc hiệu cho vi khuẩn Bt Tóm lại, kết hợp kết phân tích đặc điểm hình thái, sinh hóa phân tích diện gen đặc trưng vi khuẩn Bt phương pháp PCR khẳng định chủng vi khuẩn phân lập Bacillus thuringiensis 4.5 Thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt Để định danh vi khẩn Bt phương pháp PCR, yêu cầu cần có DNA tách chiết từ vi khuẩn Bt Tuy nhiên, việc nuôi cấy vi khuẩn môi trường lỏng nhằm tăng sinh khối để tách DNA trình tách DNA tốn thời gian kinh tế Sẽ hiệu sử dụng khuẩn lạc vi khuẩn Bt trực tiếp cho phản ứng PCR mà không cần qua giai đoạn tách chiết DNA Chính vậy, nghiên cứu thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc cho vi khuẩn Bt với quy trình thử nghiệm, bao gồm: (1) Quy trình 1: Sử dụng khuẩn lạc đơn cho trực tiếp vào ống PCR có chứa thành phần phản ứng PCR mix sẵn (2) Quy trình 2: Lấy khuẩn lạc đơn hoà tan 100 μl dung dịch 1/8 TE, vortex 10s, sau hút μl bổ sung vào ống PCR có chứa thành 40 phần phản ứng PCR mix sẵn (3) Quy trình 3: Lấy khuẩn lạc đơn hoà tan 100 μl dung dịch 1/8 TE, vortex 10s, ủ 95℃ phút, sau hút μl bổ sung vào ống PCR có chứa thành phần phản ứng PCR mix sẵn Sản phẩm phản ứng PCR với quy trính sau điện di gel agraose thể hình 4.11 Hình 4.11 Kết phản ứng PCR khuẩn lạc với quy trình 1, Chú thích: giếng 1: Ladder; giếng 2, 3: Đối chứng dương, DNA chủng chuẩn “4T1”; giếng 4, 5: PCR khuẩn lạc với quy trình 1; Giếng 6, 7: PCR khuẩn lạc với quy trình 2; Giếng 8, 9: PCR khuẩn lạc với quy trình Kết hình 4.11 cho thấy sử dụng khuẩn lạc đơn bổ sung trực tiếp vào phản ứng PCR (quy trình 1), hồn tồn khơng có sản phẩm nhân lên 41 cặp mồi (giếng 4, 5) Nguyên nhân vi khuẩn Bt có thành tế bào dày nên DNA khơng thể giải phóng khỏi tế bào khơng có tác động học nhiệt độ với thành tế bào Đối với quy trình 2, sử dụng khuẩn lạc đơn hoà tan dung dịch 1/8 TE vortex 10 s, sau lấy μl cho phản ứng PCR cho sản phẩm PCR không ổn định mồi khác Cụ thể, với mồi nhân gen Gyrb, Cry XRE sản phẩm PCR xuất đối chứng dương, sản phẩm PCR lại xuất không ổn định lần thử với mồi nhân gen Groel (giếng 6,7) Trong quy trình 3, sản phẩm PCR xuất mồi nhân gen đặc hiệu cho vi khuẩn Bt hai lần lặp (giếng 8, 9) Do vậy, quy trình áp dụng để thực phản ứng PCR khuẩn lạc vi khuẩn Bt 42 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Chúng đề xuất sử dụng phương pháp xác định vi khuẩn Bt từ thuốc trừ sâu sinh học "Bio B" sau: Hịa tan mẫu mơi trường LB đệm axetat 0,25M theo tỷ lệ 1: 19 (w/v), xử lý mẫu 80°C phút, sau ni cấy 10µl độ pha lỗng 10-4 mơi trường LB Sau đó, lựa chọn khuẩn lạc giống Bt để đánh giá đặc điểm hình thái, sinh hóa phân tử chúng - Khuẩn lạc Bt giả định phân lập thể đặc điểm đặc trưng vi khuẩn Bt khuẩn lạc trắng tròn, Gram dương, hình thành bào tử lethicinase, sucrose, catalase dương tính thí nghiệm sinh hóa - Sản phẩm PCR bốn gen bao gồm GroEL, GyrB, XRE Cry2 đặc hiệu cho chủng Bt chuẩn dòng phân lập Bt giả định - Nghiên cứu thiết lập phản ứng PCR khuẩn lạc nhân cặp mồi đặc hiệu cho vi khuẩn Bt sau: sử dụng khuẩn lạc đơn hoà tan 100 μl dung dịch 1/8 TE, vortex 10s, ủ 95°C phút , sau hút μl bổ sung vào ống PCR có chứa thành phần phản ứng PCR mix sẵn 5.1 Kiến nghị - Cần thực thêm thí nghiệm ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian đến kết phân lập vi khuẩn Bt - Các phương pháp xác định vi khuẩn Bt thí nghiệm hóa sinh cần nghiên cứu thêm - Phương pháp multiplex PCR sử dụng để xác định vi khuẩn Bt - Cần đóng góp phát triển phương pháp phát định lượng Bacillus thuringiensis thuốc trừ sâu sinh học khác có chứa Bt Việt Nam 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng Việt Công ty TNHH Thiên Thảo Hân Chế phẩm sinh học “Bio B” Truy cập 03/06/2022 tại: https://chephamsinhhocbio.com/san-pham/thuoc-tru-sausinh-hoc-biob-goi-30gr-80.html Cục bảo vệ thực vật (13/05/2014) Ứng dụng chế phẩm sinh học phục vụ cho trồng - hướng đắn phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững Truy cập 03/06/2022 tại: https://www.ppd.gov.vn/khuyen-nong-bvtv/ungdung-che-pham-sinh-hoc-phuc-vu-cho-cay-trong -huong-di-dung-dancua-phat-trien-nong-nghiep-sinh-thai-ben-vung.html GEBIO (04/07) Bacillus Thuringiensis – thuốc trừ sâu sinh học cho trồng Truy cập ngày 03/06/2022 tại: https://mtx.vn/bacillus-thuringiensis-thuoctru-sau-sinh-hoc-cho-cay-trong/ Lê Văn Dũng (11/02/2022) Bacillus thuringiensis ứng dụng nông nghiệp Truy cập 05/06/2022 tại: http://khuyennongkiengiang.com.vn/tintuc/chi-tiet/bacillus-thuringiensis-va-ung-dung-trong-nong-nghiep/835 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu 2001 2002, Viện Công nghệ Sinh học, trang 296 – 302 Ngơ Đình Bính (05/10/2010) 35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam Truy cập 03/06/2022 tại: https://vast.gov.vn/tin-chi-tiet/-/chi-tiet/35-nam-nghien-cuu-va-phat-trienthuoc-tru-sau-sinh-hoc-bacillus-thuringiensis-tai-viet-nam-2291-463.html Nguyễn Ma ̣nh Chinh (11/11/2010) Thuốc sinh học Bt diệt sâu nào? Truy cập 04/06/2022 tại: https://nongnghiep.vn/thuoc-sinh-hoc-bt-diet-sau-thenao-d62265.html Nguyễn Thị Hiền (2012) Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng Nguyễn Thị Kiều Khanh (03/2018) Phân lập, tuyển chọn dòng Bacillus Thuringiensis từ ấu trùng sâu cánh vảy nhiễm bệnh Truy cập 06/06/2022 tại: http://repository.ntt.edu.vn/jspui/handle/298300331/3914 10 Nguyễn Thị Thu Nga Ứng dụng vi khuẩn Bacillus Thuringensis phòng trừ sinh học côn trùng Truy cập 04/06/2022 tại: https://123docz.net//document/5138109-bacillus-thuringiensis.htm 11 Trần Chung Dũng (2019) Nghiên cứu chế phẩm sinh học diệt sâu tơ từ vi khuẩn Bacillus Thuringensis phân lập Thái Nguyên 44 12 Nguyễn Văn Sinh (12/08/2019) CFU gì? Cách tính CFU nào? Truy cập 04/06/2022 tại: https://visitech.vn/cfu-la-gi-cach-tinh-cfu-nhu-thenao/#ftoc-heading-1 13 Phạm Minh Tuấn (06/2012) Ứng dụng chế phẩm sinh học sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt (Bacillus thuringensis) Truy cập 04/06/2022 tại: https://123docz.net/document/3436285-ung-dung-che-pham-sinh-hoctrong-san-xuat-thuoc-tru-sau-sinh-hoc-bt-bacillus-thuringiensis-var.htm 14 Viện công nghệ sinh học ứng dụng vi sinh miền Nam (28/05/2018) Tác dụng của Bacillus thuringiensis các loa ̣i sâu ̣i Truy cập 04/06/2022 tại: http://siamb.vn/tin-ky-thuat/vi-khuan-bacillus-thuringiensis/tac-dungcua-bacillus-thuringiensis-tren-cac-loai-sau-hai.html 15 Viện công nghệ sinh học ứng dụng vi sinh miền (28/05/2018) Đă ̣c điể m Bacillus thuringiensis Truy cập03/06/2022 tại: http://siamb.vn/tin-kythuat/vi-khuan-bacillus-thuringiensis/dac-diem-bacillus-thuringiensis.html 16 Võ Thị Thứ (1996) Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả ứng dụng số chủng vi khuẩn Bacillus B Tài liệu tiếng Anh André Luiz de Almeida Melo,Vanete Thomaz Soccol, Carlos Ricardo Soccol (09/04/2014) Bacillus thuringiensis: mechanism of action, resistance, and new applications Truy cập tại: https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.3109/07388551.2014.960793?journal Code=ibty20 Biệt thự, E., Parrá, F., Cira, L Villalobos, S (2018, tháng 1) Chi Bacillus tác nhân kiểm soát sinh học ý nghĩa an tồn sinh học nơng nghiệp Tạp chí Phytopathology Mexico Xuất trực tuyến Fadel A Sharif and N Gfirdal Alaeddinoglu (20/07/1987) A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis Truy cập 05/06/2022 tại: https://iugspace.iugaza.edu.ps/bitstream/handle/20.500.12358/25277/BF01 569580.pdf?sequence=1&isAllowed=y Georgina Sanahuja, Raviraj Banakar, Richard M Twyman, Teresa Capel Paul Christou (25/02/2011) Bacillus thuringiensis : a century of research, development and commercial applications Hoffe, H Whiteley, H (1989, tháng 6) Protein tinh thể diệt côn trùng Bacillus thuringiensis J Ceron, L Covarrubias, R Quintero, A Ortiz, M Ortiz, E Aranda, L Lina, A Bravo (1994) PCR analysis of the cryI insecticidal crystal family genes from Bacillus thuringiensis Appl Environ Microbiol.;60(1):353-6 Martin, P Travers, R (1989, tháng 10) Sự phong phú phân phối toàn giới Bacillus thuringiensis Ứng dụng vi sinh môi trường 45 Manuel Porcar, Victor Juárez-Pérez (2003) PCR-based identification of Bacillus thuringiensis pesticidal crystal genes FEMS Microbiology Reviews Vol 26 (5) pp 419-32 Mohamed A Ibrahim, Natalya Griko, Matthew Junker, Lee A Bulla (0102/2010) Bacillus thuringiensis Truy cập 05/06/2022 tại: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3035146/ Roh, J., Jae, Y., Ming, S., Byung, R Yeon, H (2007) Bacillus thuringiensis cơng cụ cụ thể, an tồn hiệu để kiểm sốt dịch hại trùng Tạp chí Vi sinh Cơng nghệ sinh học Sauka, D Benitende G (2008) Bacillus thuringiensis: tổng quát Một cách tiếp cận để sử dụng chế phẩm sinh học trùng lepidopteran lồi gây hại nơng nghiệp Tạp chí Vi sinh học Argentina 10 Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D Dean H (1998, tháng 9) Bacillus thuringiensis Protein tinh thể thuốc trừ sâu Đánh giá vi sinh phân tử sinh học 11 Ugur Azizoglu, Abdurrahman Ayvaz, Semih Yilmaz, Salih Karabörklü, Ridvan Temizgul (04/11/2016) Expression of cry1Ab gene from a novel Bacillus thuringiensis strain SY49-1 active on pest insects Truy cập 04/06/2022 tại: https://www.elsevier.es/en-revista-brazilian-journalmicrobiology-490-pdf-S151783821630274X 12 Wikipedia Bacillus thuringiensis Truy cập 04/06/2022 tại: https://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis#:~:text=Bacillus%20th uringiensis%20l%C3%A0%20lo%E1%BA%A1i%20thu%E1%BB%91c, %C4%83n%2C%20cu%E1%BB%91i%20c%C3%B9ng%20t%E1%BB% AD%20vong 13 Yolanda Bel, Juan Ferré and Patricia Hernández-Martínez (30/11/2020) Bacillus thuringiensis Toxins: Functional Characterization and Mechanism of Action Truy cập 05/06/2022 tại: https://www.mdpi.com/20726651/12/12/785/htm 46