Nghiên cứu phương pháp xác định vi khuẩn bacillus thuringiensis trong chế phẩm sinh học

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM O N N N Ọ - - OÁ LUẬN TỐT N P ĐỀ TÀ : “N ÊN ỨU P ƢƠN P ÁP XÁ ĐỊN VI UẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG Ế P ẨM N Nội – 2022 Ọ ” HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM O N N N Ọ - - OÁ LUẬN TỐT N P ĐỀ TÀ : “N ÊN ỨU P ƢƠN P ÁP XÁ ĐỊN V UẨN BACILLUS THURINGIENSIS TRONG Ế P ẨM inh viên thực N Ọ ” : TRẦN T U MSV : 637328 Khóa : K63CNSHD Ngành : N N ƢƠN N iáo viên hƣớng dẫn : T N N T Ị U Nội – 2022 Ọ LỜ M ĐO N Tôi xin cam đoan kết số liệu nghiên cứu “Nghiên cứu phương pháp xác định vi khuẩn Bacillus thuringiensis chế phẩm sinh học” tuyệt đối trung thực chƣa đƣợc cơng bố trƣớc đó, khơng có chép từ nguồn khác Ngồi ra, báo cáo có sử dụng số nguồn tài liệu tham khảo đƣợc trích dẫn nguồn thích rõ ràng Đề tài, nội dung báo cáo sản phẩm mà nỗ lực nghiên cứu trình học thực tập phịng Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Thực vật - Khoa Công nghệ sinh học Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trƣớc môn, khoa nhà trƣờng cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Trần Thu Hƣơng i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nông Thị Huệ tạo điều kiện theo sát hƣớng dẫn suốt thời gian thực khóa luận tốt nghiệp Tơi xin cảm ơn thầy, cô giáo khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam truyền đạt cho tơi kiến thức, ln tận tình chỉbảo đƣa lời khuyên quý báu suốt q trình học tập trƣờng Cuối cùng, tơi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, tới gia đình bạn bè – ngƣời bên ủng hộ, giúp đỡ động viên suốt trình học tập vừa qua Mặc dù cố gắng hồn thành khóa luận tốt nghiệp phạm vi khả Tuy nhiên khơng tránh khỏi thiếu sót Rất mong nhận đƣợc cảm thơng bảo tận tình từ q thầy tồn thể bạn Hà Nội ngày tháng năm 2022 Sinh viên thực Trần Thu Hƣơng ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vii TÓM TẮT viii PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Yêu cầu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Khái quát chung vi khuẩn B thuringiensis 2.1.1 Lịch sử phát vi khuẩn B thuringiensis 2.1.2 Phân loại phân bố vi khuẩn B thuringiensis 2.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn B thuringiensis 2.4 Vòng đời Bacillus thuringiensis 2.5 Độc tố chế gây độc B thuringiensi 10 2.5.1 Độc tố vi khuẩn B thuringiensis 10 2.5.2 Cơ chế gây độc vi khuẩn B thuringiensis 12 2.6 Ứng dụng chế phẩm sinh học B thuringiensis 14 2.6.1 Trên giới 14 2.6.2 Ở Việt Nam 14 2.7 Phƣơng pháp xác định vi khuẩn B thuringiensis 15 2.7.1 Phƣơng pháp truyền thống 15 2.7.2 Phƣơng pháp phân tử 16 2.8 Ứng dụng multiplex PCR việc phát loại vi khuẩn 17 2.8.1 Giới thiệu chung multiplex PCR 17 2.8.2 Các loại phản ứng multiplex PCR 18 iii 2.8.3 Các nghiên cứu kỹ thuật multiplex PCR giới Việt Nam 18 2.9 Giới thiệu sản phẩm sinh học “BITADIN WP” 20 PHẦN VẬT LIỆU NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Vật liệu nghiên cứu 22 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 22 3.3 Nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 22 3.3.1 Nội dung 1: Phân lập Bacillus thuringiensis từ mẫu chế phẩm sinh học 22 3.3.2 Nội dung 2: Xác định vi khuẩn Bt dựa vào đặc điểm hình thái hóa sinh 25 3.3.3 Nội dung 3: Xác định vi khuẩn Bt dựa phân tích phân tử 27 3.3.4 Khẳng định vi khuẩn Bt dựa vào PCR phát gen sinh tinh thể có mặt protein tinh thể độc 31 3.3.5 Tính tốn tổng số vi khuẩn Bacillus thuringiensis mẫu thử: 32 3.4 Các mơi trƣờng, hóa chất 32 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Xác định phƣơng pháp phân lập B thuringiensis từ chế phẩm “BITADIN WP” 35 4.1.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến kết phân lập vi khuẩn 35 4.1.2 Ảnh hƣởng nồng độ pha loãng mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 38 4.1.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ ủ mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 42 4.1.3 Ảnh hƣởng thời gian ủ mẫu đến kết phân lập vi khuẩn 45 4.2 Xác định vi khuẩn Bt đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào 48 4.3 Xác định vi khuẩn Bt dựa vào đặc điểm sinh hóa 50 4.4 Xác định vi khuẩn Bt dựa phân tích phân tử 52 4.5 Khẳng định vi khuẩn Bt dựa vào PCR sử dụng mồi gen mã hóa tinh thể độc có mặt protein tinh thể độc 58 4.6 Tính tốn tổng số vi khuẩn B thuringiensis chế phẩm 60 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 5.1 Kết luận 62 5.2 Kiến nghị 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Các mồi PCR đƣợc sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 3.2 Các thành phần phản ứng PCR 29 Bảng 3.3 Trình tự mồi đặc hiệu lồi S aureus E coli 29 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 30 Bảng 4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ lấy mẫu ban đầu đến phát triển vi khuẩn sau 18h nuôi cấy 35 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng nồng độ pha loãng mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 18h nuôi cấy 39 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng nhiệt độ ủ mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 18 nuôi cấy 43 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng thời gian ủ mẫu đến phát triển vi khuẩn sau 18h nuôi cấy 46 Bảng 4.5 Độ tinh nồng độ DNA tổng số vi khuẩn B thuringiensis 53 Bảng 4.6 Tổng số vi khuẩn B thuringiensis mẫu thử 61 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Bacillus thuringiensis nhìn kính hiển vi tƣơng phản pha Hình 2.2 Hình thái khuẩn lạc Bacillus thuringiensis Hình 2.3 Bào tử tinh thể Bacillus thuringiensis (Palma cs, 2014) Hình 2.4 Tinh thể vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Nguyễn Thị Hiền, 2012) Hình 2.5 Mơ tả tế bào Bt hình thành hồn chỉnh Hình 2.6 Phƣơng thức hoạt động Bacillus thuringiensis Lepidoptera (Schunemann cộng sự, 2012) 13 Hình 2.7 Mơ hình mơ tả phản ứng multiplex PCR 18 Hình 3.1 Chế phẩm sinh học “BITADIN WP” 22 Hình 4.1 Hình thái khuẩn lạc chủng Bt tiêu chuẩn chủng Bt giả định “BM” 49 Hình 4.2 Nhuộm gram chủng tiêu chuẩn chủng phân lập độ phóng đại 100X 49 Hình 4.3 Kết phản ứng lecithinase 51 Hình 4.4 Kết thử nghiệm catalase 51 Hình 4.5 Kết lên men sucrose 52 Hình 4.6 Phƣơng pháp xử lý nhiệt để chiết xuất DNA vi khuẩn 53 Hình 4.7a Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen XRE 55 Hình 4.7b Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GyrB 56 Hình 4.7c Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GroEL 57 Hình 4.8 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Cry2 58 Hình 4.9 Bào tử tinh thể B thuringiensis 60 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Giải thích Bt PCR LB DNA Deoxyribonucleic acid MYP Mannitol Egg Yolk Polymyxin CT CFU Bacillus thuringiensis Polymerase chain reaction Luria Bertani Broth Công thức Conoly forming unit vii TÓM TẮT Ngày nay, Bacillus thuringiensis (Bt) vi khuẩn đƣợc sử dụng rộng rãi để kiểm sốt trùng gây hại nhiều chế phẩm sinh học Điển hình chế phẩm “BITADIN WP” chế phẩm sinh học có chứa Bacillus thuringiensis (Bt) thay loại thuốc hóa học ƣu điểm chúng nhƣ độ đặc hiệu cao côn trùng, an tồn đặc biệt thân thiện với mơi trƣờng Trong nghiên cứu này, tập trung vào việc nghiên cứu phƣơng pháp tiếp cận khác bao gồm phân tích hình thái, sinh hóa phân tử để xác định định lƣợng Bt chế phẩm sinh học “BITADIN WP” Các vi khuẩn Bt giả định đƣợc phân lập từ chế phẩm “BITADIN WP” cho thấy đặc điểm đặc trƣng khuẩn lạc, bào tử nhƣ đặc điểm phản ứng hóa sinh bao gồm sản sinh lethicinase, lên men sucrose thử nghiệm catalase tƣơng tự nhƣ chủng Bt tiêu chuẩn 4T1 Ngoài ra, chủng Bt cho phản ứng dƣơng tính với lethicinase, sucrose catalase Do sử dụng gen đặc hiệu vi khuẩn Bacillus thuringiensis: XRE (gen điều hòa phiên mã), GroEL (gen protein chaperonin), GyrB (gen enzyme topoisomerase) Cry2 (gen protein tinh thể) đƣợc kiểm tra PCR sử dụng mồi đặc hiệu loài để phát Bt phân lập Kết PCR cho phép khuếch đại băng DNA đặc hiệu tƣơng ứng với gen mục tiêu cho vi khuẩn Bacillus thuringiensis: gen XRE (~ 246 bp), gen GroEL (~ 600 bp), gen GyrB (~ 221 bp), gen Cry2 (~ 700 bp) Hơn nữa, nhằm nhanh chóng phát vi khuẩn, multiplex PCR đƣợc sử dụng để phát đồng thời vi khuẩn Bacillus thuringiensis, Staphylococcus aureus: gen Nuc (464 bp) vi khuẩn E coli: gen phoA (622 bp) Để khẳng định có mặt Bt, PCR phát gen mã hóa protein tinh thể Cry2 phƣơng pháp nhuộm tinh thể độc đƣợc tiến hành Kết cho thấy vi khuẩn Bt phân lập có diện viii ình 4.6 Phƣơng pháp xử lý nhiệt để chiết xuất DNA vi khuẩn Ghi chú: Thang đo tiêu chuẩn DNA 100bp; chủng chuẩn “4T1”; chủng phân lập giả định “BM”; DT, S, E, B, T chủng Bt phân lập từ mẫu chế phẩm khác Sau tách chiết DNA, nồng độ sản phẩm độ tinh DNA đƣợc xác định DNA có tỷ lệ OD260/280 nm 1,8 2,0 đƣợc coi tinh khiết (Nicklas cs, 2003) Kết OD260/280 , OD260/230 nồng độ DNA tổng số đƣợc trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Độ tinh nồng độ DN tổng số vi khuẩn B thuringiensis Mẫu vi khuẩn B Nồng độ thuringiensis (ng/ µl) Chủng tiêu chuẩn 4T1 Chủng phân lập T OD260/280 OD260/230 214 1.63 1.24 269 1.85 1.32 Kết xác định tỷ số OD260/280 nồng độ DNA tổng số vi khuẩn 53 BM từ chế phẩm nghiên cứu có giá trị 1,85 269 ng/ µL Kết tạo thuận lợi cho việc thực phản ứng PCR đơn lẻ multiplex PCR đạt kết cao xác DNA vi khuẩn đƣợc tiếp tục đƣợc pha loãng đến nồng độ ng/ µL sử dụng cặp mồi đặc hiệu loài để thực phản ứng PCR  Xác định vi khuẩn Bt dựa vào PCR multiplex PCR sử dụng mồi đặc hiệu loài Để xác nhận chủng vi khuẩn phân lập Bacillus thuringiensis cấp độ phân tử, xác định diện số gen đặc trƣng cho vi khuẩn Bt, bao gồm gen GroEL, GyrB, XRE phƣơng pháp PCR (Chelliah et al., 2019) Và để nhanh chóng phát vi khuẩn chúng tơi tiến hành thử nghiệm multiplex PCR nhằm nhận diện đồng thời đƣợc vi khuẩn có hỗn hợp bao gồm Bt, S aureus E coli Các kết đƣợc hiển thị (Hình 4.7a, 4.7b, 4.7c) Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu khuếch đại gen GroEL, GyrB, XRE, Bt Đồng thời, phản ứng multiplex PCR phát gen Nuc (464 bp) Staphylococcus aureus ATCC 25023 gen phoA (622 bp) vi khuẩn E coli ATCC 85922 Kết cho thấy vi khuẩn phân lập từ mẫu chế phẩm phân lập mang băng ADN đặc trƣng tƣơng ứng với gen ~246bp (gen XRE) (hình 4.7a); ~ 221 bp (gen GyrB) (hình 4.7b); ~ 600bp (gen GroEL) (hình 4.7c) đƣợc phát chủng B thuringiensis tiêu chuẩn “4T1” chủng Bt phân lập, bao gồm “BM” 54 Hình 4.7a Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen XRE Ghi chú: Đối chứng trống: DW (nƣớc cất); đối chứng dƣơng (+): 4T1; V, S, E, DT, T chủng Bt phân lập từ mẫu chế phẩm khác Đối chứng âm (-): ATCC 25023 (S aureus), ATCC 85922 (E coli), mix 4T1 (4T1, S Aureus, E Coli), mix BM (BM, S Aureus, E Coli) Chủng phân lập giả định “BM” Thang chuẩn DNA 100bp Kích thƣớc băng đặc hiệu 246bp Kết hình 4.7a cho thấy giếng chủng vi khuẩn chuẩn 4T1 vi khuẩn phân lập từ chế phẩm V, S, E, DT, T BM xuất băng DNA đặc hiệu sáng rõ tƣơng ứng với gen XRE, kích thƣớc ~ 246bp (7/7 chủng nghiên cứu, tỉ lệ 100 %) Hơn nữa, kết khuếch đại băng DNA đặc trƣng cho vi khuẩn E coli với kích thƣớc ~ 622bp S Aureus với kích thƣớc ~ 464bp Kết multiplex PCR trộn DNA loại vi khuẩn cho băng DNA đặc hiệu tƣơng ứng với gen XRE, GroEL GyrB, không quan sát thấy sản phẩm không đặc hiệu khác nhƣ primer-dimer, cross-dimer Điều cho phép phát nhanh chóng, đồng thời nhiều loại vi khuẩn lúc mang lại kết xác cao Kết tƣơng tự đƣợc ghi nhận gen GyrB (hình 4.7b) gen GroEL (hình 4.7c) 55 Hình 4.7b Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GyrB Ghi chú: Đối chứng trống: DW (nƣớc cất); đối chứng dƣơng (+): 4T1; V, S, E, DT, T chủng Bt phân lập từ mẫu chế phẩm khác Đối chứng âm (): ATCC 25023 (S aureus), ATCC 85922 (E coli), mix 4T1 (4T1, S Aureus, E Coli), mix BM (BM, S Aureus, E Coli) Chủng phân lập giả định “BM” Thang chuẩn DNA 100bp Kích thƣớc băng đặc hiệu 221bp Kết hình 4.7b cho thấy giếng chủng chuẩn 4T1 vi khuẩn phân lập từ chế phẩm V, S, E, DT, T BM xuất băng DNA đặc hiệu sáng rõ tƣơng ứng với gen GyrB, kích thƣớc ~ 221 bp (7/7 chủng nghiên cứu, tỉ lệ 100 %) Hơn nữa, kết khuếch đại băng DNA đặc trƣng cho vi khuẩn E coli với kích thƣớc ~ 622bp S Aureus với kích thƣớc ~ 464bp Kết multiplex PCR trộn DNA loại vi khuẩn cho băng DNA đặc hiệu tƣơng ứng với gen XRE, GroEL GyrB, không quan sát thấy sản phẩm không đặc hiệu khác nhƣ primer-dimer, cross-dimer Điều cho phép phát nhanh chóng, đồng thời nhiều loại vi khuẩn lúc mang lại kết xác cao 56 Hình 4.7c Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen GroEL Ghi chú: Đối chứng trống: DW (nƣớc cất); đối chứng dƣơng (+): 4T1; V, S, E, DT, T chủng Bt phân lập từ mẫu chế phẩm khác Đối chứng âm (-): ATCC 25023 (S aureus), ATCC 85922 (E coli), mix 4T1(4T1, S Aureus, E Coli), mix BM (BM, S Aureus, E Coli) Chủng phân lập giả định “BM” Thang chuẩn DNA 100bp Kích thƣớc băng đặc hiệu 600bp Kết hình 4.7c cho thấy giếng chủng chuẩn 4T1 vi khuẩn phân lập từ chế phẩm V, S, E, DT, T BM xuất băng DNA đặc hiệu sáng rõ tƣơng ứng với gen GyoEL, kích thƣớc ~ 600 bp (7/7 chủng nghiên cứu, tỉ lệ 100 %) Hơn nữa, kết khuếch đại băng DNA đặc trƣng cho vi khuẩn E coli với kích thƣớc ~ 622bp S Aureus với kích thƣớc ~ 464bp Kết multiplex PCR trộn DNA loại vi khuẩn cho băng DNA đặc hiệu tƣơng ứng với gen XRE, GroEL GyrB, không quan sát thấy sản phẩm không đặc hiệu khác nhƣ primer-dimer, cross-dimer Điều cho phép phát nhanh chóng, đồng thời nhiều loại vi khuẩn lúc mang lại kết xác cao Nhƣ vậy, với kết sử dụng mồi đặc hiệu loài, khẳng định vi khuẩn chế phẩm phân tích Bacilus thuringiensis 57 4.5 Khẳng định vi khuẩn Bt dựa vào PCR sử dụng mồi gen mã hóa tinh thể độc có mặt protein tinh thể độc ❖ Phát B thuringiensis gen sinh tinh thể Cry2 Bt có đặc tính mà nhiều vi khuẩn khác khơng có sản xuất cách chọn lọc protein tinh thể diệt côn trùng mã hóa gen Cry lợi dụng đặc tính để nhƣ tính chất đặc trƣng để nhận dạng vi khuẩn Bt Chủng phân lập BM sau đƣợc xác định phƣơng pháp nhƣ xác định hình thái khuẩn lạc, tế bào, phản ứng sinh hóa gen đặc hiệu đƣợc khẳng định lần cách kiểm tra có mặt gen mã hóa tinh thể độc Cry2 protein tinh thể độc Sản phẩm khuếch đại cho gen Cry2 có kích thƣớc ~700 bp (Hình 4.8) 662 bp 464 bp Hình 4.8 Sản phẩm PCR với mồi đặc hiệu cho gen Cry2 Ghi chú: Đối chứng trống: DW (nƣớc cất); đối chứng dƣơng (+): 4T1; V, S, E, DT, T chủng Bt phân lập từ mẫu chế phẩm khác Đối chứng âm (-): ATCC 25023 (S aureus), ATCC 85922 (E coli), mix 4T1 (4T1, S Aureus, E Coli), mix BM (BM, S Aureus, E Coli) Chủng phân lập giả định “BM” Thang chuẩn DNA 100bp Kích thƣớc băng đặc hiệu 700bp Kết hình 4.8 cho thấy giếng chủng chuẩn 4T1 vi khuẩn phân lập từ chế phẩm V, S, E, DT, T BM xuất băng DNA đặc hiệu sáng rõ 58 tƣơng ứng với gen Gyr2, kích thƣớc ~ 700 bp (7/7 chủng nghiên cứu, tỉ lệ 100 %) Hơn nữa, kết khuếch đại băng DNA đặc trƣng cho vi khuẩn E coli với kích thƣớc ~ 622bp S Aureus với kích thƣớc ~ 464bp Kết multiplex PCR trộn DNA loại vi khuẩn cho băng DNA đặc hiệu tƣơng ứng với gen XRE, GroEL GyrB, không quan sát thấy sản phẩm không đặc hiệu khác nhƣ primer-dimer, cross-dimer Điều cho phép phát nhanh chóng, đồng thời nhiều loại vi khuẩn lúc mang lại kết xác cao Với kết mong đợi diện protein tinh thể chủng phân lập BM  Xác định có mặt protein tinh thể độc Các khuẩn lạc môi trƣờng T3 đƣợc kiểm tra khả sinh nội bào tử qua dung dịch Coomassie Brilliant Blue quan sát dƣới kính hiển vi Kết bào tử tinh thể chủng phân lập BM đƣợc thể Hình 4.9 Mơ tả tinh thể bào tử Chủng phân lập giả định “BM” cho thấy đặc điểm tinh thể bào tử giống nhƣ đặc điểm chủng Bt tiêu chuẩn “4T1”, bao gồm: - Tinh thể có hình trịn, hình thoi, hình lệch tâm nhiều hình dạng khác - Tế bào có hình trụ hồn tồn nhuộm màu - Bào tử hình trứng hình trụ, đầu có màu, đầu cịn lại khơng bắt màu, dù bên hay bên 59 Chủng chuẩn “4T1” Chủng phân lập giả đị nh “BM” Hình 4.9 Bào tử tinh thể B thuringiensis Kết luận: Kết hình 4.9 cho thấy chủng tiêu chuẩn “4T1” chủng phân lập “BM” có diện protein tinh thể dạng hình trám, hình thoi với nhiều kích thƣớc khác Từ kết hợp tất kết thu đƣợc đặc điểm hình thái, sinh hóa, PCR với mồi đặc hiệu cho lồi nhuộm protein tinh thể độc ta khẳng định chắn chủng phân lập BM Bacillus thuringiensis 4.6 Tính tốn tổng số vi khuẩn B thuringiensis chế phẩm Tổng số N vi khuẩn B thuringiensis đƣợc nhận dạng/khẳng định có mẫu thử đƣợc tính theo cơng thức: Chúng tơi tính số khuẩn lạc dựa tỉ lệ 1:49, 1:59, 1:69 với nồng độ pha loãng tỉ lệ 10-4 10-5, kết đƣợc làm tròn đến số nguyên gần Kết đƣợc thể bảng 4.6 60 Bảng 4.6 Tổng số vi khuẩn B thuringiensis mẫu thử Cơng thức thí nghiệm 1:49 10 10 1:59 1:69 -5 10 10 -4 -4 -5 10 10 -4 -5 Đĩa Đĩa Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa (ml) 95 103 0,01 73 79 0,01 61 72 0,01 57 55 0,01 35 42 0,01 19 23 0,01 N(CFU/g) 1.60x10-8 1.11x10-8 0.54x10-8 1.08x10-8 Trung bình Kết bảng 4.6 cho thấy số lƣợng vi khuẩn trung bình 1g chế phẩm “BITADIN WP” 1.08 x 10 CFU/g cao kết in bao bì 1x 10 Theo TCVN 7304-1: 2003, số lƣợng vi khuẩn chế phẩm vi sinh vật dạng bột khơng nhỏ 1x 10 CFU/g, kết luận số lƣợng vi khuẩn chế phẩm sinh học “BITADIN WP” đạt tiêu chuẩn 61 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận - Với phƣơng pháp phân lập vi khuẩn Bt từ chế phẩm sinh học "BITADIN WP" đề nghị sử dụng phƣơng pháp sau: hòa tan mẫu với NaCl 0,85% theo tỷ lệ 1:69, xử lý mẫu 80°C thời gian phút, sau ni cấy 10 µl dung dịch mẫu nồng độ pha loãng 10 -5 mơi trƣờng LB - Kết phân tích đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào đặc điểm sinh hóa chủng phân lập BM thể khuẩn lạc đơn lẻ, gram dƣơng, phản ứng dƣơng tính với thử nghiệm lethicinase, sucrose catalase Bên cạnh chủng phân lập BM hình thành bào tử đặc điểm chi Bacillus, đặc biệt Bacillus thuringiensis - Phân tích PCR multiplex PCR cho phép phát nhanh chóng vi khuẩn Bt - Sự diện protein tinh thể chủng phân lập BM phƣơng pháp nhuộm protein tinh thể, khẳng định chủng phân lập BM B Thuringiensis 5.2 Kiến nghị - Bổ sung thêm xét nghiệm sinh hóa khác: kiểm tra Esculin, thử nghiệm lên men salicin 62 TÀI LI U THAM KHẢO A Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Hiền (2012) Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy, trang 11-20 Ngơ Đình Bính cộng sự, 35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam, Hội nghị Khoa Học kỷ niệm 35 năm thành lập Việt Khoa học Công nghệ Việt Nam 1975 - 2010, Nhà xuất Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 2010, 288-300 Ngơ Đình Bính, Nguyễn Quang Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu 2001 2002, Viện Công nghệ Sinh học, trang 296 – 302 Ngơ Đình Bính (2005) Đặc điểm chủng Bacillus thuringiensis Bộ sƣu tập Bacillus thuringiensis Việt Nam, Kỷ yếu Hội nghị Vành đai Thái Bình Dƣơng lần thứ Cơng nghệ Sinh học Bacillus thuringiensis Tác động Mơi trƣờng Phùng Thị Bích Thủy, Khúc Thị Rềnh Hoa, Phan Thu Chung, Tạ Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Liêm (2012), “Ứng dụng kỹ thuật real time PCR đa mồi chẩn đoán nguyên gây nhiễm trùng huyết trẻ em Bệnh viện Nhi trung ƣơng”, Tạp chí y học Việt Nam, tháng – số đặc biệt 2012 tập 397, tr 336-341 Trần Việt Hòa (2020) Quy trình sản xuất chế phẩm Bt (Bacillus thuringiensis) dùng kiểm soát sâu hại thuộc Lepidoptera rau Trƣơng Phúc Hƣng (2010) Nghiên cứu nhân xác định trình tự gen cry1Ab, cry1Ac mã hóa protein tinh thể diệt trùng có vảy từ chủng Bacillus thuringiensis phân lập từ số mẫu đất tỉnh Thái Nguyên B Tài liệu tiếng anh Aronson A, Beckman W, Dunn P (1986) Bacillus thuringiensis and related insect pathogens Microbiol Rev 50: pp 1–24 63 Bechtel, D B., & Bulla, L A., Jr (1982) Ultrastructural analysis of membrane development during Bacillus thuringiensis sporulation Journal of ultrastructure research, 79(2), 121–132 Bulla, L A., Jr, Bechtel, D B., Kramer, K J., Shethna, Y I., Aronson, A I., & Fitz-James, P C (1980) Ultrastructure, physiology, and biochemistry of Bacillus thuringiensis Critical reviews in microbiology, 8(2), 147–204 Bravo A, Gill SS, Soberón M Bacillus thuringiensis mechanisms and use In: Gilbert LI, Iatrou K, Gill SS, editors Comprehensive Molecluar Insect Science Elsevier BV; 2005 pp 175–206 Böhm M.-E., Huptas C., Krey VM, Scherer S (2015) Sự chuyển gen ạt theo chiều ngang, di truyền theo chiều dọc nghiêm ngặt nhân đơi cổ xƣa định hình khác biệt tiến hóa Bacillus cereus enterotoxin operon hbl, cytK nhe BMC Evol Biol 15: 246 10.1186 / s12862-015-0529-4 Crickmore N, Zeigler DR, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Bravo A, Dean DH (2010) Bacillus thuringiensis toxin nomenclature Chelliah R, Wei S, Oh D, (2019) “Whole genome sequence of Bacillus thuringiensis ATCC 10792 and improved discrimination of Bacillus huringiensis from Bacillus cereus group based on novel biomarkers”, Microbial Pathogenesis pp 284-297 Devine GJ, Furlong MJ (2007) Insecticide use: contexts and ecological consequences, 24: pp 281–306 Eugene W Nester, Linda S Thomashow, Matthew Metz Milton Gordon (2002) 100 Years of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment Washington (DC): American Society for Microbiology 10 Estruch JJ, Warren GW, Mullins MA, Nye GJ, Craig JA, Koziel MG A novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects, pp 5389–5394 11 Federici BA (1999) Bacillus thuringiensis In: Bellows TS, Gordh G, Fisher TW (eds) Handbook of biological control Academic Press, San Diego, pp 517–548 64 12 Ibrahim, M A., Griko, N., Junker, M., & Bulla, L A (2010) Bacillus thuringiensis: a genomics and proteomics perspective Bioengineered bugs, 1(1), 31–50 13 Ishiwata S (1901) On a new type of severe flacherie (sotto disease) (original in Japanese) Dainihon Sansi Kaiho 114: pp 1–5 14 Isakova NP (1958) A new variety of bacterium of the “cereus” type pathogenic for insects Dokl Akad Sci Nauk Selsk 3: pp 26–27 15 ISAAA (2014) Global status of commercialized biotech/GM crops in 2014 ISAAA Brief No 49 ISAAA: Ithaca, NY 16 ISAAA (2018) Global status of commercialized biotech/GM crops in 2018 ISAAA Brief No 54 ISAAA: Ithaca, NY 17 Juárez-Pérez V.M Ferrandis M.D Frutos R (1997) PCR-based approach for detection of novel Bacillus thuringiensis cry genes Appl Environ Microbiol.63, pp 2997–3002 18 Liliana Pardo-López, Mario Soberón, Alejandra Bravo, Thuốc diệt trùng ba miền Bacillus thuringiensis Độc tố Cry: phương thức hoạt động, tính kháng côn trùng hậu việc bảo vệ trồng, Đánh giá vi sinh FEMS, Tập 37, Số 1, Tháng năm 2013, Trang 3–22 19 Lacey, L.A., Frutos, R., Kaya, H.K & Vail, P (2001), Insect pathogens as biological control agents: Do they have a future? Biological Control, 21, pp 230-248 20 Li P, Zhang D, Li H, Pang J, Guo H and Qiu J (2020) Establishment and Application of Multiplex PCR for Simultaneously Detecting Escherichia coli, Salmonella, Klebsiella pneumoniae, and Staphylococcus aureus in Minks Front Vet Sci 7:588173 doi: 10.3389/fvets.2020.588173 21 Mohammed, A J.; Hamodi, S J.; Alkilani, F M H., (2018) Effect of adding different levels of Annatto seed powder (Bixa orellana) in laying chicken diets on oxidation indicators Biochem Cell Arch., 18 (2): 16211624 22 Mukhija B & Khanna V (2018) Isolation, characterization and crystal morphology study of Bacillus thuringiensis isolates from soils of Punjab Journal of Pure and Applied Microbiology pp 189-193 65 23 Navon, A (2000), Bacillus thuringiensis insecticides in crop protectionreality and prospects, Crop Protection, 19, pp669-676 24 National standard TCVN 6404: 2016 (ISO 7218: 2007 with amendment 1: 2013) Microbiology of food and animal feeding stuffs - General requirements and guidance for microbiological examinations 25 Oscar G Gómez-Duarte, Jing Bai, Elizabeth Newell (2009) Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., Yersinia enterocolitica, Vibrio cholerae, and Campylobacter spp enteropathogens by 3-reaction multiplex polymerase chain reaction, pp 1-9 26 Ogawa H, Fujikura D, Ohnuma M, Ohnishi N, Hang'ombe BM, Mimuro H, et al (2015) A Novel Multiplex PCR Discriminates Bacillus anthracis and Its Genetically Related Strains from Other Bacillus cereus Group Species PLoS ONE 10(3): e0122004 27 P Markoulatos, N Siafakas and M Moncany (2002), "Multiplex Polymerase Chain Reaction: A Practical Approach", Journal of Clinical Laboratory Analysis, (16), pp.47-51 28 Peng DH, Pang CY, Wu H., Huang Q., Zheng JS, Sun M (2015) Sự biểu kết tinh Cry 65Aa yêu cầu hai C-termini, tiết lộ chiến lƣợc tiến hóa protein Bacillus thuringiensis Cry Khoa học Bản 5: 8291 10.1038 / srep08291 29 Palma, L., Muñoz, D., Berry, C., Murillo, J., & Caballero, P (2014) Độc tố Bacillus thuringiensis: Tổng quan hoạt động diệt khuẩn chúng Độc tố, 6, 3296 - 3325 30 Riojas MA, Kiss K., McKee ML, Hazbón MH (2015) Multiplex PCR để xác định mức độ loài Bacillus anthracis phát pXO1, pXO2 Plasmid có liên quan Sức khỏe Sec 13 122–129 10.1089 31 Roh, J., Jae, Y., Ming, S., Byung, R Yeon, H (2007) Bacillus thuringiensis công cụ cụ thể, an tồn hiệu để kiểm sốt dịch hại trùng Tạp chí Vi sinh Cơng nghệ sinh học.17 (4) 547-559 32 Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D R., & Dean, D H (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins Microbiology and Molecular Biology Reviews 62(3), pp775-806 66 33 Shantanu Kumar and V Udayasuriyan (2004) Cloning of cry2Aa and cry2Ab genes from new isolates of Bacillus thuringiensis and their expression in recombinant Bacillus thuringiensis and Escherichia coli strains World Journal of Microbiology and Biotechnology, pp 11–17 34 Talalaev EV (1956) Septicemia of the caterpillars of the Siberian silkworm Mikrobiologiya 25: pp 99 35 Travers RS, Martin PA, Reichelderfer CF (1987) Selective Process for Efficient Isolation of Soil Bacillus spp Appl Environ Microbiol 53: 1263-6 36 University of California San Diego Aroian Lab Bacillus Thuringiensis: History of Bt 37 Vouk V, Klas Z (1931) Conditions influencing the growth of the insecticidal fungus Metarrhizium anisopliae (Metsch.) Sor Int Corn Borer Invest Sci Rept 4: pp 24–45 38 Warren G (1997) Vegetative insecticidal proteins: novel proteins for control of corn pests In: Carozzi N, Koziel M, editors Advances in Insect Control: The Role of Transgenic Plants Taylor & Francis Ltd, pp 109 39 Wei, S., Chelliah, R., Park, B J., Kim, S H., Forghani, F., Cho, M S., Park, D S., Jin, Y G., & Oh, D H (2019) Differentiation of Bacillus thuringiensis From Bacilluscereus Group Using a Unique Marker Based on Real-Time PCR Frontiers in microbiology, 10, 883 40 Riojas MA, Kiss K., McKee ML, Hazbón MH (2015) Multiplex PCR để xác định mức độ loài Bacillus anthracis phát pXO1, pXO2 Plasmid có liên quan Sức khỏe Sec 13 122–129 10.1089 41 Roh, J., Jae, Y., Ming, S., Byung, R Yeon, H (2007) Bacillus thuringiensis cơng cụ cụ thể, an tồn hiệu để kiểm sốt dịch hại trùng Tạp chí Vi sinh Công nghệ sinh học.17 (4) 547-559 67