Phân lập tuyển chọn vi khuẩn để sản xuất chế phẩm sinh học cải tạo đất trồng rau bị thoái hóa tại huyện lâm thao tỉnh phú thọ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨNĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU BỊ THOÁI HOÁTẠI HUYỆN LÂM THAO TỈNH PHÚ THỌ Hà Nội – 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA TÀI NGUYÊN VÀ MÔI TRƯỜNG - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU BỊ THOÁI HOÁ TẠI HUYỆN LÂM THAO TỈNH PHÚ THỌ Người thực : Trần Văn Tuấn Mã sinh viên : 614137 Lớp : K61KHMTB Khóa : 61 Giáo viên hướng dẫn : TS Vũ Thị Hoàn Địa điểm thực tập : Học viện Nông Nghiệp Việt Nam Hà Nội – 2021 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập- Tự do- Hạnh phúc Ngày tháng năm 2021 BẢN GIẢI TRÌNH SỬA CHỮA LUẬN VĂN Kính gửi: - Ban Chủ nhiệm khoa Tài nguyên Môi trường - Bộ môn: Vi Sinh Vật Tên là: Trần Văn Tuấn; Mã SV: 614137 Sinh viên ngành: Khoa học môi trường Lớp: K61KHMTB Khóa: 61 Đã bảo vệ khóa luận tốt nghiệp Tiểu ban ngày 22 tháng năm 2021 Tên đề tài: Phân lập tuyển chọn vi sinh vật để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cải tạo đất trồng rau bị thoái hoá huyện Lâm Thao, tỉnh Phú Thọ Người hướng dẫn: TS Vũ Thị Hoàn Tiểu ban chấm luận tốt nghiệp yêu cầu tơi chỉnh sửa trước nộp khóa luận tốt nghiệp nội dung sau: STT Nội dung yêu cầu chỉnh sửa Nội dung giải trình (*) Tại trang Sửa lại lỗi tả Đã sửa lại lỗi tả 25, 27, 33, 35, 36,… Format khoá luận chưa Đã sửa lại format khoá yêu cầu khoa luận khoa Ghi chú: Sinh viên cần nêu rõ nội dung bảo lưu nội dung chỉnh sửa cột tích dấu (*) Tơi chỉnh sửa hồn thiện khóa luận tốt nghiệp theo u cầu Tiểu ban Vậy tơi kính mong thầy/cơ hướng dẫn xác nhận cho tơi để tơi có sở nộp khóa luận tốt nghiệp theo quy định Học viện Tôi xin trân trọng cảm ơn! NGƯỜI HƯỚNG DẪN SINH VIÊN Vũ Thị Hoàn Trần Văn Tuấn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu kết nghiên cứu thân Các số liệu nghiên cứu đề tài trung thực, chưa sử dụng đề tài nghiên cứu khác, chưa có cơng bố tài liệu Hà Nội, ngày … tháng … năm Sinh viên thực Trần Văn Tuấn i LỜI CẢM ƠN Đề tài thực phịng thí nghiệm mơn Vi sinh vật khoa Môi Trường Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, hướng dẫn tận tình thầy giáo bạn với cố gắng thân, tơi hồn thành khóa luận tốt nghiệp Lời đầu tiên, tơi xin gửi đến TS Vũ Thị Hồn, người truyền đạt cho tơi kiến thức vô quan trọng, quý báu theo sát, tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ tơi hồn thành đề tài tốt nghiệp lời cảm ơn sâu sắc Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô Học viện Nông Nghiệp Việt Nam, đặc biệt thầy cô thuộc môn Vi sinh vật - khoa Môi Trường tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập làm khóa luận Do thời gian kinh nghiệm cịn hạn chế nên khóa luận tơi cịn thiếu sót, kính mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn để khóa luận tơi hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng …năm Sinh viên thực Trần Văn Tuấn ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan rau 1.1.1 Khái niệm giá trị rau 1.1.2 Tỉnh hình sản xuất rau 1.2.1 Tình trạng thối hóa đất giới 1.2.2.Tình trạng thối hóa đất Việt Nam 10 1.3 Vi sinh vật cải tạo đất ứng dụng chế phẩm sinh học cải tạo đất 16 1.3.1.Vi sinh vật cải tạo đất 16 1.3.2 Các nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học cải tạođất bị thoái hoá 20 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2 Phạm vi nghiên cứu 24 2.2.1 Không gian 24 2.2.2 Thời gian 24 2.3 Nội dung nghiên cứu 24 2.3.1 Phân lập vi khuẩn hữu ích phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học cải tạo đất trồng rau 24 iii 2.3.2 Đánh giá số đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phânlập 24 2.3.3 Tuyển chọn vi khuẩn hữu ích phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học cải tạo đất trồng rau quy mơ phịng thí nghiệm 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 25 2.4.2.Phương pháp phân tích, phân lập, tuyển chọn vi sinh vật 25 2.4.3 Phương pháp sản xuất đánh giá chất lượng chế phẩm 30 CHƯƠNG 3: KẾTQUẢNGHIÊNCỨU VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Phân lập vi khuẩn hữu ích phục vụ sản xuất chế phẩm sinh học cải tạo đất trồng rau 32 3.1.1 Kết xác định mật độ phân lập vi khuẩn có khả cố định nitơ phân tử 32 3.1.2 Kết xác định mật độ phân lập vi khuẩn phân giải lân vơ khó tan 34 3.1.3 Kết phân lập vi khuẩnnội sinh sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật (IAA) 37 3.2 Đánh giá đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập 39 3.3 Tuyển chọn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm 48 3.4 Thửnghiệm sản xuất chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41 1.Kết luận 41 Kiến nghị 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 59 iv DANH MỤC BẢNG Bảng Diện tích trồng rau chuyên canh địa bàn tính Phú Thọ 15 Bảng Mật độ vi khuẩn có khả cố định N2 đất 32 Bảng 3: Một số đặc điểm chủng vi khuẩn có khả cố định N 33 Bảng Mật độ vi khuẩn có khả phân giải lân vơ khó tan 34 Bảng 5: Đặc điểm chủng vi khuẩn phân giải lân vô khó tan 36 Bảng 6: Một số đặc điểm chủng vi khuẩn nội sinh phân lập môi trường NA 38 Bảng 7: Khả cố định nitơ phân tử, phân giải lân sinh IAA chủng vi khuẩn 40 Bảng 8: Khả sinh Enzym ngoại bào của chủng vi khuẩn 43 Bảng 9: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn 44 Bảng 10: Ảnh hưởng pH môi trường đến sinh trưởng, phát triển chủng vi khuẩn 45 Bảng 11: Khả kháng kháng sinh chủng vi khuẩn 46 Bảng 12: Kết lựa chọn chủng để sản xuất chế phẩm 49 Bảng 13: Đánh giá chất lượng chế phẩm 50 v DANH MỤC HÌNH Hình Diện tích sản lượng rau giai đoạn 2015-2020 Việt Nam Hình 2: Vi khuẩn phân giải lân vơ khó tan từ mẫu đất trồng dưa chuột huyện Lâm Thao 37 Hình 3: Khả sinh enzym ngoại bào chủng VK2 43 Hình 4: Khả sinh enzym ngoại bào chủng P4 43 Hình 5: Kết đánh giá an toàn sinh học cà rốt 47 Hình 6: Kết đánh giá an tồn sinh học hành tây 47 Hình 7: Khả đối kháng chủng A1, P4 VK6 48 vi PHỤ LỤC 02: ĐỀ CƯƠNG KHỐ LUẬN HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA MÔI TRƯỜNG - - ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÊN ĐỀ TÀI: “PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU BỊ THỐI HĨA TẠI HUYỆN LÂM THAO TỈNH PHÚ THỌ” Người thực : Trần Văn Tuấn Mã sinh viên : 614137 Lớp : K61KHMTB Khóa : 61 Giảng viên hướng dẫn : TS Vũ Thị Hoàn Địa điểm thực tập : Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Hà Nội - 2021 ĐỀ CƯƠNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Tel: 0914405066 Trần Văn Tuấn Mail: trantuan30061998@gmail.com Chuyên ngành: Khoa Học Môi Trường Lớp: K61KHMTB Khoá:61 Giảng viên hướng dẫn: TS Vũ Thị Hoàn Tel: Mail: Tên đề tài “PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VI KHUẨN ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM SINH HỌC CẢI TẠO ĐẤT TRỒNG RAU BỊ THOÁI HÓA TẠI HUYỆN LÂM THAO TỈNH PHÚ THỌ” Loại đề tài: Đề tài điều tra  Đề tài khoa học thực nghiệm Địa điểm thực hiện: Huyện Lâm Thao tỉnh Phú Thọ Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Người thực (Ký ghi rõ họ tên) XÁC NHẬN CỦA CƠ SỞ THỰC TẬP PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết Rau xanh nguồn thực phẩm thiếu đời sống ngày người Rau xanh khơng có ý nghĩa kinh tế cao mà cịn có giá trị mặt dinh dưỡng, cung cấp chất vitamin, chất khoáng, chất vi lượng khơng thể thay chất oxi hóa, góp phần cân dinh dưỡng cho người Ngày nay, mức sống người ngày cao nhu cầu số lượng chất lượng rau gia tăng Chính vậy, diện tích vùng trồng rau ngày mở rộng, kết hợp với việc áp dụng kĩ thuật tiên tiến, sử dụng phân bón thuốc bảo vệ thực vật Từ hình thành vùng chuyên canh rau lớn, thường bố trí vùng có địa hình vàn cao, cao, có vị trí thuận lợi điều kiện canh tác, tiêu thụ nông sản phẩm Đặc biệt, vùng đất trồng rau thường bố trí ven khu vực đô thị với mức độ thâm canh cao, điều tiềm ẩn nhiều nguy thối hố đất kiểu ô nhiễm Theo nghiên cứu Cục Trồng trọt, Bộ NN&PTNT (2007), phần lớn diện tích đất trồng rau an toàn địa phương chuyển đổi từ đất trồng lúa, trồng hoa màu có lịch sử dùng nhiều thuốc BVTV, phân bón hố học nên khó tránh khỏi tác động ngược từ việc tích luỹ chất độc môi trường đất lên chất lượng rau Khảo sát Cục Trồng trọt cho thấy, có 108/478 vùng trồng rau an toàn Hà Nội với diện tích 932 (chiếm 35,3% diện tich canh tác) không đủ điều kiện đất, nước để sản xuất an tồn, 77 vùng có tiêu kim loại nặng nước tưới vượt ngưỡng cho phép, 16 vùng tưới nước ngầm 61 vùng tưới nước mặt; có 36 vùng có tiêu hàm lượng kim loại nặng đất vượt ngưỡng cho phép (chủ yếu đồng, cadmium kẽm) Bên cạnh vấn đề ô nhiễm kim loại nặng, số nghiên cứu chi vấn đề ô nhiễm Nitrat rau số vùng gây ảnh hưởng không tốt đến sức khoẻ người Kết điều tra tác giả Đinh Văn Hùng cs (2005) cho thấy nông dân vùng ngoại thành Hà Nội (khu vực Gia Lâm, Thanh Trì, Đơng Anh) sử dụng lượng đạm lớn cân phân lân kali để bón cho rau, đậu Lượng dùng phổ biến đạm mức 500 kgN/ha su hào, 550 kgN/ha với bắp cải 640 kgN/ha với cà chua Lượng phân đạm lớn bón cho trồng kết hợp với việc thu hải không đảm bảo thời gian cách ly cần thiết khiến cho rau xanh tích luỹ lượng Nitrat cao khơng tốt cho sức khoẻ người Kết nghiên cứu Phan Quốc Hưng (2017) vấn đề tương tự, vùng trồng rau chuyên canh Hà Nội, người nông dân thường sử dụng lượng phân đạm gấp từ đến lần so với quy trình bón phân đạm cho rau an toàn, lượng phân lân kali sử dụng ít, chí không sử dụng Phú Thọ tỉnh thuộc vùng trung du Bắc bộ; Theo số liệu niên giám thống kê q năm 2020 tồn tính có 5844,2 trồng rau loại, suất đạt 157,67 tạ/ha, sản lượng 92147,6 tăng 5,6% so với kỳ năm 2019 Trong hình thành phát triển số vùng chuyên canh rau tập trung (Tân Đức - Việt Trì; Sai Nga - Cẩm Khê; Tứ Xã, Bản Nguyên - Lâm Thao; Trường Thịnh - TX Phú Thọ; Tu Vũ - Thanh Thủy, ) Tuy nhiên, không tuân thủ hướng dẫn canh tác an toàn tuân thủ không đầy đủ dẫn đến đất trồng rau vùng có xu hướng thối hố theo nhiều hướng khác nhau, phổ biến suy giảm độ phì nhiêu, nhiễm đất Do việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm sinh học có khả cải tạo đất thối hóa q trình thâm canh (chủ yếu thối hố độ phì nhiêu) giải pháp sinh học có hiệu phịng, chống thối hố đất hướng phù hợp điều kiện Xuất phát từ thực tế thực đề tài: “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật để sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ cải tạo đất trồng rau bị thối hóa huyện Lâm Thao, tỉnh Phú Thọ” Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn từ 3-4 chủng vi khuẩn có đặc tính sinh học tốt (cố định đạm tự do, phân giải lân; sinh tổng hợp IAA tốt, an tồn với mơi trường phục vụ sản xuất chế phẩm cải tạo đất trồng rau bị thối hóa thâm canh (chủ yếu thối hóa độ phì) PHẦN 2: NỘI DUNG THỰC HIỆN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan rau 1.1.1 Khái niệm giá trị rau 1.1.2 Tỉnh hình sản xuất rau 1.2 Tổng quan thối hóa đất 1.2.1 Tình trạng thối hóa đất giới 1.2.2 Tình trạng thối hóa đất Việt Nam 1.3 Vi sinh vật cải tạo đất ứng dụng chế phẩm vi sinh vật cải tạo đất 1.3.1 Vai trò hệ vi sinh vật đất 1.3.2 Một số nhóm vi sinh vật có khả cải tạo đất 1.3.3 Các nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi sinh vật cải tạo đất CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi khuẩn có khả năngcố định đạm tự do, có khả phân giải lân; sinh tổng hợp IAA tốt, an tồn với mơi trường phục vụ sản xuất chế phẩm cải tạo đất trồng rau bị thối hóa thâm canh (chủ yếu thối hóa độ phì) 2.2 Phạm vi nghiên cứu 2.2.1 Khơng gian: Bộ môn VSV, Khoa Môi Trường, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 2.2.2 Thời gian: Từ tháng 3/2021 đến tháng 7/2021 2.3 Nội dung nghiên cứu 2.3.1 Phân lập vi khuẩn Phân lập vi khuẩn hữu ích phục vụ sản xuất cải tạo đất trồng rau 2.3.2 Đánh giá đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập − Khả cố định nitơ phân tử − Khả phân giải lân − Khả sinh IAA − Hoạt tính sinh enzym ngoại bào: Xenlulaza, proteaza, amylaza − Ảnh hưởng nhiệt độ muôi cấy đến khả sinh trưởng phát triển − Khả thích ứng mơi trường có pH khác − Khả kháng kháng sinh − Khả an toàn với thực vật 2.3.3 Tuyển chọn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm - Tuyển chọn chủng vi khuẩn sở đánh giá phần 2.3.2 - Đánh giá khả đối kháng chủng vi khuẩn lựa chọn - Sản xuất chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm đánh giá chất lượng chế phẩm 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phương pháp lấy mẫu a Phương pháp lấy mẫu đất: Mẫu đất thu thập theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7538 - : 2005 Chất lượng đất, lấy mẫu – Phần 2: Hướng dẫn kỹ thuật lấy mẫu Mẫu cần lấy cho giữ nguyên trạng thái ban đầu Thiết bị lấy mẫu phải khử trùng mẫu lấy tầng canh tác(ở độ sâu từ 0-2cm) Số lượng mẫu dự kiến từ 10-20 mẫu a Phương pháp lấy mẫu cây: Lấy mẫu rau theo quy định TCVN 9016:2011 Rau tươi – Phương pháp lấy mẫu ruộng sản xuất ngô theo Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 8551:2010 trồng – phương pháp lấy mẫu chuẩn bị mẫu Số lượng mẫu dự kiến 10-20 mẫu 2.4.2 Phương pháp phân lập, tuyển chọn vi sinh vật a Phương pháp phân lập Mẫu phân lập vi sinh vật bao gồm mẫu đất vùng rễ mẫu rễ thực vật Mẫu thu đựng túi riêng biệt khử trùng Mẫu thu tiến hành làm thí nghiệm bảo quản điều kiện nhiệt độ thấp thời gian không tuần Phân lập vi sinh vật theo phương pháp pha lỗng Koch ni cấy mơi trường chun tính bán rắn: Cân 5g mẫu cho vào bình tam giác chứa 45ml nước vơ trùng, lắc 150 vịng/phút 30 phút Dịch pha loãng ria cấy bề mặt mơi trường chun tính bán rắn cho chủng VSV (với mẫu thực vật xử lý trước phân lập) Các chủng phân lập làm mơi trường chun tính tương ứng theo phương pháp cấy ria pha, giữ giống môi trường thạch nghiêng 4oC Để xác định sơ chủng vi sinh vật cách nhuộm tế bào quan sát hình thái VSV qua kính hiển vi b Phương pháp tuyển chọn giống VSV có khả cố định N, phân giải lân; sinh tổng hợp IAA thông qua đánh giá đặc tính sinh học cách ni cấy trực tiếp môi trường chuyên định điều kiện khác Xác định hoạt tính sinh enzyme: đánh giá theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch (William, 1983) Ni dịch chiết: Lấy vịng que cấy VSV cho vào 9ml dung dịch môi trường chuyên tính khử trùng chờ nguội đưa lên đưa lên máy lắc 150 vòng/phút Sau 48 dịch ni cấy đánh giá hoạt tính enzym Chuẩn bị mơi trường: Enzym Xenlulozo Hóa chất CMC Thạch Tỷ lệ 0,2% 1,5% Amylaza Proteaza Tinh bột Thạch 0,2% 1,5% Gelatin 0,2% Thạch 1,5% Đường kính = D – d (mm) Môi trường khử trùng 121oC, áp suất atm 20 phút, đổ đĩa petri với lượng môi trường dày 2mm để nguội Dùng khoan khử trùng đục lỗ đĩa thạch với đường kính mm Nhỏ dịch: Hút 0,2ml dịch thể nhỏ vào lỗ thạch đục Đặt đĩa petri tủ lạnh để enzym khuếch tán đĩa thạch, sau đặt vào tủ ni 28oC 48 đem nhuộm màu dung dịch lugol, sau xuất vòng phân giải đem đo đường kính khả phân giải tính hiệu đường kính vịng phân giải đường kính lỗ thạch c Xác định khả cố định nitơ vi khuẩn Xác định hàm lượng N-NH4+ vi khuẩn tạo phương pháp so màu, thuốc thử Phenol-nitroprusside Đây phương pháp xác định hàm lượng NH4+ phương pháp so màu Idophenol quang phổ kế (Spectrophotometer) bước sóng 636 nm Khả năng cố định đạm dòng vi khuẩn được thể hiện qua mức hấp thụ quang phổ mẫu đo Những mẫu có màu xanh đậm mức hấp thụ quang phổ lớn khả năng tổng hợp NH4+ cao d Xác định khả phân giải lân vi sinh vật Nuôi dịch chiết: Nuôi cấy VSV 9ml dung dịch mơi trường chun tính với vòng que cấy chứa VSV, đưa lên máy lắc 150 vịng/phút Sau 48 giờ, dịch ni cấy đánh giá khả phân giải Môi trường đem hấp 1210C, áp suất atm vòng 20 phút, đổ đĩa petri với lượng môi trường dày 2mm để nguội Cấy chấm điểm dịch nuôi VSV môi trường Pikovaskya đặc Theo dõi khả hình thành phịng phân giải chủng VSV thời gian 72h VSV có hoạt tính phân giải lân có vịng sáng halo tạo thành xung quanh khuẩn lạc, vùng chưa phân giải có màu đục Khả phân giải lân tính hiệu đường kính vịng sáng halo đường kính khuẩn lạc VSV e Xác định khả sinh tổng hợp axit 3-indol- axetic (IAA) vi khuẩn: theo TCVN 10784:2015 Hàm lượng IAA tạo dịch lên men vi khuẩn xác định phương pháp so màu sử dụng thuốc thử Salkowski (sau pha xong cần bảo quản bình tối); Vi khuẩn nuôi môi trường LB bổ sung 0.1% tryptophan lắc với tốc độ 150 vòng/ phút nhiệt độ 300C 48h Sau thu dịch ni cấy đem ly tâm với tốc độ 6000 vịng/ phút 10 phút Hút ml dịch thu sau ly tâm cho vào ống nghiệm chứa sẵn ml thuốc thử Salkowski, đối chứng ml môi trường dịch thể ly tâm không nuôi VSV thêm vào ml thuốc thử Lắc đều, để tối 20 phút So màu máy đo quang phổ bước sóng 530nm Chỉ số OD đối chiếu với đồ thị chuẩn để tính lượng IAA dịch ni cấy Hàm lượng IAA tính theo đơn vị µg IAA/ml f Phương pháp xây dựng đồ thị đường chuẩn Xây dựng đường chuẩn IAA: gồm 10 bình định mức đánh số theo thứ tự từ đến 10, Lấy ml dung dịch chuẩn IAA có nồng độ 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 μg/ml cho vào bình định mức Thêm thuốc thử Salkowski chuẩn bị sẵn đến vạch định mức, trộn đều, để tối 20 phút So màu máy đo quang phổ bước sóng 530nm Chỉ số OD dùng để xây dựng đường chuẩn Phương trình đường chuẩn có dạng: y = ax + b (với R2 lớn 0,95), x nồng độ mẫu (µg/ml), y độ hấp thụ quang (OD 530nm) Hàm lượng IAA có mẫu tính theo cơng thức: x = (y-b)/a g Phương pháp xác định khả đối kháng vi khuẩn: Theo phương pháp Sumathi and Reetha (2012) Vi khuẩn được hoạt hóa môi trường phân lập, ủ 37°C 24 để đạt mật độ 108 CFU/ml Tiến hành nhỏ 50 μL dịch vi khuẩn đối kháng lên đĩa môi trường KB dùng que trang trải Sau 15 phút tiến hành đục lỗ đường kính mm trên đĩa thạch nhỏ vào lỗ 20 μL dịch vi khuẩn thử nghiệm đem ủ 37°C 24 Khả năng đối kháng được đo đường kính vịng vơ khuẩn (vòng tròn suốt bao quanh lỗ khoan chứa dịch vi sinh vật đối kháng) Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) = D-d, đó: D đường kính vịng vơ khuẩn (mm); d đường kính lỗ thạch (mm) - Đánh giá mức độ an toàn sinh học chủng giống vi sinh vật tuyển chọn: Mẫu rau, củ, lấy từ khoẻ sau rửa ngâm dung dịch nước dịch NaClO 1% phút, rửa lại nước vô trùng; làm khô mẫu đặt đĩa petri; Dùng kim tiêm cấy trích chủng vi khuẩn lên mơ thực vật để nhiệt độ phòng; Theo dõi hình thành vết bệnh sau 24-48h so sánh với đối chứng khơng nhiễm (-), có nhiễm vi khuẩn gây bệnh (+) 2.4.3 Phương pháp sản xuất đánh giá chất lượng chế phẩm a Phương pháp sản xuất chế phẩm Dự kiến chế phẩm gồm chủng vi khuẩn tuyển chọn sản xuất theo quy trình môn Vi sinh vật Khoa Môi trường theo phương pháp hợp chủng, nhân sinh khối riêng rẽ chất mang trùng b Phương pháp đánh giá chất lượng chế phẩm Kiểm tra mật độ vi sinh vật hữu ích mật độ vi sinh vật tạp: phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch (Phương pháp pha loãng Koch) so với TCVN hành Mẫu được đồng hóa pha lỗng thập phân; 0,1 ml độ pha lỗng thích hợp được dàn trên đĩa thạch chứa môi trường chuyên tính cho đối tượng Số lượng tế bào được xác định cách đếm số khuẩn lạc phát triển trên đĩa có số lượng nằm khoảng 30 - 250 sau ủ 30°C 48 Tổng số vi khuẩn ml mẫu thử được tính theo công thức: 𝑁𝑁 = ∑𝐶𝐶/𝑉𝑉(𝑛𝑛1 + 0,1𝑛𝑛2)𝑑𝑑 Trong đó: N tổng số vi khuẩn sống có ml mẫu thử (CFU/ ml); ∑C tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất đĩa chọn; V thể tích cấy trên đĩa (ml); n1 số đĩa đếm độ pha loãng thứ được giữ lại; n2 số đĩa đếm nồng độ pha loãng thứ hai được giữ lại; d hệ số pha loãng nồng độ pha loãng thứ 2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu xử lý Microsoft Excel CHƯƠNG 3: DỰ KIẾN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập vi khuẩn hữu ích phục vụ sản xuất cải tạo đất trồng rau 3.2 Đánh giá đặc tính sinh học chủng vi khuẩn phân lập − Khả cố định nitơ phân tử − Khả phân giải lân − Khả sinh IAA − Hoạt tính sinh enzym ngoại bào: Xenlulaza, proteaza, amylaza − Ảnh hưởng nhiệt độ muôi cấy đến khả sinh trưởng phát triển − Khả thích ứng mơi trường có Ph khác − Khả kháng kháng sinh − khả an toàn với thực vật 3.3 Tuyển chọn vi khuẩn hữu ích để sản xuất chế phẩm quy mơ phịng thí nghiệm − Tuyển chọn chủng vi khuẩn sở đánh giá phần 3.2 − Đánh giá khả đối kháng chủng vi khuẩn lựa chọn − Sản xuất chế phẩm quy mô phịng thí nghiệm đánh giá chất lượng chế phẩm Phần 3: Kế hoạch nghiên cứu STT Nội dung Thời gian thực hiện Lập đề cương nghiên cứu 26/1/2021 – 22/2/2021 Báo cáo đề cương 23/2/2021 – 26/2/2021 Thẩm định tiến độ/ Seminar 10/5/2021 – 17/5/2021 Nộp khóa luận 6/2021 Bảo vệ Khóa luận 7/2021 TÀI LIỆU THAM KHẢO Cục Trồng trọt, Bộ Nông nghiệp PTNT (2007), Lập đồ rau an toàn Đinh Văn Hùng cs (2005), Đánh giá yếu tố xã hội ảnh hưởng đến vệ sinh an toàn thực phẩm râu sản xuất khu vực ngoại thành Hà Nội, Đề tài nhành thuộc đề tài độc lập cấp Nhà Nước, 2000-2004 Nguyễn Văn Bộ (2005) Bón phân hợp lý cân đối cho trồng- Nhà xuất Nông nghiệp Phan Quốc Hưng Đánh (2017), Đánh giá hàm lượng kim loại nặng đất trồng rau số tiêu chất lượng rau vùng đất phù sa ngồi đê sơng Hồng, huyện Thanh Trì, thành phố Hà Nội, tạp chí Nơng nghiệp phát triển nông thôn, số 18, trang 68-75 Niên giám thống kê tỉnh Phú Thọ quý 1-2020